用于减少有机材料中的病原体的方法和系统

相关申请的交叉引用

该申请要求于2019年12月17日提交的第62/949232号临时申请的优先权，该申请的全部公开内容出于所有目的在此通过引用并入本文。

背景

在农业生产和食物消耗的所有阶段都产生作为废品的有机生物质。例如，在食物供应链中，从最初的农业生产阶段到食物加工、食物分配、零售和最终消耗阶段都产生有机生物质。作为一个具体的实例，食物废料(即，来自食物供应链的最终没有被消耗的残余的有机材料)可以源自农场、杂货店、食品运输公司、食品加工公司、餐馆，甚至源自家庭。

考虑到杂货店作为在食物供应链中的一个阶段的有机生物质废物的示例性来源，当其不可销售，超过失效期，或对于展示而言不美观而被丢弃时，大量食物废料或废物在正常商业过程中产生。于是，从杂货店的各个部门收集食物废料，并将其处理到垃圾箱中。这种食物的丢弃意味着能量和/或营养价值的重大损失。考虑到在生产和制备的早期阶段以及在不完全消耗的后期阶段(例如在家庭或餐馆)类似地产生这样的废物，这种效率低下的损失规模被放大了。

除了以食物和其他农产品的废物为代表的能源效率低下之外，这样的有机生物质废品的处理也造成了其他问题和挑战。

有机生物质废品容易腐败。腐败是天然存在于有机生物质表面上，如蔬菜食物废料上的微生物的代谢活动，或来自动物加工的微生物交叉污染物的结果，所述微生物交叉污染物在基于动物的产品的表面上定殖或驻留。微生物菌群的快速扩张表现为组成生物质的细胞结构和生化营养素(如维生素、碳水化合物、脂类、蛋白质等)的快速、不受控制地分解成较简单的碳分子，最终产生酸、甲烷、硫化氢和二氧化碳的结果。生物质(如食物废料)的这种分解也产生有臭味的有机化合物，如挥发性脂肪酸、有臭味的多胺和硫化氢。在腐败过程中发生的代谢活动代表着热力学能量和营养价值的重大损失，以及不可挽回地损失生物质的大部分效用的阶段。

除了与腐败的生物质相关的难闻气味外，腐败副产品还可以充当害兽(例如啮齿动物)和昆虫的吸引物，它们可能是疾病的媒介。此外，交叉污染造成食源性病原体，如大肠杆菌、沙门氏菌和李斯特菌的潜在危险的增殖，所述食源性病原体形成不健康的条件，并对食物供应构成污染风险。因此，产生大量生物质的商业机构，例如杂货店、食品生产设施和餐馆必须定期清运食物废料，导致大量和重复的成本。

以多种方式处理有机生物质，如食物废料。例如，仅在美国，每年就产生约6300万吨食物废料和废物，以及将近5800万吨被送往垃圾填埋场处理。然而，分解食物废物是麻烦的，并造成了环境问题，如污染危害和问题，例如上述的。雨水渗透通过放置食物废物的垃圾填埋场，并导致浸出，从而造成土壤、地表水和地下水的污染。此外，腐败的生物质废物排放温室气体，其随后造成重大的环境问题。

已进行尝试来解决某些有机生物质处理的环境问题，并利用分解代谢降解过程。一种方法就是利用选定的细菌在厌氧环境中进行有机生物质的加工，以增强分解代谢过程。该厌氧消化的过程试图捕获由分解代谢过程产生的甲烷，并将捕获的甲烷用作能源。然而，从有机生物质(如食物废料回收)捕获甲烷已被证明是极其效率低下的，并且在某些情况下，已经是净负能量来源。通过厌氧加工捕获甲烷仍还需要杂货店或食物供应链中的其他场所支付高额的处理费用，用以将食物废料移出并运输到厌氧消化设施。

另一种应对有机生物质处理的方法就是将有机生物质堆肥。堆肥是一种受控的生物腐烂过程，其将有机生物质基质转化为热、二氧化碳、铵和不完全腐烂的有机物。受控的腐烂过程的结果是一种腐殖质样的材料，其最常被用作土壤改良剂。然而，堆肥的特点更多地在于其作为土壤改良剂的价值，产生更大的水分承载能力，而不是其内在的营养价值。此外，通过堆肥产生的含氮化合物可以用来生产肥料。原始有机生物质中的大量营养素仍然在分解代谢过程中损失，导致热量和二氧化碳的破坏性产生。这种效率低下会被巴氏杀菌工作进一步放大，巴氏杀菌工作有时应用于从最终产品消除病原体。这种加热虽然对消除病原体是有效的，但对肥料材料的营养质量具有负面影响，因为在该加热过程中，有价值的维生素、氨基酸和其他有价值的营养被破坏。最终，像通过厌氧消化捕获甲烷一样，堆肥也仍然需要杂货店或食物供应链中的其他场所支付高昂的处理费用，用以移出和运输食物废料。

已经描述了许多其他用于处理有机生物质废物(例如，食物废料)的系统和方法。这些系统一般由以下组成：减小废物体积的方法，以及a)使用切碎的食物废物作为动物饲料或b)通过生活污水系统处理，其中有机材料再次由来自许多不同的域(Domain)和门(Phyla)的微生物(受控或不受控地)分解代谢。以这种方式处理导致大量碳和氮物质通过二氧化碳或甲烷损失。通过生活污水系统处理有机物只是将腐烂的食物废物的危害和问题转移到当地或区域的水处理厂，但最终仍然导致食物废料中热力学能量的损失和温室气体的产生。因此，以前解决食物废料难题的尝试已经在垃圾填埋场中的运输和处理(所谓的倾倒费)或在分解的食物废料的分解代谢(降解)副产品，如甲烷捕获中寻找到价值。

