磷素活化剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及肥料领域，尤其涉及磷素活化剂及其制备方法和应用。

背景技术

磷素作为作物生长必需的肥料三要素之一，可以促进根系发展以提高作物产量，保障国家粮食安全。研究表明，上世纪70年代中期，我国农田磷素开始由亏缺转为平衡或略有盈余。自此以后，全国农田磷素转为稳定的盈余状态。其中，设施农业中大量磷肥和有机肥的投入，是造成我国农田磷素盈余的主要原因。研究表明，长期过量施用化肥容易造成土壤板结、土壤肥力下降，最终导致农作物产量和品质下降。

有机酸可以通过促进高稳定性磷向活性磷的转化，提高土壤中的有效磷含量10～1000倍，从而提高作物根系对磷的吸收利用。有机酸种类丰富，具有磷素活化效果的有机酸包括低分子量有机酸中的草酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸和特殊有机酸(氨基酸、吲哚乙酸)等，高分子量有机酸中的氨基酸、吲哚乙酸、腐植酸等。这些有机酸具有较强的络合能力，并与阴离子竞争吸附点位，减少磷素的固定。在果品加工中会产生大量的果渣、果皮等，直接丢弃或就地处理会造成环境污染和资源浪费。果实中富含丰富的有机酸，发酵后的果渣、果皮含有乳酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、酒石酸和琥珀酸等。其中柠檬酸主要分布在柑橘类果实、树莓、草莓、菠萝、石榴、刺梨等果实中；苹果酸主要分布在苹果等仁果类果实中，而在李、樱桃、杏、桃、香蕉等果实中柠檬酸和苹果酸均等。但也有少数水果例外，如葡萄主要含酒石酸。果实中的含酸量及相对比例因种类和品种不同而异，一般为0.3％～0.5％。研究认为有机酸活化土壤磷素的能力为柠檬酸>草酸>酒石酸>苹果酸，有机酸浓度越高，对土壤磷素活化效果越好。

我国畜牧业在过去二十多年时间里得到了迅猛发展，养殖规模化显著提高，这导致了大量粪肥的产生。据全国畜牧总站调查资料显示，我国每年的畜禽粪污排放量大约为38亿t，其中生猪粪污年产生量18亿t、牛粪污年产生量约14亿t(肉牛10亿t、奶牛4亿t)、家禽粪污年产生量约6亿t。国内外广泛采用了种养循环结合方法，将粪肥直接施用还田，或者经过沼气工程、堆肥处理等措施将其还田这使得我国集约化养殖场的粪肥大多数进入了与其在空间分布上具有匹配性的蔬菜生产体系。在我国集约化设施菜田中，粪肥投入的养分达到了400～800kg/hm

多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)是一类产芽胞的革兰氏阳性细菌，对植物非致病性同时具有防病作用和促生作用。多粘类芽孢杆菌可防治卵菌门2个属、真菌门24个属、细菌门6个属的病原菌引起的多种土传病害和叶面病害。多粘类芽孢杆菌产生的多粘菌素破坏革兰氏阴性细菌细胞质膜的通透性，致使胞内物质泄漏从而起到杀菌作用。多粘类芽孢杆菌产生细胞壁降解酶类，如β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等，另外产生杀镰孢菌素，共同作用抑制植物病原真菌的生长与增殖，还产生吲哚乙酸、生长素、赤霉素、细胞分裂素、茉莉酸甲酯等植物激素，这些植物激素可以促进植物生长及增强植物免疫力。

目前市场上的磷素活化剂功能局限于活化土壤磷素、促进作物生长和提高作物抗性等方面，有的磷素活化剂中会加入有益微生物发酵菌来抑制土传病害，但涉及到的作物病害种类单一，不具有普适性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了磷素活化剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种具有抑菌作用的土壤磷素活化剂，该土壤磷素活化剂能改善土壤环境，预防由微生物引起的土传病害，同时能够提高富磷菜地中磷素的循环与周转，促进磷素生物有效性。添加磷素活化物质，能有效的解决外源磷素吸附、固定在土壤中导致的生物有效性不高的问题；抑菌微生物选自多粘类芽孢杆，其具有解磷和广谱抑制植物病原菌并促进植物生长作用的杀菌剂，能有效防治菜田作物常见土传病害，且上述磷素活化物质的添加可使其杀菌效果显著增强。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了磷素活化剂，包括：聚谷氨酸、发酵果渣、油菜假单胞菌和多粘类芽孢杆菌。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂，以重量份数计，包括如下组分：聚谷氨酸15～30份、发酵果渣10～20份、油菜假单胞菌40～60份和多粘类芽孢杆菌1～10份。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂，以重量份数计，包括如下组分：

