SlEIN4基因在调控番茄果实性状中的应用、载体及载体的应用

技术领域

本发明涉及SlEIN4基因在调控番茄果实性状中的应用、载体及载体的应用，属于生物技术领域。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)番茄又名西红柿、洋柿子，是茄科番茄属1年生或多年生草本植物，原产于南美洲，是世界上栽培最为普遍，也是最重要的蔬菜之一。我国的番茄种植面积和产量位居世界前列，番茄在我国蔬菜生产和消费中占有重要地位。

番茄果实硬度是影响番茄果实加工或储存等的重要因素，提高番茄的硬度更有利于储存，延长货架期；降低番茄的硬度更方便加工成番茄酱等。而番茄果实的形状与果实大小和外观品质等性状有重要的联系，长果形番茄相较于圆果形番茄在机械化采收及后续的运输方面有着先天的优势，同时长果形番茄能够满足不同消费者的需求。因此，精确地培养不同品种的番茄不仅有利于番茄的加工和储存，还能充分满足消费者需求的多元化。

SlEIN4(Solyc04g064840.1.1)是番茄中的一个乙烯受体基因，是乙烯调控路径的重要参与基因，与果实成熟调控直接相关。但是已有的研究中只关注SlEIN4基因在果实成熟中的应用，并未有研究说明SlEIN4基因与果实硬度和果形的关系。

发明内容

本发明的第一个目的是提供SlEIN4基因在调控番茄果实性状中的应用，通过控制番茄SlEIN4基因的表达量，控制番茄果实的硬度和果形，满足不同消费者需求的同时，也提高了经济效应。

本发明的第二个目的是提供一种重组表达载体。

本发明的第三个目的是提供一种基因编辑载体。

本发明的第四个目的是提供上述重组表达载体和基因编辑载体在调控番茄果实性状中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

SlEIN4基因在调控番茄果实性状中的应用，所述SlEIN4基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述番茄果实性状为番茄果实的硬度和果形。

本发明首次验证了SlEIN4基因有调控番茄果实硬度和果形方面的功能，对于番茄品种的精确培育有重要作用。

优选地，通过遗传转化手段将番茄基因组中的SlEIN4基因过表达，番茄果实的硬度降低；番茄基因组中的SlEIN4基因抑制表达，番茄果实硬度提高，果形变尖且细长。

实验证实，与对照株系相比，SlEIN4基因过表达株系番茄果实硬度降低，SlEIN4基因编辑株系番茄果实硬度显著升高，果实形状明显变尖且细长。表明SlEIN4基因可以调控番茄果实的硬度和果形。

进一步优选地，所述番茄基因组中的SlEIN4基因过表达是构建SlEIN4过表达载体，对SlEIN4基因进行过表达。

进一步优选地，所述过表达载体的构建方法为将获得的SlEIN4基因连接至到pHellsgate8载体上，测序鉴定。

具体地，过表达载体的构建方法为以pHellsgate8为终载体，构建具有CaMV35S重组型过表达启动子的pGate8-SlEIN4载体，利用同源重组反应将SlEIN4基因序列连接到pHellsgate8终载体上。

优选地，所述番茄基因组中的SlEIN4基因抑制表达是构建基因编辑载体，对SlEIN4基因进行敲除。

进一步优选地，所述基因编辑载体的构建方法为将根据SlEIN4基因设计合成的靶位点双链DNA连接至CP098载体上，测序鉴定。

具体地，通过对番茄乙烯受体基因SlEIN4进行基因编辑，编辑后SlEIN4基因序列发生碱基突变，并造成了氨基酸突变，获得SlEIN4定向突变的番茄植株。

优选地，所述番茄的品种为Micro Tom。

Micro Tom该品种植株矮小，生命周期更短，具有节省研究空间、缩短研究时间的优势。

重组表达载体，所述重组表达载体中包含SlEIN4基因；所述SlEIN4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明证明在番茄中过表达SlEIN4基因，可以降低番茄果实的硬度，因此可以通过构建得到的重组表达载体过表达SlEIN4基因，进而降低番茄果实的硬度。