因此，仍然需要有效和廉价的方法来抑制致病微生物在有机生物质废品上的增殖，而无需巴氏杀菌，从而提供安全和营养素丰富的产品。该公开内容解决这些需求和相关的需求。

概述

提供该概述是为了以简化的形式介绍一些概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。该概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于协助确定所要求保护的主题的范围。

一方面，公开内容提供一种抑制生物质中致病微生物生长的方法。所述方法包括：

使生物质与有效量的非致病的活酵母接触；

搅拌生物质以使酵母分布在生物质内，以提供酵母稳定的生物质浆料；以及

保持浆料中的有氧条件，以使酵母有氧生长。

另一方面，公开内容提供一种抑制生物质中的腐败的方法。所述方法包括：

加工生物质以产生基本上均质化的液体浆料；

使基本上均质化的液体浆料与有效量的非致病的活酵母接触；

连续搅拌基本上均质化的液体浆料，以使酵母在有氧条件下分布在基本上均质化的液体浆料内，以提供酵母稳定的生物质浆料；

过滤酵母稳定的生物质浆料以除去大颗粒，以产生酵母稳定的生物质浆料滤液；以及

对酵母稳定的生物质浆料滤液通气。

在任一方面，所述方法可以进一步包括对酵母稳定的生物质浆料和/或酵母稳定的生物质浆料滤液施加一种或多种另外的障碍条件。

附图说明

本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更容易被理解，因为当结合附图时，通过参考以下详细描述，本发明的前述方面和许多伴随的优点变得更好理解，其中：

图1示意性地说明了示例性实施方案，其中将所公开的预防或抑制致病微生物生长的方法(图示为“生物保存”)合并到从初始有机生物质材料(例如，食物废料)产生精制的生物质产品的过程中。在本图中，F、pH、EC、a

图2A-2C是显示与酿酒酵母(S.cerevisiae)共孵育0分钟(图2A)、30分钟(图2B)和60分钟(图2C)后铺平板的大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌属菌株(Salmonella spp.)(组合的)的生长的平板照片。每个图显示三个对应于(从左到右)在XLD平板、YPD平板上的生长或在XLD平板上的盐水/浆料对照(即，不与酿酒酵母共孵育)的平板。所述测定在实施例4中更详细地描述。

图3A-3C是显示与酿酒酵母、产朊假丝酵母(C.utilis)和解脂假丝酵母(Clipolytica)(组合的)共孵育0分钟(图3A)、30分钟(图3B)和60分钟(图3C)后铺平板的大肠杆菌和沙门氏菌属菌株(组合的)的生长的平板照片。每个图显示三个对应于(从左到右)在XLD平板、YPD平板上的生长或XLD平板上的盐水/浆料对照(即，不与酿酒酵母共孵育)的平板。所述测定在实施例4中更详细地描述。

详细说明

公开内容提供抑制有机生物质废品中致病微生物生长和增殖以提供不需要巴氏杀菌的受控分解代谢过程的方法。所述方法可应用于有效生产有机产品，所述有机产品保持高营养价值，且对于各种用途，如用于肥料或动物饲料都是安全的。如下文更详细描述的，发明人已确定，在有机浆料或来自食物废料来源的浆料中，将致病微生物与各种酵母菌种共同孵育导致致病微生物迅速减少，并且经常完全清除致病微生物。

不受任何特定理论的限制，据信酵母不仅与微生物竞争有机基质中的营养资源，而且还创造抑制病原微生物的生长和增殖的条件。因此，酵母的应用为微生物的生长和生存提供“障碍”。这种酵母驱动的障碍可以作为更广泛的障碍策略的一部分来利用，以防止致病酵母的增殖，甚至有机生物质废品的腐败。“障碍”策略也被称为“组合保存”，其是传统上已知的多管齐下的策略，用以保持微生物的稳定性或甚至防止基质(例如，食品)中的微生物生长，否则所述基质可能促进微生物生长的激增。所述策略可具体应用于延长易腐败的食物和其他产品的保质期。传统的障碍方法通过施加诸如限制的pH值、温度、压力、水分(水活度)、盐含量、电导率和氧化还原电位的次优生长条件，向微生物生长提供多重挑战。然而，单独的任何一种限制条件都可能对基质中的微生物有一些损害，而多种因素的应用协同组合，用以克服微生物的生长甚至生存能力。这样，通过组合，任何单一障碍的强度都可以设置在单一阈值以下，以抑制目标微生物。虽然一些微生物可能能够单独克服一种或几种障碍，但它们不能克服所有组合的障碍。已经描述了障碍技术及它们在食物保存领域中的应用，例如，Tanaka，J.Food Protect.，第49卷，第7期，第526-531页(1986年7月)，其内容通过引用并入本文。

该公开内容提出了一种新的障碍，其可以单独使用，或与其他障碍，如pH、温度、压力、水活度、电导率和/或氧化还原电位的改变策略性地组合使用，以实现对有机生物质基质，如农业和食物生物质废料产品中致病微生物生长的抑制。

根据前文，公开内容提供一种抑制生物质中致病微生物生长的方法。

所述方法包括：

使生物质与有效量的非致病的活酵母接触；

搅拌生物质以使酵母分布在生物质内，以提供酵母稳定的生物质浆料；以及

保持浆料中的有氧条件，以使酵母有氧生长。

生物质可以包括食物、食物废料、废品、农业废品、家庭庭院废品及其组合。在一些实施方案中，生物质可以是包括食物废料的有机生物质。食物废料是来自食物供应链的最终没有被消耗的残余有机材料。在一些实施方案中，食物废料是指由于任何原因已经被认为不可销售的食物组分。在一些实施方案中，食物废料已被提供给顾客，但没有被吃掉。在一些实施方案中，生物质可以是有机生物质，其包括植物部分，如在庭院维护中或从农业生产生长和生产的。生物质可以是固体(或多种固体组分的混合物)、液体或固液组分的混合物。