聚谷氨酸20份、发酵果渣20份、油菜假单胞菌55份和多粘类芽孢杆菌1份；或

聚谷氨酸25份、发酵果渣15份、油菜假单胞菌50份和多粘类芽孢杆菌10份；或

聚谷氨酸30份、发酵果渣10份、油菜假单胞菌60份和多粘类芽孢杆菌5份；或

聚谷氨酸15份、发酵果渣15份、油菜假单胞菌40份和多粘类芽孢杆菌10份；或

聚谷氨酸15份、发酵果渣20份、油菜假单胞菌55份和多粘类芽孢杆菌10份。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述发酵果渣经废弃果渣破碎处理后，与葡萄糖混合，调节pH值，与发酵菌混合后发酵获得。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述葡萄糖的浓度为15％(质量百分比)。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述调节pH值至4.5。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述发酵的时间为72h，温度为28℃。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述发酵菌包括0.5％尚川酵素发酵菌。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述发酵果渣包括：柠檬酸、苹果酸、乙酸或乳酸中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述发酵果渣包括：13.76g/L柠檬酸、6.25g/L苹果酸、58.29g/L乙酸或1.19g/L乳酸中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述油菜假单胞菌的活菌数为150～200亿CFU/mL；所述多粘类芽孢杆菌的活菌数为150～200亿CFU/mL。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述油菜假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.6774。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述油菜假单胞菌的活菌数为10

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.22938。

在本发明的一些实施方案中，上述磷素活化剂中，所述多粘类芽孢杆菌的活菌数为10

本发明还提供了磷素活化剂的制备方法，取所述聚谷氨酸和所述发酵果渣干燥、研磨、过筛、溶解后，与所述油菜假单胞菌的菌悬液和所述多粘类芽孢杆菌的菌悬液混合，获得所述磷素活化剂。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述发酵果渣的制备方法包括如下步骤：取废弃果渣破碎处理后，与葡萄糖混合，调解pH值，与发酵菌混合发酵后，获得所述发酵果渣。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述葡萄糖的浓度为15％。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述调解pH值至4.5。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述发酵的时间为72h，温度为28℃。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述发酵菌包括0.5％尚川酵素发酵菌。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述油菜假单胞菌的菌悬液的制备方法包括如下步骤：

S1：取所述油菜假单胞菌培养后，获得种子液；

S2：取所述种子液发酵培养后，冷冻浓缩，离心，收集沉淀后，复溶，获得所述油菜假单胞菌的菌悬液；

S1中所述培养的温度为25～28℃，时间为12～16h；S2中所述发酵培养的温度为28℃，通气量为0.2～0.3vvm。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述培养的温度为28℃，时间为16h。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述发酵培养的温度为28℃，通气量为0.3vvm。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述冷冻浓缩的温度为4℃。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述复溶中菌体与溶剂的质量比为1:500。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述离心的转速为6000～8000转/分钟，时间为10～20min。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述离心的转速为8000转/分钟，时间为10min。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述多粘类芽孢杆菌的菌悬液的制备方法包括如下步骤：

S1：取所述多粘类芽孢杆菌培养后，获得种子液；

S2：取所述种子液发酵培养后，冷冻浓缩，离心，收集沉淀后，复溶，获得所述多粘类芽孢杆菌的菌悬液；

S1中所述培养的温度为30～37℃，时间为12～16h；S2中所述发酵培养的温度为30～37℃，通气量为0.5～0.6vvm。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述培养的温度为37℃，时间为16h。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述冷冻浓缩的温度为4℃。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述复溶中菌体与溶剂的质量比为1:500。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述发酵培养的温度为37℃，通气量为0.6vvm。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述离心的转速为6000～8000转/分钟，时间为10～20min。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述离心的转速为8000转/分钟，时间为10min。

