一种基于ERA技术的白斑综合症病毒快速检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于ERA技术的白斑综合症病毒快速检测方法及试剂盒。

背景技术

凡纳滨对虾是我国水产养殖的重要经济品种之一。随着对虾产业的发展，养殖行业也面临多种致病原的出现。其中，白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是全球甲壳类动物水产养殖中最普遍的病毒。WSSV感染通常在3-10d内造成高达100％的死亡率。针对WSSV的感染，目前并无十分有效的治疗方案，因此有必要建立一种白斑综合症病毒快速检测的方法，在早期做出感染状态的诊断，能够有效避免产生巨大的经济损失。目前，已经开发出多种方法来检测WSSV，基于其靶向蛋白质或DNA可以分成两类，一类是免疫学检测，另一类是分子生物学检测。免疫学检测主要包括：酶联免疫技术(ELISA)、免疫胶体金技术以及免疫荧光抗体技术，免疫学检测技术由于检测灵敏度较低，制备抗体的步骤繁琐，成本较高且耗时长等不利条件，限制了其在现场检测中的应用。目前，分子生物学检测技术已广泛应用于病毒和其他病原体的检测。根据扩增温度，可以将分子生物学检测技术分为变温扩增检测技术和等温扩增检测技术，包括聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)、荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)、巢式PCR(nest PCR)、绝缘等温PCR(insulated isothermal PCR，iiPCR)、环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)。PCR需要成本较高的热循环仪器，操作复杂且耗时长。LAMP技术作为常见的等温扩增技术，仍存在一定的缺点和不足，例如引物设计复杂、反应温度需要60℃左右且反应时间较长，这些不足均限制了其在现场检测中的应用。酶促重组等温扩增技术(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)是中国苏州先达基因科技有限公司开发出的等温扩增技术，具有快速简便、操作简单、结果可靠的优点。目前还没有将ERA技术应用于快速检测凡纳滨对虾中的白斑综合症病毒的报道。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明通过基因组序列比对分析，选取白斑综合症病毒的保守区域VP28基因作为检测的靶基因，并针对靶基因序列设计了ERA检测引物和探针，建立了检测白斑综合症病毒的ERA技术。

本发明所采用的技术方案如下：

一种基于ERA技术的白斑综合症病毒快速检测方法，包括以下步骤：

(1)ERA特异性引物和探针设计：

上游引物:5’-ACAACACTGTGACCAAGACCATCGAAACCC-3’

下游引物:5’-TCCGCATCTTCTTCCTTCATCTGTGCATCA-3’

探针:依序包括TTGGATCAGGCTACTTCAAGATGACTGATGTGT，THF，CTTGACAGCGACACCTT和C3间臂；

(2)提取待测样品DNA；

(3)以待测样品的DNA为模板，采用步骤一设计的引物和探针进行ERA反应，得到ERA扩增产物并检测荧光信号强度。

优选的，步骤(3)中，ERA检测程序为：32℃-45℃反应30min。

优选的，步骤(3)中，ERA检测程序为42℃反应30min。

优选的，ERA检测结果判定方法为：

若ERA扩增产物满足如下条件：在ERA扩增的20min内扩增曲线的荧光值出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即待测病毒为白斑综合症病毒；

若ERA扩增产物不满足上述条件：则表明扩增结果显示为阴性，即待测病毒不为白斑综合症病毒。

优选的，在THF左右分别加入一个荧光基团和一个猝灭基团。

优选的，荧光基团和猝灭基团分别为FAM和BHQ1。

优选的，检测的靶基因为VP28基因。

另一方面，本发明提供一种用于白斑综合症病毒快速检测的试剂盒，该试剂盒包括前述的上游引物、下游引物和探针。

优选的，所述试剂盒中还包括溶解剂、激活剂和荧光扩增试剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的白斑综合症病毒的ERA引物和探针可以有效扩增靶基因，灵敏度达到10

本发明方法摆脱了PCR过程中对热循环仪的依赖，实验操作步骤简单，耗时短速度快，检测灵敏度高。

本发明方法不仅可用于白斑综合症病毒感染的现场快速检测，也为病原体的现场筛查提供了可用的快速检测方法。该方法也可应用到临床检验、海关违禁生物检测、企业质检等领域，为其提供技术支持，具有明显的实际应用价值。