在一些实施方案中，所述方法还包括在与有效量的非致病的活酵母接触之前，加工生物质以产生基本上均质化的液体浆料。术语“基本上均质化的液体浆料”涵盖含有固体块、颗粒或混合在其中不完全液化的有机生物质碎片的液体。在一些实施方案中，加工步骤包括用水润湿生物质。在一些实施方案中，将水加热到约90°F到约130°F，如90°F±5°F、100°F±5°F、110°F±5°F、120°F±5°F、130°F±5°F的温度。在其他实施方案中，将基本上均质化的液体浆料至少暂时加热到约90°F至约150°F，如90°F、100°F、110°F、120°F、130°F、140°F、150°F或任何所示温度的5°F以内的温度。所述加工步骤还可以包括压碎或磨碎生物质以提供基本上均质化的液体浆料的步骤。在一些实施方案中，基本上均质化的液体浆体的剩余固体生物质组分具有至少75％的直径小于5mm、小于5mm或小于1mm的颗粒。

非致病的活酵母包括可以是能够在有氧条件下生长的任何非致病的酵母菌种的酵母。酵母可以发挥从生物质进料和生长介质释放营养素，并同时胜过和限制潜在存在于生物质中的致病微生物的生长的作用。在某些情况下，酵母有助于用作致病微生物的维持和生长的屏障或“障碍”的环境条件。在一些实施方案中，非致病的活酵母包括选自酵母菌属(Saccharomyces)或念珠菌属(Candida)或其组合的酵母。在一些实施方案中，非致病的活酵母包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)或解脂假丝酵母(Candida lipolytica)或其组合。

与生物质接触的非致病的活酵母可以是任何定量给予形式。在一些实施方案中，与生物质接触的酵母是休眠的。在一些实施方案中，与生物质接触的酵母是干的活酵母。在一些实施方案中，与生物质接触的酵母具有代谢活性，例如，活跃地生长和繁殖。例如，在一些实施方案中，与生物质接触的酵母处于液体接种物中。举例来说，包含生物活性酵母或酵母组合的示例性液体接种物可以按以下方式制备：

a.使用添加大量补充剂、糖、均质化的非致病的酵母(如酿酒酵母)和水，通过在生长培养基中一系列的10倍增加，增加小批量培养的酵母。

b.每次增殖在15-30℃下通气孵育24-48小时。

c.这个过程的最终结果是液体接种物。例如，一个接种物批次可以由以下组成：

i.约92.0±5％的水

ii.约1.5±0.5％均质化非致病的酵母(如酿酒酵母)

iii.约2.0±0.5％的糖

iv.约4.5±1％的大量补充剂

d.然后如本文所述将接种物添加到生物质

与生物质接触的酵母非致病的活酵母的量可以基于几个因素来确定，包括特定生物质的量、内容物和条件。如本文所用的，短语“有效量”是指足够量的非致病的活酵母，使得与不添加非致病的活酵母的相同或相似生物质相比，致病微生物生长受到可测量地抑制。致病微生物的存在或生长可以容易地通过例如培养物测定、致病微生物产生的毒素的测定或测定致病微生物分解代谢活性的产物来确定。在一些实施方案中，可以通过测量腐败来推断致病微生物的存在或生长，包括测量挥发性脂肪酸和有臭味的多胺和硫化氢。在一些实施方案中，非致病的活酵母的有效量为至少1E

在搅拌生物质的同时，将有效量的非致病的活酵母连续添加到生物质，以形成酵母稳定的生物质浆料。搅拌不仅使酵母在整个生物质中分布和分散，而且促进整个生物质中的有氧条件。添加可以是单一剂量的，多个离散剂量的，或在一段时间内连续添加。在一些实施方案中，仅添加初始量的酵母以建立可生长的菌群。在其他实施方案中，通过另外的添加非致病的活酵母的步骤来补充非致病的活酵母的初始引入，以保持生物质中的恒定菌群或增加生物质中的菌群。可基于生物质的各种关键性能指标(KPI)确定非致病的活酵母的另外给予，所述指标包括pH、选定的细菌/病原体浓度、种子生物(即，非致病的活酵母)浓度，或其组合。在一些实施方案中，在足以保持至少1E

在一些实施方案中，所述方法还包括向生物质添加包含酵母裂解物残留物的微量营养素。通常，在生物质已经与酵母接触并转化为酵母稳定的浆料后添加微量营养素补充剂，但其也可以在与有效量的非致病的活酵母接触之前添加。微量补充剂提供微量营养素和生长因子，其促进酵母在生物质中的维持和生长。示例性的微量补充剂可以包括非致病的酵母或其组分(如酿酒酵母(可从例如啤酒厂获得)和/或酵母细胞壁(例如，来自中国杭州的杭州聚光进出口有限公司(Hangzhou Focus Corp))。在一些实施方案中，非致病的酵母或其组分(例如，酿酒酵母)经历机械过滤以去除大颗粒和均质化的加工。均质化后，任选地再次过滤酵母。最终的微量补充剂可以是按重量计约10％的固体和90％的水。酵母裂解物残留物(以商品名“酵母细胞壁”提及)包含从热诱导自溶步骤后的酵母浆料的母液分离的固体。商品化酵母细胞壁通常作为干粉交付，它可以以1：10的比例替代制备的酿酒酵母，其质量的平衡由水或另外的制备的均质化的液体生物质浆料组成。

