一种四氢嘧啶的检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体地涉及一种四氢嘧啶的检测及含量测定方法。

背景技术

四氢嘧啶又叫依克多因(Ectoine),化学名1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，分子式为C

关于四氢嘧啶的HPLC分析方法及含量测定，现有技术已有报道采用C18反相色谱柱测定其含量，但四氢嘧啶在C18反相色谱柱不保留，同溶剂峰一同出峰，准确度较差。如公开号为CN105669560B(公开日：2016-06-15)的中国专利，采用的色谱柱为TSK-GEL C18；公开号为CN111965281A(公开日：2020-11-20)的中国专利申请和公开号为CN111983076A(公开日：2020-11-24)的中国专利申请，采用的色谱柱均为Poroshell 120EC-C18(3.0×100mm，2.7μm，美国Agilent公司)。

也有报道使用非C18反相色谱柱的检测方法，如贺冰等.(亲水相互作用色谱法测定中度嗜盐菌中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶.分析试验室.第35卷,第1期.93-96)使用亲水性色谱柱Merck-SeQuant ZIC-HILIC使用的色谱柱成本较高、分离效果并不明显，不适合应用于产业化生产。公开号为CN108120792B的中国专利(公开日2018-06-05)使用金刚烷键合相色谱柱，其键合相为金刚烷基团，由于其对极性选择与C18类似，对极性较大的四氢嘧啶分离效果还是不佳。

发明内容

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

本发明提供一种四氢嘧啶的检测方法，所述方法包括使用高效液相色谱法对四氢嘧啶进行检测，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：

色谱柱：酰胺键合硅胶柱；

检测器：UV检测器；

流动相：包括流动相A和流动相B，其中流动相A是乙酸-乙酸铵缓冲溶液，流动相B是乙腈；

洗脱方式：等度洗脱。

进一步的，所述的酰胺键合硅胶柱选自XBridge

进一步的，所述的酰胺键合硅胶柱柱长为250mm，柱温控制在25～40℃，优选为30℃。

进一步的，所述的UV检测器检测波长为200～220nm，优选为210nm。

进一步的，所述的流动相比例为流动相A:流动相B＝(0～40):(100～60)，优选为流动相A:流动相B＝(20～35):(80～65)。

在一个优选的实施例中，流动相A:流动相B＝20:80。

在一个优选的实施例中，流动相A:流动相B＝30:70。

在一个优选的实施例中，流动相A:流动相B＝35:65。

进一步的，所述的流动相A中乙酸浓度为0.1‰-0.5‰、乙酸铵浓度为0.05‰-0.2‰，优选乙酸的浓度为0.3mL/L、乙酸铵的浓度为0.1g/L。

进一步的，所述的流动相A的pH为2～6，优选为3～5。

进一步的，所述等度洗脱的流速为0.8～1.5mL/min，优选为1mL/min。

进一步的，所述检测方法的进样量为1～20μL，更优选为5μL。

示例性的，本发明提供的四氢嘧啶的检测方法可用于发酵液、中间体、化妆品中的含量测定。

本发明提供的四氢嘧啶的检测方法的有益效果在于：

1、本发明选用亲水作用液相色谱，分离效果好，重现性好；

2、样品稳定且峰形好，可直接用于后期质谱分析，处理方便快捷大大提高了检测效率；

3、在兼顾检测效率的同时，降低了检测的综合成本。

附图说明

图1是实施例1的四氢嘧啶供试品检测图；

图2是实施例2的四氢嘧啶供试品检测图；

图3是实施例3的四氢嘧啶供试品检测图；

图4是对比例的四氢嘧啶供试品检测图。

具体实施方式

虽然在实施例中已经通过一般性说明、具体实施方式及试验对本发明作出了详尽的描述，但在不偏离本发明核心的基础上，仍可以作出的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