附图说明

图1.白斑综合症病毒在6个不同温度下的ERA扩增曲线。分别为32℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃；NC为阴性对照。

图2.白斑综合症病毒ERA扩增体系的特异性检测。其中包含白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、肝肠胞虫(EHP)以及健康对虾DNA。

图3.白斑综合症病毒ERA扩增体系的灵敏性检测。其中，模板量分别为10

图4.白斑综合症病毒nest PCR扩增体系的灵敏性检测。其中，模板量分别为10

图5.白斑综合症病毒qPCR扩增体系的灵敏性检测。其中，模板量分别为10

图6.白斑综合症病毒6对ERA引物筛选。其中，泳道1-6分别为ERA-VP28-F1/ERA-VP28-R1，ERA-VP28-F2/ERA-VP28-R2,ERA-VP28-F/ERA-VP28-R,ERA-VP28-F3/ERA-VP28-R3，ERA-VP28-F4/ERA-VP28-R4，ERA-VP28-F5/ERA-VP28-R5；7为阴性对照；M为DL2000Marker。

图7.白斑综合症病毒3对ERA引物筛选。分别为ERA-VP28-F2/ERA-VP28-R2,ERA-VP28-F/ERA-VP28-R，ERA-VP28-F4/ERA-VP28-R4。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

下述实施例中所使用的实验方法无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中核酸释放剂和ERA荧光型核酸扩增试剂盒是苏州先达基因科技有限公司的产品，产品货号为KS103。

实施例1白斑综合症病毒的ERA检测引物和探针及其检测方法

一、白斑综合症病毒的ERA检测引物和探针的设计及合成

下载白斑综合症病毒全基因组序列，使用GeneDoc软件进行序列比对分析选取种内保守、中间特异的囊膜蛋白(VP28)基因区段(Gen Bank登录号：AF380842.1)作为检测靶基因。

本发明ERA反应的引物不同于常规PCR引物设计。按照如下要求设计白斑综合症病毒的ERA检测引物和探针：(1)上游引物5’末端设计为腺嘌呤，下游引物5’末端设计为胸腺嘧啶，从而有利于重组酶细丝的形成；(2)上游引物3’末端设计为胞嘧啶，下游引物3末端设计为腺嘌呤，为PCR提供稳定的夹持靶标。为了用荧光法检测ERA扩增产物，我们设计了一种exo探针专门用于检测扩增子。探针长度46-52bp，并插入THF(四氢呋喃)作为外切酶exo的切断位点，其中THF位点的5’端至少30nt，3’端至少15nt，在THF左右分别加入一个荧光基团和一个猝灭基团。3’端加入C3-space阻断基团。荧光基团和猝灭基团选择常用的FAM和BHQ1。

根据上述引物设计要求，设计的引物如下：

上游引物ERA-VP28-F:5’-ACAACACTGTGACCAAGACCATCGAAACCC-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物ERA-VP28-R:5’-TCCGCATCTTCTTCCTTCATCTGTGCATCA-3’(SEQ ID NO.2)

根据上述探针设计要求，设计的探针如下：

ERA-VP28-Probe:TTGGATCAGGCTACTTCAAGATGACTGATGTGT(SEQ ID NO.3)-THF-CTTGACAGCGACACCTT(SEQ ID NO.4)(C3-space)

上述探针中，序列3自5’端起最后一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了FAM荧光报告基团的胸腺嘧啶核苷酸(FAMdT)，序列4自5’端起第二位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了BHQ1荧光猝灭基团的胸腺嘧啶核苷酸(BHQ1dT)；THF(四氢呋喃)为外切酶exo的切断位点，C3-space：序列4的3’端用C3封闭以阻断延伸，阻止3’端exo外切酶和聚合酶发挥作用。

上述引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

二、白斑综合症病毒的ERA检测方法

以待测样品的基因组DNA为模板，采用步骤一设计的引物和探针进行ERA反应，得到ERA扩增产物并检测荧光信号强度。具体步骤如下：

ERA检测体系为：上下游引物(10μM)各1μL，探针(10μM)0.6μL，溶解剂(ERA荧光型核酸扩增试剂盒提供，产品货号为KS103)20μL，DNA模板1μL，ddH