在一些实施方案中，所述方法还包括向酵母稳定的生物质浆料添加大量营养素补充剂。大量营养素补充剂向生物质提供了另外的营养素，其用作例如氮、磷、钾、硫和/或碳的来源，以促进酵母生长。大量营养素补充剂成分也可以提供全部、一些或很大比例的微量营养素，包括有机酸、维生素和矿物质。在一些实施方案中，大量营养素至少部分或完全源自植物。为了促进大量营养素补充剂的营养素可用性，可任选地首先用酶处理补充剂。一旦经过处理，可以将大量营养素补充剂成分混合，并以足以产生期望的营养素含量的量添加到生物质。与使用微量营养素补充剂一样，大量营养素补充剂通常在生物质已经与酵母接触并被转化为酵母稳定的浆料后添加。但是，在与有效量的非致病的活酵母接触之前，也可以添加大量营养素补充剂。

在一些实施方案中，保持有氧条件包括连续地或周期性地搅拌酵母稳定的生物质浆料。浆料可以同时用包含氧的气体通风。在其他实施方案中，包含氧的气体(例如，空气)，例如来自压缩空气源的，可以注入或通入浆料中或在其上灌注或通气。

致病微生物生长的减少可以表示为与不和非致病的活酵母接触的等同生物质中的致病微生物生长的比较。致病微生物可以是促进腐败或可以以其它方式只是在生物质中生长的任何微生物(例如细菌)。在一些实施方案中，致病微生物是已知的人类病原体，如食源性病原体。例如，在一些示例性和非限制性实施方案中，致病微生物选自乳杆菌属(Lactobacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)和埃希氏菌属(Escherichia)。

所公开的方法也可以结合各种其他障碍条件(即，有害的环境条件)的应用，以进一步控制或抑制生物质中致病微生物的生长。如上所述，任何一种障碍可能不一定对目标微生物施加致命的条件，甚至可能促进对能够抵抗单一障碍的病原体生物的选择。然而，由于多种障碍的协同作用，单一障碍的强度可以以低于微生物抑制所需的阈值来应用，并可以避免病原体抗性的发展。虽然一些微生物可能能够分别克服一种或几种障碍，但它们不能克服组合的(例如，以同时的和/或连续的组合)所有障碍。如上所述，将非致病的活酵母引入生物质给致病微生物的生长提供了一种重要的障碍，如下所述，其可以与一种或多种另外的障碍组合，以进一步增强生物质中的抗微生物环境。这可以防止不希望的微生物生长，例如致病微生物的生长，并可以最终减少、防止或减缓腐败。

如下所述，一种或多种另外的障碍都可以各自与如上所述的将非致病的活酵母引入生物质同时应用，或独立于如上所述的将非致病的活酵母引入生物质应用。一种或多种另外的障碍的应用可以持续相对于彼此相似的持续时间或不同的持续时间，以及相对于将非致病的活酵母引入生物质相似的持续时间或不同的持续时间。可以应用任何另外的障碍的组合。在一些实施方案中，应用一种或多种另外的障碍持续一段时间，这段时间与将非致病的活酵母引入生物质同时或至少重叠。在一些实施方案中，在将非致病的活酵母引入生物质完成之后，一次应用一种或多种另外的障碍。在进一步的实施方案中，将另外的非致病的活酵母以第二或后续剂量引入生物质，其与一种或多种另外的障碍的应用重叠。应当理解，不需要在相同位置向生物质混合物应用或引入不同的障碍。例如，该公开内容涵盖其中在第一位置处(例如，如生物质的来源，如在产生食物废料的杂货店)将非致病的活酵母引入第一罐中的生物质的实施方案。虽然可以在第一位置处的第一罐中任选地应用一种或多种另外的障碍，但是酵母稳定的生物质浆料可以被移到第二位置，如应用另外的一种或多种障碍的生产设施。

现在分别讨论一种或多种另外的障碍。

热加工是一种广谱的病原体减少技术。然而，过高的温度，如在巴氏杀菌中使用的温度会导致生物质基质营养品质的降低或损失。因此，可以应用适度升高的温度。虽然这样的适度升高的温度仍然可以允许许多微生物生长，但是因为生物体消耗能量来适应变化的环境，整个生产过程中温度的波动导致代谢压力。能量的消耗单独和/或与其他障碍结合导致代谢耗尽，导致致病微生物的死亡。在一些实施方案中，所述方法还包括将酵母稳定的生物质浆料中的温度保持为选自约50°F到约120°F。温度可以保持至少约30分钟，以及长达数天的时间量度。示例性的时间包括至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2.5天、3天、4天或更长。在一些实施方案中，将温度升高到至少70°F、至少80°F、至少90°F、至少100°F或至少110°F。如上所述，这些温度中的任何一个都可以保持至少30分钟。

在一些实施方案中，所述方法还包括提高施加在酵母稳定的生物质的压力。在许多实际应用中，生物质的搅拌和均质化，包括所得的加工的浆料形式的生物质的搅拌和均质化是机械进行的。在给定的时间，机械搅拌经常对生物质的至少一种组分施加提高的压力。由于生物质基质在加工或搅拌过程中在容器中循环，最终大部分或全部生物质在所述方法的持续时间内经受升高的压力。然而，由于搅拌过程，经历升高的压力的特定部分会不断变化。因此，在任何时间点，可以将升高的压力施加在生物质的至少一种组分。在一些实施方案中，升高的压力是在约2巴和18巴之间，例如2巴、3巴、4巴、5巴、6巴、7巴、8巴、9巴、10巴、11巴、12巴、13巴、14巴、15巴、16巴的压力。在均质化/处理过程中，向至少一部分(在某些实施方案中是全部)酵母稳定的生物质浆料施加该升高的压力，持续总共约半小时。如果升高的压力是由于特定的搅拌过程造成的，则只要搅拌浆料就会应用升高的压力。浆料批次的任何给定组分将接受约30-120秒总时长的升高的压力，之后不同组分循环通过升高的压力的区域。因为总加工时间可以是，例如超过12小时，在批次中应用升高的压力的总累积时间可以持续至少30分钟，以及及多达数天的时间量度。示例性的时间包括至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2.5天、3天、4天或更长。在一些实施方案中，在处理过程中，对于批次浆料的任何特定组分，将压力保持选自5巴到16巴的压力下至少30-120秒，例如，约60秒。