基因编辑载体，其特征在于：所述基因编辑载体中包含根据SIEIN4基因所设计的靶位点敲除序列；所述SlEIN4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明证明在番茄中抑制SlEIN4基因的表达，可以提高番茄的硬度，改变番茄的果实形状，因此可通过基因编辑载体构建SlEIN4基因缺失的转基因突变株，提高番茄果实的硬度并改变果实的形状。

重组表达载体和基因编辑载体在调控番茄果实性状中的应用。

SlEIN4基因过表达的番茄植株，其果实硬度降低；SlEIN4基因敲除的番茄植株，其果实硬度明显提高，果形变尖且细长，为精确控制番茄果实的硬度和果实形状，满足不同消费者的需求有重要意义。

附图说明

图1为本发明实验例1中SlEIN4基因在野生型番茄植株各组织的表达量；

图2为本发明实验例3中SlEIN4基因重组表达载体pGate8-SlEIN4的载体图谱；

图3为本发明实验例4中SlEIN4基因编辑载体CP098-SlEIN4的载体图谱；

图4为本发明实验例5中SlEIN4基因过表达和基因编辑株系果实中SlEIN4基因的表达量(WT代表未转基因的野生型番茄，OE-18和OE-19代表SlEIN4的两个过表达株系，CR-11和CR-12代表SlEIN4的两个基因编辑株系；星号代表株系与对照具有显著差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)；

图5为本发明实验例6中SlEIN4基因过表达和基因编辑株系与野生型番茄果实成熟进程对比图；

图6为本发明实验例6中SlEIN4基因编辑果实的果形变化的图(A、B是野生型番茄果实，C、D是SlEIN4基因过表达果实，E、F是SlEIN4基因编辑果实)；

图7为本发明实施例实验例6中SlEIN4基因过表达株系果实和SlEIN4基因编辑株系果实果形指数统计图(星号代表株系与对照具有显著差异，*P<0.05)；

图8为本发明实验例6中SlEIN4基因过表达株系果实和SlEIN4基因编辑株系果实在红熟时期的果实硬度统计图(星号代表株系与对照具有显著差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若无特殊说明，实施例中所用的各类试剂、仪器等均为市售商品。

下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：

生物材料：

Micro Tom番茄，种植在河南农业大学园艺学院。

SlEIN4基因在调控番茄果实性状中的应用的实施例1

本实施例中通过在番茄中稳定的过表达SlEIN4基因，进而番茄的果实硬度下降；通过敲除番茄中SlEIN4基因，抑制SlEIN4基因的表达，进而番茄的果实硬度上升，果形变尖且细长。

重组表达载体的实施例1

本实施例中的重组表达载体包含SlEIN4基因；所述SlEIN4基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

基因编辑载体的实施例1

本实施例中的基因编辑载体包含根据SlEIN4基因所设计的靶位点敲除序列；所述SlEIN4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

重组表达载体的应用的实施例1

本实施例中将包含SlEIN4基因的过表达载体转入番茄植株中，在番茄中稳定的过表达SlEIN4基因，构建获得了SlEIN4基因过表达的番茄株系，该番茄株系的番茄果实硬度下降。

基因编辑载体的应用的实施例1

本实施例中基因编辑载体为CRISPR/Cas9载体，将该载体转化番茄植株后，构建获得了SlEIN4基因敲除的番茄株系，该番茄株系的番茄果实硬度上升，果形变尖且细长。

实验例1番茄SlEIN4基因表达量的检测

采集番茄(Micro Tom)不同组织、器官，利用荧光定量PCR对SlEIN4基因的表达模式进行了分析，相关实验过程如下所示。

用Primer Premier 5.0设计QRT-PCR的特异性引物，引物序列如下：

Q-SlEIN4-F:5’-AAGCATGTTTCTTTACCATACCACC-3’(序列如SEQ ID NO:3所示)；

Q-SlEIN4-R:5’-CATCAACCTTTCTATTATCGCCAGT-3’(序列如SEQ ID NO:4所示)。

分别提取野生型番茄各组织的RNA，反转录后，做QRT-PCR分析，同时以番茄内参基因Q-actin作为对照，内参基因Q-actin的扩增引物为Q-actin-F和Q-actin-R。

