一种番茄专用复合微生态菌肥及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种番茄专用复合微生态菌肥及其制备方法与应用。

背景技术

现代番茄多为大棚种植模式，大棚种植的优势是作物成熟周期短，从种植到成熟采收仅需6个月，且可以连作种植，通过大棚技术不仅能够反季节栽培番茄，也可以获取更大的收益。但是随之而来的是大棚连作障碍日益突出。典型的，常年种植番茄的温室大棚存在以下问题：一、病虫害基数大，大棚连作致使叶霉病、灰霉病、霜霉病、根腐病、枯萎病和蚜虫等病虫害的密度和危害程度要远远高于非连作大棚；二、土壤微生物平衡遭受破坏，温室长时间的连作，会使得土壤的形状、温度湿度以及光照条件有所改变，使得有益微生物生长受到抑制，但是却有利于有害微生物繁殖。这严重破坏了土壤微生物的平衡，不仅使得肥料分解缓慢，而且病虫害发生较多，一年比一年严重；三、盐碱化，大棚终年覆盖薄膜，这样损坏了天然状态下的水分平衡，加上棚室内温度较低，土壤和植物的蒸发量大，而土壤深层出的盐分就会上升，这样土壤表层形成盐分，这就是土壤盐碱化。

上述因素均会导致番茄生产后期品质、产量的下降，严重降低生产经营者的经济效益。现有手段，主要通过合理轮作，根据不同作物本身的生理特性、不同环境的习惯状况，选择深根系和浅根系的作物进行轮作，为番茄的生长发育创造一个良好环境，但效果不太理想。或者通过施用肥料改善土壤有机肥和微量元素的含量，来对番茄土壤进行改善，营造番茄良好的生长环境，但化学物质以及添加剂等的频繁使用，不仅污染环境，也会对人体造成危害。

基于此，微生物(菌剂)肥料逐渐发展，但目前市场上的微生物肥料大多为用单一菌种或者配方固定的复合菌种发酵而成，实际应用价值也非常有限。

发明内容

1.要解决的问题

针对上述问题，本发明的目的之一在于提供一种能够番茄专用复合微生态菌肥。

本发明的目的之二在于提供上述微生物菌剂肥的制备方法。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种番茄专用复合微生态菌肥的制备方法，其特征在于，

1)栽培土壤样品的取样

采用五点采样法进行采样；

2)栽培土壤样品微生物总量及比例确定

提取栽培土壤样品中的微生物的总DNA；

利用荧光定量法测定微生物DNA浓度；

纯化处理后，对微生物DNA的16s rRNA基因的V3-V4高变区进行扩增处理；扩增程序为：99℃预变性9min，99℃变性20s，99℃退火20s，72℃延伸20s，运行40个循环；扩增循环结束后，降温至60℃；

以大肠杆菌作为标准品，以16S rRNA作为目标序列，以919F/806R为PCR引物，通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序，确定土壤样本中不同活性微生物的相对含量、比例；

3)建立标的土壤样品微生物数据库

通过高通量测序获得标的土壤样品中相关微生物组成分布比例信息；所述相关微生物菌群为芽孢杆菌、放线菌、光合菌、硝化菌、根瘤菌、解钾菌、解磷和固氮菌种的任一几种组合；

4)确定菌剂配方

将测定的栽培土壤样品微生物菌群含量与标的土壤样品微生物数据库信中相关微生物菌群的含量分布进行比较，若相对含量＞27％，则提供的配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×10

9)发酵

按照菌剂配方提供微生物活性菌群，并利用菌液发酵基质进行发酵；其中，

所述发酵基质包括基质、纯水、酵母，所述基质添加量为基质与纯水重量之和的40％，所述酵母添加量为基质与纯水重量之和的6～10％；

所述基质组成，按照蔬菜与水果3:9的重量比例混合。

更进一步地，所述3)中，将测序结果与16S rRNA的微生物基因序列数据库进行对比，确定土壤样本中不同活性微生物的相对含量、比例。

更进一步地，所述16S rRNA的微生物基因序列数据库，以公共数据库菌株的系统分类名称和DNA序列信息为依托，而选择构建土壤样本中的微生物菌株类型，构建16S rRNA的微生物基因序列数据库；

所述公共数据库包括RDP、SILVA、GreenGene、UNITE。

更进一步地，所述步骤9)中，所述发酵基质还包括蔗糖，所述蔗糖的添加质量比为9-10％wt。

更进一步地，设定发酵罐温度29℃，前2-4天完全密封，4-8天少量通气，使活性复合微生物充分进行扩增，随后，密封发10-19天。

一种番茄专用复合微生态菌肥，所述菌肥由以上任一所述方法制备而成。

一种番茄专用复合微生态菌肥的应用，用于克服番茄连作障碍。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的微生物菌剂肥，基于实际选择特定微生物、配以特殊配方的发酵基质以及发酵工艺，最终获得个性化、活性复合微生态菌肥。

不仅能够调节植物根际的碳氮平衡，改善植物生长的微生态环境，还能够增强植物抵抗病原物的能力，提升植物对土壤盐渍化的耐受性。

本发明提供的微生物菌剂肥，使用方法简单易行，可以在移栽前撒施或穴施后迈入土壤中，施用后使苗期增加出苗率和使幼苗生长得到显著的改善，生物量得到明显的提高，后期增加产量10-20％，有效解决植物的连作障碍问题。