例如，部署一个最大流速为7000L/hr的均质器以提供约16巴的最大加工压力。该高压均质化可以有效地使许多细菌失活。因此，虽然一些微生物可能能够承受该压力增强的障碍，但微生物的数量减少，因此剩余的细菌会遭受代谢压力。

相对酸度(即，较低的pH值)可以用作另外的障碍，其可以促进病原体减少和生物质产品的保存。通过增强某些弱有机酸穿透微生物细胞和破坏正常代谢过程的能力，降低的环境pH值进一步提升它们的抗微生物性能。因此，在一些实施方案中，所述方法进一步包括将酵母稳定的生物质浆料保持在pH小于5，持续至少30分钟。在进一步的实施方案中，将酵母稳定的生物质浆料保持在pH为4.2±0.5，持续至少30分钟。保持降低的pH值的示例性的时间包括至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2.5天、3天、4天或更长。保持所述pH的步骤可以包括向酵母稳定的生物质添加一种或多种酸。用于此目的的示例性非限制性酸包含乳酸、柠檬酸、琥珀酸和挥发性脂肪酸。此外，酸可以是添加本文涵盖的各种大量营养素或其他添加剂的一部分，或是其结果。虽然降低的pH的条件可能未完全消除所有的目标致病微生物，但幸存的微生物很可能遭受代谢压力，以及更容易受到其他有害因素，如施加其他障碍因素的影响。

水活度经常对生物质产品中生物生长是否将减少有显著的影响。水活度可与其他障碍因素，如温度、pH和氧化还原电位组合，以建立对致病微生物有抑制作用的条件。在一些实施方案中，所述方法还包括将酵母稳定的生物质浆料保持在水活度低于0.97A

在一些实施方案中，所述方法还包括将酵母稳定的生物质浆料保持在电导率(EC)为20.0±5mS/cm，持续至少30分钟。微生物对电导率的敏感性在很大程度上是由于高浓度的盐和偶极分子，其导致微生物生长的抑制。与使用上文描述的其他障碍一样，可以施加所述EC水平至少约30分钟，以及多达数天的时间量度。示例性的时间包括至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2.5天、3天、4天或更长。

氧化还原作用或氧化还原电位(Eh)是对化合物的被氧化和还原的能力的度量。氧化还原电位(Eh)以毫伏(mV)测量。在氧化过程中，电子从电子供体转移到受体，所述受体被还原。一般，不同微生物可以生长的范围如下：需氧微生物+500至+300mV；兼性厌氧微生物+300至-100mV；厌氧微生物+100至小于-250mV。培养基中Eh与微生物生长的关系受加工的材料中的pH、盐和其他成分的存在显著影响。一般，好氧生物需要一个具有相对高的接受电子的能力的环境(正Eh)，而厌氧微生物需要一个富含电子供体的环境(负Eh)。在我们的加工环境中，低Eh对好氧生物不利，而严格的厌氧微生物在整个加工中被连续的混合和通气以保持有氧条件耗尽。此外，Eh可加重不利于病原生长的pH和EC水平所产生的代谢压力。因此，在一些实施方案中，所述方法还包括将酵母稳定的生物质浆料保持在氧化还原电位(Eh)选自0mV到-200mV，持续至少30分钟。与采用上文描述的其他障碍一样，可以施加所述Eh水平至少30分钟，以及多达数天的时间量度。示例性的时间包括至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2.5天、3天、4天或更长。

公开内容涵盖包括上述方法实施方案，以防止腐败和/或提高加工有机生物质产品，如食物、农业或家庭庭院和花园废品的安全性的方法。这些方法可以有若干应用，如生产营养丰富、安全的有机肥料产品和动物饲料。图1提供了该公开内容所涵盖的生产肥料产品的通用方法的代表性示意图。

为了说明，在一个实施方案中，所述方法用于抑制生物质中的腐败，并且包括：

加工生物质以产生基本上均质化的液体浆料；

使基本上均质化的液体浆料与有效量的非致病的活酵母接触；

连续搅拌基本上均质化的浆料以使酵母在有氧条件下分布在基本上均质化的浆料内，以提供酵母稳定的生物质浆料；

过滤酵母稳定的生物质浆料以除去大颗粒并产生酵母稳定的生物质浆料滤液；以及

向酵母稳定的生物质浆料滤液通气。

如上所述，加工步骤包括用水润湿生物质。在一些实施方案中，用于润湿生物质的水可以有升高的温度，如约90°F到约150°F，如90°F、100°F、110°F、120°F、130°F、140°F、150°F，或在任何所示温度的5°F以内。所述加工步骤还可以包括压碎或磨碎生物质以提供基本上均质化的液体浆料的步骤。在一些实施方案中，基本上均质化的液体浆体的剩余固体生物质组分具有至少75％的直径小于5mm、小于2mm或小于1mm的颗粒。在一些实施方案中，所述方法还包括在通气步骤之前一次或多次再均质化和再过滤酵母稳定的生物质浆料滤液。

酵母稳定的生物质浆料滤液可以在延长的时间段内保持其状态，例如在延长的存储或运输到例如集中加工中心期间。另外的障碍可以应用于酵母稳定的生物质浆料滤液。这可以同时地或按顺序地发生在相同的位置。此外，酵母稳定的生物质浆料滤液可以运输到第二地置(例如，生产设施)，其中另外的非致病的活酵母和/或一种或多种另外的障碍可以在进一步的加工过程中应用。