本发明还提供了上述磷素活化剂或上述制备方法获得的磷素活化剂在调解土壤pH、改善土壤理化性状、改善微生物环境或促进作物生长中的应用。

本发明提供了磷素活化剂，包括：聚谷氨酸、发酵果渣、油菜假单胞菌和多粘类芽孢杆菌，以及上述磷素活化剂的制备方法和应用。

本发明的有益效果包括：

(1)本发明提供了一种具有抑菌作用的土壤磷素活化剂，该土壤磷素活化剂能改善土壤环境，预防由微生物引起的土传病害，同时能够提高富磷菜地中磷素的循环与周转，促进磷素生物有效性。添加磷素活化物质，能有效的解决外源磷素吸附、固定在土壤中导致的生物有效性不高的问题；抑菌微生物选自多粘类芽孢杆，其具有解磷和广谱抑制植物病原菌并促进植物生长作用的杀菌剂，能有效防治菜田作物常见土传病害，且上述磷素活化物质的添加可使其杀菌效果显著增强。

(2)本发明提供的油菜假单胞菌具有解磷作用。通过限定聚谷氨酸、发酵果渣的使用配比，提高土壤中速效磷含量，增强土壤的供磷能力和作物对磷素的吸收。多粘类芽孢杆菌具有解磷和抑菌作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)；其中：A1示油菜假单胞菌在有机磷培养基上的水解圈情况；A2示油菜假单胞菌在无机磷培养基上的水解圈情况；

图2示多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)在有机磷培养基上的水解圈情况。

具体实施方式

本发明公开了磷素活化剂及其制备方法和应用。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。

本发明提供了一种具有杀菌作用的土壤磷素活化剂，包括如下重量份数的组分：聚谷氨酸20～30份，发酵果渣10～20份，油菜假单胞菌菌悬液40～60份，多粘类芽孢杆菌1～10份。将聚谷氨酸、发酵果渣干燥、研磨、过筛，用水溶解，加入油菜假单胞菌菌悬液和多粘类芽孢杆菌菌悬液，摇匀分散，加入稳定剂制成液态高效磷素活化剂。

本发明实施例1～实施例8和效果例1～效果例3中，所涉及的培养基及其组分如下：有机磷培养基：葡萄糖10.0g、(NH

所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1解磷菌的筛选

(1)解磷菌的初筛

将活化菌株分别点接于无/有机磷固体培养基平板上，适宜温度培养1～5d，观察解磷圈大小并测定解磷圈直径(D)和菌落直径(d)，计算D/d值大小来确定各初筛解磷菌的解磷能力。

(2)解磷菌的复筛

根据D/d值对初筛得到的解磷菌进行复筛，挑选单菌落接种于100mL无/有机磷液体培养基中，置于28℃、200rpm恒温振荡培养箱振荡培养，培养7d后，将发酵液8000r/min离心机低温离心20min后取上清液，将离心上清液用钼锑抗比色法测定其中的可溶性磷含量，以不接菌的无/有机磷液体培养基为对照。从而进一步确定该菌株的解磷能力。

油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)，菌株编号为nlsy003，保藏编号为CGMCCNo.6774，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，菌株编号为nlsy017，保藏编号为CGMCCNo.22938，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。

表1发酵后上清液中有效磷含量

实验结果如表1所示与空白对照相比，油菜假单胞菌发酵培养7d后，发酵上清液中的可溶性磷含量增加97.52％；多粘类芽孢杆菌发酵培养7d后，发酵上清液中的可溶性磷含量增加37.63％。

实施例2油菜假单胞菌和多粘类芽孢杆菌的培养方法

一种油菜假单胞菌的培养方法，以培养基的总质量为基准，微生物发酵培养包括如下步骤：

(1)种子培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL。培养条件为：温度为28℃，200rpm培养16h。