若ERA扩增产物满足如下条件：在ERA扩增的20min内扩增曲线的荧光值出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即待测病毒为白斑综合症病毒；

若ERA扩增产物不满足上述条件：则表明扩增结果显示为阴性，即待测病毒不为白斑综合症病毒。

实施例2ERA反应温度的优化

在32℃-45℃温度范围内，为了确定ERA扩增反应的最适温度，将白斑综合症病毒重组质粒进行10倍梯度稀释，选择10

结果如图1所示。结果表明，ERA反应体系在32℃-45℃温度范围内，均可成功扩增白斑综合症病毒的VP28基因，说明该ERA体系具有较宽的扩增反应温度范围。

实施例3白斑综合症病毒的ERA引物和探针的特异性检测

分别以白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、肝肠胞虫(EHP)以及健康对虾DNA作为模板，采用实施例1步骤二的白斑综合症病毒的ERA检测方法检测实施例1的ERA引物和探针的特异性。

结果如图2所示。实验结果表明实施例1设计的引物和探针均可特异地扩增靶基因，且与IHHNV、Vibrio parahaemolyticus、EHP以及健康对虾DNA均无交叉反应，说明本发明设计的引物和探针具有较好的特异性。

实施例4白斑综合症病毒的ERA方法与nest PCR、qPCR方法灵敏度比较

1、白斑综合症病毒ERA检测

采用实施例1的步骤二中白斑综合症病毒的ERA检测方法，以10倍梯度稀释白斑综合症病毒重组质粒作为模板(模板量分别为10

2、白斑综合症病毒nest PCR检测

根据OIE(世界动物卫生组织)推荐的nest PCR检测方法进行实施，以10倍梯度稀释白斑综合症病毒的SalI重组质粒作为模板(模板量分别为10

表1.nest PCR一轮和二轮引物序列

表2.nest PCR第一轮反应体系

表3.nest PCR第一轮反应程序

表4.nest PCR第二轮反应体系

表5.nest PCR第二轮反应程序

3、白斑综合症病毒qPCR检测

根据OIE推荐的qPCR检测方法进行实施，以10倍梯度稀释白斑综合症病毒的SalI重组质粒作为模板(模板量分别为10

表6.qPCR引物和探针序列

注：6-FAM：荧光报告基团；TAMRA-N：荧光猝灭基团。

表7.qPCR反应体系

表8.qPCR反应程序

ERA、nest PCR和qPCR扩增结果如图3、图4、图5所示。经分析可得，白斑综合症病毒的ERA方法可达到与nest PCR和qPCR相似的灵敏度，达到10

实施例5白斑综合征病毒ERA引物的筛选

根据上述引物设计要求，设计的6对引物如下：

上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以待测样品的基因组DNA为模板，采用基础型ERA和荧光型ERA先后进行引物筛选。具体步骤如下：

基础型ERA检测体系为：上下游引物(10μM)各2μL，溶解剂(ERA基础型核酸扩增试剂盒提供，产品货号为KS101)20μL，DNA模板1μL，ddH

结果如图6所示。结果表明，6对引物在42℃下，均可成功扩增白斑综合症病毒的VP28基因，且引物对ERA-VP28-F2/ERA-VP28-R2,ERA-VP28-F/ERA-VP28-R,ERA-VP28-F4/ERA-VP28-R4扩增效率最好。

通过荧光型ERA，采用实施例1所述探针对3对引物(ERA-VP28-F2/ERA-VP28-R2,ERA-VP28-F/ERA-VP28-R,ERA-VP28-F4/ERA-VP28-R4)进一步筛选，具体步骤如下：

荧光型ERA检测体系为：上下游引物(10μM)各1μL，探针(10μM)0.6μL，溶解剂(ERA荧光型核酸扩增试剂盒提供，产品货号为KS103)20μL，DNA模板1μL，ddH

结果如图7所示。结果表明，3对引物在42℃下，均可成功扩增白斑综合症病毒的VP28基因，且引物对ERA-VP28-F/ERA-VP28-R扩增效率最好。

另外，进一步研究表明采用引物对ERA-VP28-F/ERA-VP28-R的灵敏度可达到10

上述内容仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。