在一些实施方案中，所述方法还包含使酵母稳定的生物质浆料滤液与另外的非致病的活酵母、包含酵母裂解物残留物的微量营养素和/或基于植物的大量营养素接触。通常，随着添加这些另外的组分，如通过连续搅拌，保持有氧条件。该补充的酵母稳定的生物质浆料滤液可以被进一步加工，包括上述一种或多种障碍条件(例如，限制的pH值、温度、压力、水分(水活度)、盐含量、电导率和氧化还原电位)的施加。对于类似或不同的持续时间，可以独立地或同时地应用一种或多种另外的障碍。任何另外的障碍的组合都可以应用。障碍条件可以独立或在一起保持至少30分钟的时间段，以及长达数天的时间量度。障碍条件的示例性时间包括至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2.5天、3天、4天或更长。

补充的酵母稳定的生物质浆料滤液可以在选自70°F至120°F(例如，80°F至100°F)的温度下再均质化至少6小时，然后过滤加热的浆料一次或多次，以产生精制的浆料滤液。精制的浆料滤液可加入，例如，成品肥料产品。

以下是公开内容所涵盖的示例性方法的按步骤描述。所述方法中的主要基质成分是从杂货店收集的消费前食物废料，一般可以包括农产品(produce)、红肉、海鲜、家禽、面包店和商店制备的熟食。食物废料收集后，一般按照图1所示的流程图，方法步骤如下：

1.将初始生物质基质(例如，食物废料)压碎，并且几乎瞬间在收获机设备内被粉碎。

2.用水(任选加热的，如加热至140°F)清洗收获机的接收和研磨室，实现食物废料的润湿并料斗的清洗。

3.粉碎的材料，通常是基本上均质化的液体浆料被输送到位于现场的接收罐中。

4.整天进行食物和水的周期性添加，两种成分的体积随着所在位置处产生的废料材料的量和接收罐的容量而变化。

5.定期监测收获机生物罐以添加酵母(如上所述)，并收集所得到的酵母稳定的液体浆料的样品用于质量控制的目的。

6.在质量控制实验室中，定期对酵母稳定的液体浆料就pH值、电导率、总微生物计数、“接种的微生物”的计数和大肠菌样生物的计数进行评价。

7.远程监控罐内的酵母稳定的液体浆料水平，当充满时使用食品级软管和泵清空罐。

8.采用持续的混合始终保持酵母稳定的液体浆料处在有氧条件下。

9.使用收集软管和连接件将收集的酵母稳定的液体浆料转移到当地加工设施处的聚乙烯浆料接收罐。

10.材料到达加工设施后，立即对其进行机械过滤以去除大的纤维食物废料、潜在的污染物或尚未充分破碎的材料。再研磨和再加工排除的有机材料。

11.将酵母稳定的液体浆料滤液均质化，既有助于进一步减小粒径，又有助于将另外的营养素释放酵母稳定的液体浆料滤液中。

12.在进一步均质化后，再过滤材料一次或多次，然后在通气下无限期地保持，直到用于形成肥料产品。滤液可被转移到生物加工罐，并在必要时与另外的组分，如硫酸钾、柠檬酸和/或另外的非致病的活酵母(例如，作为接种物引入的，如上所述生产的)组合。此外，如上所述，可以添加微量补充剂和大量补充剂。

13.大量补充剂的缓慢添加促进接种物生长。通常，在48到72小时的时间段内，接种的酵母菌种占主导地位，而其他不需要的、无关的菌群数量快速下降。加工中的肥料非常稳定，并保持在30℃、有氧条件下，直到准备用于进一步加工。

14.48-72小时后，将生物加工罐中的加工中的肥料转移至混合罐，在混合罐中添加大量补充剂，直到材料达到其期望的有保证的分析。

15.将材料加热至30℃，并且将活性培养物保持48-72小时，然后进行进一步加工。

16.48-72小时后，材料被均质化以进一步减小粒径并破坏微生物。

17.通过另外的机械过滤步骤依次加工酵母稳定的液体浆料滤液并将其储存。

18.产品在隔离状态下储存，直到完成可选的QC测试。

19.对产品就营养素含量、金属浓度和潜在病原体，如沙门氏菌种、产毒素大肠杆菌和李斯特菌种进行分析。

20.由实验室管理者根据建立的标准操作规程发出通过审核的材料。

21.为客户对发出批次的精制生物质产品成品(如肥料)进行适当包装(例如以塑料瓶、IBC装运箱、罐装车等)。

通用注解和定义：

除非本文有特别定义，否则本文中使用的所有术语具有与其将对于本公开内容的领域中技术人员而言的相同的含义。

为了方便，在此提供了本文中，说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。提供定义有助于描述特定实施方案，并不旨在限制所要求保护的发明，因为发明的范围仅由权利要求书限定。

尽管公开内容支持仅指供选择的事物和“和/或”的定义，但是权利要求中的术语“或”的使用用于指“和/或”，除非明确表示仅指供选择的事物或供选择的事物是相互排斥的。

除非有特别注明，否则在权利要求书或说明书中，当与词语“组成(comprising)”结合使用时，词语“一(a)”和“一(an)”表示一或多。

除非上下文中明确另有要求，否则在整个说明书和权利要求中，词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等应以包括性意义解释，而不是以排他的或穷尽的意义解释，其应以“包括，但不限于”的意义显示。使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。词语“约”表示在所述参考数字之上或之下的微小变化范围内的数字。例如，“约”可以指高于或低于所示参考数字10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％范围内的数字。