(2)发酵培养基：蔗糖40g，蛋白胨10g，氯化钾5g，水1000mL，pH＝7.0。培养条件：温度为28℃，搅拌转速为220rpm，通气量为0.3vvm，发酵结束后对其进行活菌计数为10

(3)菌悬液的浓缩：对离心瓶进行灭菌处理，干燥，然后取菌悬液于离心瓶中，设置冷冻离心机的温度为4℃，转速为8000转/分钟，离心10分钟，弃去上清液，得到固体菌体。将离心后的菌体按质量比1:500的比例，用相应的灭过菌的液体培养基复溶，备用。

一种多粘类芽孢杆菌的培养方法，以培养基的总质量为基准，微生物发酵培养包括如下步骤：

(1)种子培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.2。培养条件为：温度为37℃，200rpm培养16h。

(2)发酵培养基：蔗糖40g，蛋白胨10g，氯化钠5g，硫酸镁0.5g，硫酸铵0.3g，水1000mL，pH 7.0、培养条件：温度为37℃，搅拌转速为200rpm，通气量为0.6vvm，发酵结束后对其进行活菌计数为10

(3)菌悬液的浓缩：对离心瓶进行灭菌处理，干燥，然后取菌悬液于离心瓶中，设置冷冻离心机的温度为4℃，转速为8000转/分钟，离心10分钟，弃去上清液，得到固体菌体。将离心后的菌体按质量比1∶500的比例，用相应的灭过菌的液体培养基复溶，备用。

实施例3发酵果渣制备方法

将收集的废弃果渣进行破碎处理后，加入15％葡萄糖搅拌均匀，调节pH至4.5左右，装桶备用。再向桶中加入0.5％尚川酵素发酵菌(混合型粉剂，江苏新申奥生物科技有限公司)，密封后置于28℃发酵72h，取样检测发酵果渣中的主要有机酸组分及其含量。发酵后的果渣中有机酸分析用美国waters公司的高效液相色谱仪，516型泵，U6K进样器，481型紫外检测器，Grard-pak C

表2发酵果渣中的主要成分

实施例4

本实施例提供一种具有杀菌作用的土壤磷素活化剂，以质量份计，包括聚谷氨酸20份，实施例3获得的发酵果渣20份，实施例2获得的油菜假单胞菌菌悬液55份，实施例2获得的多粘类芽孢杆菌1份。将上述组分按比例进行搅拌均匀，加入稳定剂制成液态高效磷素活化剂。

实施例5

本实施例提供一种具有杀菌作用的土壤磷素活化剂，以质量份计，包括聚谷氨酸25份，实施例3获得的发酵果渣15份，实施例2获得的油菜假单胞菌菌悬液50份，实施例2获得的多粘类芽孢杆菌10份。制备方法同实施例4。

实施例6

本实施例提供一种具有杀菌作用的土壤磷素活化剂，以质量份计，包括聚谷氨酸30份，实施例3获得的发酵果渣10份，实施例2获得的油菜假单胞菌菌悬液60份，实施例2获得的多粘类芽孢杆菌5份。制备方法同实施例4。

实施例7

本实施例提供一种具有杀菌作用的土壤磷素活化剂，以质量份计，包括聚谷氨酸15份，实施例3获得的发酵果渣15份，实施例2获得的油菜假单胞菌菌悬液40份，实施例2获得的多粘类芽孢杆菌10份。制备方法同实施例4。

实施例8

本实施例提供一种具有杀菌作用的土壤磷素活化剂，以质量份计，包括聚谷氨酸15份，实施例3获得的发酵果渣20份，实施例2获得的油菜假单胞菌菌悬液55份，实施例2获得的多粘类芽孢杆菌10份。制备方法同实施例4。

效果例1

将实施例4～实施例8获得的土壤磷素活化剂施用于土传病害相对较为严重的设施菜田土壤。具体设计如下：本试验阶段分空白组、对照组和处理组，对照组施用市售土壤磷活化剂(购于青岛嘉沃美盛肥料有限公司)，处理组1～5施用实施例4～实施例8获得的土壤磷素活化剂，土壤磷素活化剂按整体施用率150kg/亩，每个处理平行5次，其他养分元素按试验条件设置按照常规施肥同等施入，种植作物为番茄，采收期对病虫害和产量、作物根系情况及土壤磷素组分进行调查测定。