本发明所使用的仪器和材料如下：

高效液相色谱仪：Agilent 1260HPLC(美国安捷伦公司)；

检测器：UV检测器(美国安捷伦公司)；

色谱柱：XBridge

色谱纯乙腈(美国Sigma-Aldrich公司)；

四氢嘧啶标准品(上海源叶生物科技有限公司)；

乙酸(烟台市双双化工有限公司)；

乙酸铵(烟台市双双化工有限公司)；

水(哇哈哈纯净水)。

实施例1

配制供试品溶液：取适量四氢嘧啶对照品用水溶解，并制成浓度为100μg/mL的溶液。

色谱条件为：

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪

色谱柱：XBridge

流动相：流动相A(乙酸-乙酸铵缓冲溶液)：流动相B(乙腈)＝20:80，其中流动相A中，乙酸的浓度为0.3mL/L，乙酸铵浓度为0.1g/L，pH为4.0

流速：1mL/min

进样量：5μL

柱温：25℃

检测波长：210nm

洗脱方式：等度洗脱

按照上述色谱条件对供试品溶液进行检测，得到的四氢嘧啶供试品的色谱图如图1所示。由图1可以看出四氢嘧啶具有良好的峰形，保留时间为15.172min。

实施例2

实施例2与实施例1的不同之处在于，流动相A：流动相B＝30:70，其他条件与实施例1相同。得到的四氢嘧啶供试品的色谱图如图2所示。由图2可以看出四氢嘧啶具有良好的峰形，保留时间为8.226min。与实施例1相比，该色谱条件下四氢嘧啶在色谱柱上同样保留优秀，能满足检测的要求。

实施例3

实施例3与实施例1的不同之处在于，流动相A：流动相B＝35:65，其他条件与实施例1相同。得到的四氢嘧啶供试品的色谱图如图3所示。由图3可以看出四氢嘧啶具有良好的峰形，保留时间为6.177min。与实施例1相比，该色谱条件下四氢嘧啶在色谱柱上同样保留优秀，能满足检测的要求。

实施例4

取适量四氢嘧啶对照品用水溶解，并制成如表1所示的一系列浓度的供试品溶液，按实施例3的色谱条件检测，得到如表1所示的四氢嘧啶浓度与峰面积的关系。

表1：四氢嘧啶的浓度与峰面积的关系

由表1可以看出，四氢嘧啶浓度在1.0407～1040.7μg/mL之间内峰面积与对照品的浓度呈良好的线性关系，其回归方程为Y＝12.655X+8.0959，R

实施例5

取适量四氢嘧啶对照品用水溶解，并制成浓度为104μg/mL的供试品溶液，按实施例3的色谱条件检测，连续测6次，计算相对偏差。具体实验结果如表2所示。

表2：精密度实验结果

由表2可以看出本发明提供的检测方法经6次重复实验RSD≤5％，说明本发明提供的检测方法重现性好。

对比例

配制供试品溶液：取适量四氢嘧啶供试品用水溶解，并制成浓度为100μg/mL的溶液。

色谱条件为：

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪

色谱柱：XBridge

流动相：流动相A(磷酸二氢钾缓冲溶液)：流动相B(乙腈)＝30:70，其中流动相A中，磷酸的浓度为0.15mL/L，磷酸二氢钾浓度为2.72g/L，pH为4.0

流速：1mL/min

进样量：5μL

柱温：25℃

检测波长：210nm

洗脱方式：等度洗脱

按照上述色谱条件对供试品溶液进行检测，得到的四氢嘧啶供试品的色谱图如图4所示。由图4可以看出四氢嘧啶具有良好的峰形，保留时间为6.603min，而且在运行过程中发现压力波动大。说明四氢嘧啶的检测流动相不宜选用磷酸盐缓冲体系和乙腈的混合溶液。

实施例6

供试品为产四氢嘧啶的重组大肠杆菌发酵液1mL(湖北美琪健康科技有限公司生产，总量为190mL)，稀释500倍后得供试品溶液。

色谱条件为：

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪

色谱柱：XBridge

流动相：流动相A(乙酸-乙酸铵缓冲溶液)：流动相B(乙腈)＝35:65，其中流动相A中，乙酸的浓度为0.3mL/L，乙酸铵浓度为0.1g/L，pH为4.0

流速：1mL/min

进样量：5μL

柱温：25℃

检测波长：210nm

洗脱方式：等度洗脱

精密称取四氢嘧啶标准品，配制成浓度为193μg/mL的标准品溶液，备用。

分别精密量取供试品溶液和标准品溶液(193μg/mL)各5μL，注入液相色谱仪，其中，标准品的峰面积为2589，供试品的峰面积为3198，按外标法以峰面积计算；供试品溶液主峰与标准品溶液主峰的保留时间一致；

计算过程如下：

供试品浓度＝标准品浓度×供试品峰面积/标准品峰面积×稀释倍数，即：

供试品浓度＝193μg/mL×3198/2589*500

得到供试品浓度结果为119199μg/mL，进一步计算出190mL重组大肠杆菌发酵液中的四氢嘧啶的理论含量为22.65g。

将190mL重组大肠杆菌发酵液减压浓缩至干，得到实际四氢嘧啶成品22.60g，与理论值的误差在可接受范围内，进一步验证本发明提供的含量测定方法的可靠性和有效性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。