公开了可以用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物结合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物或为所公开的方法和组合物的产品的材料、组合物和组分。应理解的是，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、要素等时，具体考虑每一不同的个体和集合组合，即使对这些化合物的每一单个组合和排列的具体指称可能未被明确地公开。这个概念适用于该公开内容的所有方面，包括但不限于所述方法中的步骤。因此，任何前述实施方案的具体要素可以组合或替代其他实施方案中的要素。例如，如果有各种可以进行的另外的步骤，那么应理解这些另外的步骤中的每一个都可以用所公开的方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且每个这样的组合或组合的子集都被具体考虑，并且应该被认为是公开的。此外，应理解，可以使用任何合适的材料，如本文其他地方描述的材料或如本领域中已知的材料来实施本文所述的实施方案。

在此引用的出版物和它们被引用的主题特此通过引用以其整体特意并入。

实施例

出于说明而不是限制公开内容的目的提供以下实施例。

该实施例描述一种测试酵母菌种减少选择的致病微生物生长的能力的测定。

作为初步预防措施，使用NIST-可追踪的闪烁检测设备对协同作用产品的样品存在放射性污染进行测试。该测试的结果表明，没有检测到高出背景大气水平三个标准差的电离辐射。

进行该研究来确定当接种到上述产品中，并以不同的间隔对接种物细菌进行测试时，针对大肠杆菌(E.coli)O157:H7(ATCC#35150)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(ATCC#15313)以及肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)亚种Entericaserovar Abaetetuba(ATCC#35640)是否可以实现5-log的减少。具体来说，分别用三种测试生物中的每一种接种产品，然后在不同时间(接种后1分钟、24小时、48小时和72小时)进行测试，以确定在研究期间如果实现了任何对数减少的话，那么实现了多少对数减少。

通过将来自冷冻的贮存培养物斜面的一接种环量划线到胰蛋白酶大豆琼脂平板(TSA)上制备测试生物的新鲜培养物，并在35℃下孵育24小时。将来自每个接种的TSA平板的单个分离的菌落转移到胰蛋白酶大豆浆料(TSB)中，并且在35℃下孵育24小时。然后，通过在含有10％无菌酒石酸的酸化的TSB中连续地每天转移，将培养物酸适应至pH 4.5。在悬浮液中制备培养物，然后将每种培养物不同的等分试样分别接种到产品的不同的等分试样中，以达到～10

在基线下，将接种的产品彻底混合一分钟，称出单份的10克等分试样，稀释并使用FDA BAM有氧平板计数法(the FDA BAM Aerobic Plate Count Method)和针对以下三种病原体中的每一种的选择性培养基：(用于大肠杆菌O157:H7的快速大肠杆菌2琼脂(RapidE.coli 2Agar)，用于单核细胞增生李斯特菌的改良牛津琼脂培养基(Modified OxfordAgar，MOX)和用于肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)亚种Enterica serovarAbaetetuba的木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(Xylose-lysine-desoxycholate Agar，XLD))铺平板，一式两份。向固化的选择性琼脂加上一薄层胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)，以抑制任何非选择性微生物的生长。在计数前，将平板在35℃下孵育48小时。将接种的样品再保持24小时、48小时和72小时，储存在环境温度(68°F-72°F)下并相应地铺平板。未接种的样品用作对照。测试结果表示为每个被测试的样品的重复计数的平均值。

该研究的结果列在表1中，表明24-72小时的环境储存(68°F-72°F)后，含有协同作用产品的产品针对大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和肠道沙门氏菌亚种Enterica serovar Abaetetuba实现了>6-log的减少。在环境保存24小时、48小时和72小时后，任何测试生物都没有恢复(<1cfu/ml)。

表1：接种后样品中的细菌计数

基于这些结果，含有协同作用产品配方的产品在环境存储24小时后，针对所有三种测试生物都有效地实现了>6-log的减少。

该实施例描述另一种测试酵母菌种减少选定致病微生物生长的能力的测定。

作为初步预防措施，使用NIST-可追踪闪烁检测设备对WISErg 3-2-2产品的样品存在放射性污染进行测试。该测试的结果表明，没有检测到高出背景大气水平三个标准差的电离辐射。

进行该研究以确定当接种到上述产品中，并在不同的时间间隔进行测试时，针对大肠杆菌O157:H7(ATCC#35150)、单核细胞增生李斯特菌(ATCC#15313)和肠道沙门氏菌亚种Enterica serovar Abaetetuba(ATCC#35640)能否实现5-log的减少。具体地，分别用三种检测生物中的每一种接种产品，然后在不同的暴露时间(接种后1分钟、24小时、48小时和72小时)进行测试，以确定在研究期间如果实现了对数减少的话，那么实现了多少对数减少。

通过将来自冷冻的贮存培养物斜面的一接种环的量划线到胰蛋白酶大豆琼脂平板(TSA)上制备测试生物的新鲜培养物，并在35℃下培养24小时。将来自每个接种的TSA平板的单个分离的菌落转移到胰蛋白酶大豆浆料(TSB)中，并且在35℃下孵育24小时。然后通过在含有6N HCl的酸化的TSB中连续地每天转移，使培养物酸适应至pH 5.0。在悬浮液中制备培养物，然后将每种培养物的不同的等分试样接种到产品的不同的等分试样中，以达到～10

在基线下，将接种的产品彻底混合一分钟，称出单份10克等分试样，稀释并使用FDA BAM有氧平板计数法和用于以下三种病原体中的每一种的选择性培养基：(用于大肠杆菌O157:H7的快速大肠杆菌2琼脂、用于单核细胞增生李斯特菌的改良牛津琼脂(MOX)和用于肠道沙门氏菌亚种Enterica serovar Abaetetuba的木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂培养基(XLD))铺平板，一式两份。向固化的选择性琼脂加上一薄层的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)，以抑制任何非选择性微生物的生长。在计数前，将平板在35℃下孵育48小时。将接种的样品再保持24小时、48小时和72小时，储存在环境温度(68°F-72°F)下并相应地铺平板。未接种的样品用作对照。测试结果表示为每个被测试的样品的重复计数的平均值。