Q-actin-F:5’-GTCCTCTTCCAGCCATCCAT-3’(序列如SEQ ID NO:5所示)；

Q-actin-R:5’-ACCACTGAGCACAATGTTACCG-3’(序列如SEQ ID NO:6所示)。

QRT-PCR扩增反应体系：AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5ul，cDNA4.2ul，上下游引物各0.4ul，共10ul。QRT-PCR反应程序参考仪器规范操作。

参照2

实验例2番茄SlEIN4基因全长序列的获取

SlEIN4基因的克隆及获取过程如下所示。

用Primer Premier 5.0设计全基因扩增引物，设计特异性引物SlEIN4-F和SlEIN4-R，引物序列如下：

SlEIN4-F：5’-ATGGCGGCAGTAGGTATTGT-3’(序列如SEQ ID NO:7所示)；

SlEIN4-R：5’-CTATGTTCTCTTCTCATCACCCATC-3’(序列如SEQ ID NO:8所示)。

取种植在河南农业大学园艺学院温室的野生型番茄Micro Tom(MT)叶片cDNA为模版(cDNA的提取方式为常规技术，例如可参照中国发明专利CN104561025A中公开的cDNA提取方法)，利用上述引物，利用PrimerSTAR高保真酶PCR扩增SlEIN4片段。

PCR扩增反应体系、PCR反应程序分别如表1、表2所示，将获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后将扩增条带用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行回收，所得SlEIN4基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

表1 PCR扩增反应体系

表2 PCR反应程序

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实验例3重组表达载体的构建

为进一步了解SlEIN4基因在调控番茄性状中的作用，构建了重组表达载体，用于在番茄植株中过表达SlEIN4基因，下面就构建过程简要介绍如下。

首先构建具有CaMV35S重组型过表达启动子的pGate8-SlEIN4载体，利用同源重组反应(利用同源重组试剂盒(

反应后将上述同源重组反应的产物42℃热激转入大肠杆菌DH5α感受态中。通过壮观霉素筛选后，再用菌落PCR筛选出带有目的片段的pHellsgate8重组质粒(目的片段满足大小为1000bp左右条带的即为pHellsgate8重组质粒)，测序鉴定。用DNAMAN软件分析测序结果。正确转化子命名为pGate8-SlEIN4，载体图谱如图2所示。

实验例4基因编辑的载体构建

为进一步了解SlEIN4基因在调控番茄性状中的作用，构建了用于敲除SlEIN4基因的CRISPR/Cas9表达载体，下面就构建过程简要介绍如下。

根据番茄SlEIN4基因的序列和CRISPR/Cas9系统的识别特点设计SlEIN4基因的靶点，sgRNA靶点序列如下：

靶点一：TCGTGAAGGCAAGCCATGCA(序列如SEQ ID NO:9所示)；

靶点二：TAAGGGCGTTGGCTTTTCCA(序列如SEQ ID NO:10所示)。

注：同时使用两个靶点，突变位点在第二个靶位点附近。

根据所设计靶点合成引物，以CP043质粒为模板进行扩增，扩增引物序列为：

CS-Fw：

AATCTAACAGTGTAGTTTGTCGTGAAGGCAAGCCATGCAGTTTTAGAGCTAGAAAT AGC(序列如SEQ ID NO:11所示)；

CS-Rv：

CTATTTCTAGCTCTAAAACTGGAAAAGCCAACGCCCTTACAAACTACACTGTTAGA TTC(序列如SEQ ID NO:12所示)。

将所扩增片段连接至CP098载体，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，通过挑取阳性克隆、扩大培养，提取质粒后，经测序鉴定确认载体构建成功命名为CP098-SlEIN4，载体图谱如图3所示。

