水稻幼芽期耐冷基因CTES11b的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于水稻耐冷遗传改良和耐冷分子辅助育种领域，具体涉及一种水稻幼芽期耐冷基因CTES11b的分子标记及其在水稻耐冷遗传改良中的应用。

背景技术

近年来，我国的水稻生产发生了较大的变化。一方面，生产目标从追求产量向降低成本、提高经济效益转变；另一方面，随着我国经济的快速发展，农村主要劳动力向城镇转移，农村劳动力紧缺已成为水稻生产发展的主要限制因素。在这样的背景下，直播由于省时、省工和节约成本，深得农民的欢迎，并迅速推广。据不完全统计，水稻直播面积在安徽省已达56.7万公顷，湖北省为49万公顷，江西省为43.3万公顷，江苏省为69.3万公顷，浙江省为37.3万公顷，广东省为10万公顷，黑龙江省的直播稻面积为40万公顷(陈品等，2013；张喜娟等，2016)。华南双季稻区早稻直播和东北高寒稻区的早粳稻直播往往会遇到春季低温天气，造成缺苗断垄，导致严重减产。这就要求用于直播的水稻种子有较强的幼芽期耐低温能力。而上述稻作区一直以育秧移栽为主，幼芽期耐低温能力长期不作为育种目标，致使许多高产、优质的水稻品种由于芽期耐低温能力弱而不能用作直播稻，限制了直播稻的生产。

培育幼芽期耐冷品种是水稻育种，尤其是直播稻品种选育中的一个重要目标。传统育种方法费时、费力、表型鉴定困难、育种效率低，由于幼芽期耐冷性是典型的数量性状，涉及多个基因位点，且与环境间存在互作效应，使得幼芽期耐冷遗传改良苦难。利用幼芽期耐冷基因及与其紧密连锁的分子标记，开展分子标记辅助选择育种可以有效地解决这一问题。截止目前，已有部分控制幼芽期耐冷的基因位点被定位(严长杰等，1999；Zhang et al，2005；Takeuchi et al,2007；乔永利等，2005；陈玮等，2005；张露霞等，2007；巩迎军等，2009；林静等，2010；周勇等,2013；杨洛淼等，2014；朱金燕等，2015；Yang et al，2016；姜树坤等，2020)。也报道了有一些连锁标记信息，但交换率偏高，选择效果不良。同时，少数紧密连锁的标记属于测序获得的SNP信息，没有转换为紧密连锁标记，因此，针对幼芽期耐冷基因位点的辅助分子标记和标记在水稻分子育种中应用的报道和专利很少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：提供一个水稻幼芽期耐冷基因CTES11b的分子标记及其在水稻耐冷遗传改良中的应用。

本发明的技术方案为：与水稻幼芽期耐冷基因CTES11b紧密连锁的InDel标记，该InDel标记的序列为AGGCTACGCACCAATCT；定位于SEQ ID No.2所示核苷酸序列的第203至221碱基之间，当第203至221碱基之间的序列缺失时，具有水稻幼芽期耐冷基因CTES11b，表现为耐冷。

检测上述InDel标记的引物对。

进一步地，所述引物对的的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

一种试剂盒，含有上述所述的引物对。

上述所述的InDel标记或引物对或试剂盒在水稻幼芽期耐冷性状辅助育种上的应用。

一种检测水稻是否含有水稻幼芽期耐冷基因CTES11b的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检测水稻的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，根据所述InDel分子标记上下游序列设计引物对进行PCR扩增；

(3)对扩增产物进行检测分析，如果扩增产物中对应InDel位点缺失AGGCTACGCACCAATCT序列，则存在水稻幼芽期耐冷基因CTES11b，表现为耐冷。

进一步地，所述引物对的的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；若能扩增出291bp的片段，检测材料携带水稻幼芽期耐冷基因CTES11b；若能扩增出308bp的片段，检测材料不携带水稻幼芽期耐冷基因CTES11b。

一种水稻幼芽期耐冷基因CTES11b的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述所述的分子标记在水稻幼芽期耐冷基因CTES11b辅助育种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明鉴定到第11染色体上的幼芽期耐冷基因CTES11b以及可对其进行基因型鉴别的共显性分子标记。

2、通过幼芽期耐冷基因CTES11b标记的辅助筛选，能够获得幼芽期耐冷能力显著提高的水稻品种或材料。

3、本发明的分子标记可用于“丽江新团黑谷”、“空育131”及二者为亲本之一的杂交后代和相关衍生材料杂交后代育种群体的幼芽期耐冷基因型选择，可有效地鉴别带有该基因的耐冷个体，便于及时的杂交转育，提高育种效率，加快育种进程。

附图说明

图1是本发明实施例中CTES11b分子标记的检测结果示意图；

图中标记说明：M：分子标记标准；1：沈农265；2：空育131；3：九稻35；4-12：芽期耐冷性弱的F

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

1、水稻幼芽期耐冷基因CTES11b的发现与分子标记

“丽江新团黑谷”和“空育131”是幼芽期耐冷的代表性水稻种质资源，以幼芽期耐冷性强的“丽江新团黑谷”为父本，以高产、抗病的品种“沈农265”为母本进行杂交，利用单粒传法获得包含144个株系的F

该InDel位于SEQ ID No.2所示核苷酸序列的第203和221碱基之间；当第203和221碱基之间的序列AGGCTACGCACCAATCT缺失时(如SEQ ID No.1所示)，具有水稻幼芽期耐冷基因CTES11b，表现为耐冷。根据该InDel上下游信息，可以设计各种不同的引物对对该InDel进行检测。

2、进行水稻CTES11b基因型鉴别的共显性分子标记开发与验证

根据前期的定位结果和序列差异设计了与幼芽期耐冷基因CTES11b紧密连锁的InDel分子标记CTB11-1引物(上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ IDNo.4所示)。将这个标记应用于“丽江新团黑谷”和“沈农265”的育种后代群体中进行验证：

(1)采用常规的CTAB法提取基因组DNA。

(2)以基因组DNA为模板，以InDel分子标记CTB11-1为引物进行PCR扩增；PCR扩增体系为15μL，含50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH 8.8),0.1％ Triton-X,1.5mM MgCl

(3)PCR扩增产物经3.5％的琼脂糖凝胶电泳分离。

(4)凝胶成像系统观察并记录结果。

携带幼芽期耐冷基因CTES11b的后代材料(耐冷等级1-3级)能够扩增出291bp的条带，而不具有幼芽期耐冷基因CTES11b的后代(耐冷等级5-7级)能够扩增出308bp的条带。可以看出，这个分子标记引物可以用于鉴定待测材料是否含有幼芽期耐冷基因CTES11b。而这个291bp的扩增产物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)可以作为水稻幼芽期耐冷基因CTES11b的分子标记。

3、水稻幼芽期耐冷基因CTES11b的分子育种应用

通过测序和鉴定分析等确定了耐冷种质“空育131”中也含有幼芽期耐冷基因CTES11b，且利用分子标记CTB11-1检测可以扩增出291bp的条带。因此，本专利也包含利用“空育131”或“空育131“衍生后代为亲本，与不含该基因的待改良品种进行杂交，之后进行杂交或回交，再利用本发明的分子标记进行辅助选择，把幼芽期耐冷基因CTES11b转育到待改良育种材料中。

具体步骤：在“空育131”杂交后代或其衍生材料的杂交后代中，利用本发明的分子标记进行跟踪选择或在稳定材料中进行辅助决选，直至育种材料稳定。

下面结合实施例对本发明进行进一步说明：

以“空育131”为父本，“九稻35”为母本进行杂交，利用本发明的分子标记对F