该研究的结果列在表2中，表明在24-72小时的环境存储(68°F-72°F)后，WISErg3-2-2产品针对大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和肠道沙门氏菌亚种Entericaserovar Abaetetuba实现了>6-log的减少。在环境储存24小时、48小时和72小时后，任何测试生物都没有恢复(<1cfu/ml)。

表2：接种后样品中的细菌计数

基于这些结果，含有WISErg 3-2-2产品配方的产品在环境储存24小时后，针对所有三种测试生物都有效地实现了>6-log的减少。

该实施例描述一种测试生物防腐酵母菌种降低液体生物质浆料(如液化的食物废料)中致病微生物生长特性的能力的测定。

该研究用于评价生物防腐生物对进料生物质浆料中病原体减少的效果，所述进料生物质浆料是由食物废料产品加工的。

250-mL锥形瓶

取样的生物质浆料

大肠杆菌、沙门氏菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、解脂假丝酵母的实验室分离株

无菌的50％YPD浆料

无菌的1％PBS摇床培养器

水套培养箱无菌的YPD和XLD平板

无菌的移液器吸头

无菌的玻璃涂布珠

为了获得基本上均质化的液态生物质浆料，将食物废料产品用140°F的水连续润湿，压碎，并在收获机设备的接收和研磨室中粉碎。

按照接种物制备标准操作规程(Inoculum Preparation SOP)，由实验室分离株和无菌的YPD浆料制备125mL酿酒酵母、产朊假丝酵母和解脂假丝酵母的悬浮液。将100ml每种酵母悬浮液混合在一起，以形成组合的酵母悬浮液。

由实验室分离株和无菌的1％PBS制备大肠杆菌和沙门氏菌的1Mcfarland标准当量溶液。将等体积的大肠杆菌和沙门氏菌溶液加在一起，以形成组合的病原体悬浮液。

将基本上均质化的液体生物质浆料的等分试样放入250-ml的锥形瓶中，与如以下表3-6中所示的酵母和病原体溶液组合。

表3：实验组1的组合的酵母和病原体溶液。

表4：实验组2的组合的酵母和病原体溶液。

表5：实验组3的组合的酵母和病原体溶液。

表6：用于浆料对照的组合的酵母和病原体溶液。

除了上述浆料对照外，在实验的持续时间内在室温下保持1McFarland(盐水)的大肠杆菌和沙门氏菌属菌株和组合的病原体的溶液。

将所有实验和浆料对照溶液置于30℃、200RPM下的旋转培养箱中孵育。在孵育时间为0、3小时、6小时、9小时和12小时时，从每个实验浆料和盐水对照溶液取样。将实验样品和浆料对照样品在XLD上以10

所有实验组和对照组的结果列在下表7-9中。

表7：实验组1的细菌计数。

表8：实验组2的细菌计数。

表9：实验组3的细菌计数。

盐水对照组中的病原体在实验持续期间保持有活力。相比之下，在实验开始的3小时内，从所有实验组和浆料对照组都清除了活病原体，确定这些过程有效地杀死和消除加工的生物质中的潜在有害病原体。

该实施例描述另外一种测试生物防腐酵母菌种降低基本上均质化液体生物质浆料(如液化的有机废物)中致病微生物生长特性的能力的测定。

该研究用于评价生物防腐生物对进料均质化液体生物质浆料中病原体减少的效果，所述进料均质化液体生物质浆料是由食物废料产品加工的。该研究旨在通过消除如实施例3中所使用的均质化液体生物质浆料中存在的活背景酵母的存在，进一步将生物防腐生物对病原体浓度的影响分离出来。此外，与实施例3相比，为了观察病原体浓度更逐渐的下降，将以较短的间隔评价样品。

250-mL锥形瓶

从BH2罐取样的无菌的均质化液体生物质浆料，大肠杆菌、沙门氏菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、解脂假丝酵母的实验室分离株

无菌的50％YPD浆料

无菌的1％PBS摇床培养器

水套培养箱无菌的YPD和XLD平板

无菌的移液器吸头

无菌的玻璃涂布珠

如以上实施例3所述得到基本上均质化的液体生物质浆料。

按照接种物制备标准操作规程，由实验室分离株和无菌的YPD浆料制备125mL酿酒酵母、产朊假丝酵母和解脂假丝酵母的悬浮液。将100ml每种酵母悬浮液混合在一起，以形成组合的酵母悬浮液。

由实验室分离株和无菌的1％PBS制备大肠杆菌和沙门氏菌的1Mcfarland标准当量溶液。将等体积的大肠杆菌和沙门氏菌溶液混合在一起，以形成组合的病原体悬浮液。

将来自BH2罐的无菌的液体生物质浆的等分试样放入250-ml的锥形瓶中，与如以下表10和11所示酵母和病原体溶液组合。

表10：实验组1的组合的酵母和病原体溶液。

表11：用于浆料对照的组合的酵母和病原体溶液。

所有实验组和对照组的结果在表12中列出。

表12：实验组1的细菌计数。

盐水对照组中的病原体在实验持续期间保持有活力。实验开始60分钟内，从所有实验组和浆料对照组清除了活病原体。这表明有机浆料中的选定酵母菌种的培养物抑制可以导致基质腐败的致病原微生物的生长，甚至消除其可检测的存在。

虽然已经说明并描述了说明性实施方案，但是应理解可以在不背离发明的精神和范围的情况下在其中进行各种变化。