实验例5番茄转基因株系的构建与检测

将实验例3构建的重组表达载体和实验例4构建的基因编辑载体分别转化农杆菌，并进而转化番茄植株，构建SlEIN4基因过表达的番茄植株和SlEIN4基因敲除的番茄植株，验证阳性后，将T1代(转化植株长大结种后，用种子培养长大的植株)种子播种培养，检测后选择SlEIN4基因过表达和敲除的番茄植株进行后续性状研究，具体实验过程如下所示。

将重组表达载体pGate8-SlEIN4或基因编辑载体CP098-SlEIN4结合转移至农杆菌GV3101，并进行番茄子叶侵染，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗。

利用PCR和QRT-PCR验证阳性的转基因番茄植株，并将阳性转基因番茄植株的T1代种子播在卡那霉素(50mg/L)的培养基上发芽，满足种子在卡那霉素(50mg/L)的培养基上长侧根与未长侧根的分离比符合3：1，且基因表达量升高两倍以上条件的属于过表达，选取基因转录水平较高的2个过表达株OE-18、OE-19作为研究对象，SIEIN4基因表达株OE-18、OE-19中SlEIN4基因的表达情况如图4所示。

利用基因测序验证SlEIN4基因编辑植株，找到氨基酸序列发生改变即基因被编辑植株作为研究对象，SIEIN4基因编辑株CR-11、CR-12中SlEIN4基因的表达情况如图4所示。

实验例6番茄转基因株系性状研究

培养实验例5获得的过表达番茄植株和敲除番茄植株，进行后续果实性状研究，具体实验过程如下所示。

1、转基因株系果实成熟及果实果形研究

SlEIN4基因过表达株系和基因编辑株系与野生型番茄花期标记后35天果实到达绿熟期(MG)，果实顶端变红时到达破色期(B)。通过表型的观察和统计，野生型番茄从花期标记到果实破色期平均天数约37天，SlEIN4基因过表达株系(OE-18)花期标记到果实破色期平均天数约39天，SlEIN4基因编辑株系株系(CR-11)从花期标记到果实破色期平均天数约31天。结果表明，SlEIN4基因过表达延缓番茄果实成熟，SlEIN4编辑促进番茄果实成熟，如图5所示。

SlEIN4基因编辑株系果实从幼果起发生形状变化，果实对比野生型果实果尖明显且细长，如图5、图6所示。用数显游标卡尺测量红熟时期的果实纵径(果基到果顶的长度)和果实横径(果实最粗处的直径)，计算果形指数(果形指数＝果实纵径/果实横径)，果形指数如图7所示。结果证明，SlEIN4基因影响番茄果实的形状，与对照组相比，敲除SlEIN4基因后番茄果实明显变长。

2、转基因番茄果实硬度研究

野生型和转基因材料种植在河南农业大学园艺学院同一温室中，待番茄植株长出四穗花序进行花期标记，每个花序疏花至只有四个果实，花后35天不再继续膨大全部绿色果实为绿熟期(Mature green，MG)，绿熟期3天后果实顶端变红为破色期(Breaker，B)，破色期3天后为黄熟期(Yellow，Y)，黄熟期7天后为红熟期(Red ripe，R)。

摘取野生型和转基因材料同一结位的无明显机械损伤的选特定时期果实，每个果实使用仪器TA.XTplus(Godalming，UK)在果实赤道部分均分测定四点，每次测定25个左右的生物学重复，每个测定点用直径5mm金属探头，测定深度为5mm，测定速度为10mm/s(以扎透果皮为标准)。以果实能承受的最大力作为衡量番茄果实硬度的指标，单位为牛顿(N)。

结果如图8所示，SlEIN4基因过表达株系OE-18和OE-19的番茄果实硬度降低，SlEIN4基因编辑株系CR-11和CR-12的番茄果实硬度显著升高。由此可以证明：SlEIN4基因可以调控番茄果实硬度，降低SlEIN4基因表达量能显著提高番茄果实硬度。

综上所述，本发明证明通过调控乙烯受体基因SlEIN4基因的表达，可以调控番茄果实的硬度和果形。实验证实，与对照株系相比，SlEIN4基因过表达株系番茄果实硬度降低，SlEIN4基因编辑株系番茄果实硬度显著升高，果实形状明显变尖且细长。

最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。