从表3可以看出，与空白组相比，处理1～5显著降低了番茄病、虫害情况，显著提高番茄产量。施用不同配比土壤磷素活化剂后番茄的霜霉病、白粉病和枯萎病的发生率、蚜虫量较空白组和对照组有不同幅度减轻，其中处理2的效果最为明显，病害与空白组相比分别减少9.69％、3.36％、6.85％，虫害与空白对照相比减少了9.3％，且产量提高了15.43％。

表3各处理的叶色、花果、病虫害和产量比较

从表4可以看出，施用不同配比土壤磷素活化剂后番茄的根长和根干重都有一定的提升效果，对根长的提升效果处理2、3显著高于对照和处理1、4，和处理5相比差异不显著；根干重的提升效果处理2、3、4、5显著高于对照组和处理1。综合根长和干重提升数据可以看出，处理2对根系生长发育的作用最为适宜。

表4各处理对根长和根干重的提升效果

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从表5可以看出，与空白组相比，施用不同配比土壤磷素活化剂后土壤速效磷和水溶性磷含量显著提高，其中处理2的磷素含量显著高于空白组、对照组和其他处理。与空白组相比，处理2速效磷含量提高174.6％，水溶性磷含量提高130.7％。速效磷和水溶性磷是最易被植物吸收利用的磷素形态，故处理2对磷素活化的效果最佳。

表5各处理对土壤有效磷含量的影响

效果例2

将实施例4～实施例8获得的土壤磷素活化剂施用于设施菜田酸性土壤。具体设计如下：布置盆栽试验，定植作物为小白菜，第一次充分浇水，湿度达到田间最大持水量水平，35天后测定土壤速效磷和水溶性磷含量及小白菜产量。试验分空白组、对照组和处理组，对照组施用市售土壤磷活化剂，处理组1～5指使用实施例4～8所得土壤磷素活化剂，土壤磷素活化剂按整体施用30g/kg，每种处理平行5次，其他养分元素按试验条件设置同等施入，如表6所示。

表6试验条件设置

收获后结果如表7所示，与空白组相比，施用不同配比土壤磷素活化剂后的处理小白菜产量显著增加，处理2、3、5产量显著高于对照组和处理1、3。其中处理2产量提高55.3％，处理5产量提高45.7％。

表7产量情况分析

从表8可以看出，与空白组相比，不同配比土壤磷素活化剂施用后土壤速效磷和水溶性磷含量显著提高，处理2、3显著高于空白组和其他处理，其中处理3速效磷和水溶性磷较空白组分别提高了105.8％、67％；处理2次之，分别提高了103.7％、57.1％。

表8各处理对土壤有效磷含量的影响

效果例3

将对照组市售土壤磷活化剂，实施例4～实施例8获得的土壤磷素活化剂施用于南方果园酸性土壤。具体设计如下：布置田间试验，作物为芒果，每株施用调理剂2公斤，其他田间管理常规进行，连续施用3茬后测定其发病率、土壤速效磷和水溶性磷含量。试验分空白组和处理组，处理组1～5指使用实施例4～8所得土壤磷素活化剂，施肥情况如表9所示。

表9试验条件设置

如表10所示，连续施用3茬后，处理组较空白组细菌黑斑病、流胶病、炭疽病的发病频率均显著降低，产量显著提高；处理2、3的发病率显著低于对照组，产量较对照组显著提高。其中处理2、3与空白组相比病害发生频率分别降低了23.59％、21.61％和28.75％，产量分别提高了7.20％和6.71％。

表10各处理病虫害和产量比较

从表11可以看出，与空白组相比对照组和处理组土壤速效磷和水溶性磷含量显著提高，处理2、3速效磷和水溶性磷含量显著高于对照组。其中处理3与空白组相比速效磷含量提高了38.1％，水溶性磷含量提高了94％。

表11各处理对土壤有效磷含量的影响

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。