附图说明

图1为番茄种植土壤样本中微生物组成分布比例信息；

图2为番茄种植土壤样本不同组微生物显著作用的微生物类群；

图3为所有分类上差异物种之间的相关性，颜色越深，表明物种之间的相关性越强。

具体实施方式

除非另有定义，在本发明中，所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在本发明中，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明中，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。

含量、浓度、重量百分比、时间、温度和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.9的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.9的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.9”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

实施例1

区域地点：宁夏贺兰山新平村；

目的：定制符合其土壤需求的改善连作障碍的微生物肥料；

准备：建立标的土壤样品微生物数据库，16S rRNA的微生物基因序列数据库，以公共数据库菌株的系统分类名称和DNA序列信息为依托，而选择构建土壤样本中的微生物菌株类型，构建16S rRNA的微生物基因序列数据库；所述公共数据库包括RDP、SILVA、GreenGene、 UNITE。

具体：通过高通量16S rRNA基因测序获得900份标的土壤样品中相关微生物组成分布比例信息；所述相关微生物菌群关注芽孢杆菌、放线菌、光合菌、硝化菌、根瘤菌、解钾菌、解磷和固氮菌种。

(1)番茄栽培土壤样品的信息采集

对贺兰山新平村番茄种植区域进行估测，采用小区五点采样法进行采样，距离根部不超过10厘米的位置处，取样土层深度20-30厘米，样本数量900个。

(2)测定样本土壤中微生物总量及微生物菌群比例：

提取栽培土壤样品中的微生物的总DNA；

利用荧光定量法测定微生物DNA浓度；

具体的，以16S rRNA作为目标序列，采用919F/806R PCR (919F-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT)引物对微生物DNA的16S rRNA基因的V3-V4高变区进行扩增，以大肠杆菌作为标准品，梯度为1.0×10

其中，所述扩增程序为：99℃预变性9min，99℃变性20s，99℃退火20s，72℃延伸20s，运行40个循环；扩增循环结束后，降温至60℃；

最终确定土壤样本基本信息如下；

该土壤样本中含有芽孢杆菌1.9×10

经测定，该地区不同土壤样本中芽孢杆菌含量≤27％为2.3×10

(3)确定菌剂配方：将测定的栽培土壤样品微生物菌群含量与标的土壤样品微生物数据库信中相关微生物菌群的含量分布进行比较。根据生物信息分析的结果，调整部分菌种比例，优化确定菌剂配方为该微生物菌群的活性总含量为9.9×10

9)发酵

按照菌剂配方提供微生物活性菌群，并利用菌液发酵基质进行发酵；其中，所述发酵基质包括基质、纯水、酵母、蔗糖，所述基质添加量为基质与纯水重量之和的40％，所述酵母添加量为基质与纯水重量之和的6％；所述蔗糖的添加质量为基质与纯水重量之和的10％wt；所述基质组成，按照蔬菜与水果3:9的重量比例混合，其中蔬菜为白菜、土豆、南瓜、西红柿(重量比1：1：1：1)，水果为菠萝、库尔勒香梨、甘蔗、西瓜(重量比1：1：1：1)，分别洗净、切块/粉碎(长度<1.9cm)并去除杂质后存放。

将步骤(3)中确定的个性化菌剂配方中的天然微生物活性菌群按比例以1:900稀释与发酵基质进行混合发酵，设定发酵罐温度29℃，前2天完全密封，8天少量通气，使活性复合微生物充分进行扩增，随后，密封发19天。

然后固液分离、干燥、制粒，经过客户试用，试用组与对照组差别明显，试用组在叶片大小，光泽度，结果率等方面均优于对照组。

试用案列2

区域地点：宁夏贺兰山银河村；

目的：定制符合其土壤需求的改善连作障碍的微生物肥料；

准备：建立标的土壤样品微生物数据库，16S rRNA的微生物基因序列数据库，以公共数据库菌株的系统分类名称和DNA序列信息为依托，而选择构建土壤样本中的微生物菌株类型，构建16S rRNA的微生物基因序列数据库；所述公共数据库包括RDP、SILVA、GreenGene、 UNITE。

具体：通过高通量16S rRNA基因测序获得900份标的土壤样品中相关微生物组成分布比例信息；所述相关微生物菌群关注芽孢杆菌、放线菌、光合菌、硝化菌、根瘤菌、解钾菌、解磷和固氮菌种。

按照下述方法确定生物肥料动态菌剂配方：

(1)番茄栽培土壤样品的信息采集

对贺兰山银河村番茄种植区域进行估测，采用小区五点采样法进行采样，距离根部不超过10厘米的位置处，取样土层深度20-30厘米，样本数量900个。

(2)测定样本土壤中微生物总量及微生物菌群比例：

提取栽培土壤样品中的微生物的总DNA：处理后使用使用MP BiomedicalsFastDNA土壤样品提取试剂盒抽提并纯化样本中的微生物DNA。

提取土壤中微生物的总DNA，然后以16S rRNA作为目标序列，使用919F/806R PCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品，梯度为1.0×10

该地区土壤样本中芽孢杆菌含量≥27％为3.6×10

(3)确定菌剂配方

根据生物信息分析的结果，调整部分菌种比例，优化确定菌剂配方为该微生物菌群的活性总含量为2.9×10

4)发酵

按照菌剂配方提供微生物活性菌群，并利用菌液发酵基质进行发酵；其中，所述发酵基质包括基质、纯水、酵母、蔗糖，所述基质添加量为基质与纯水重量之和的40％，所述酵母添加量为基质与纯水重量之和的10％；所述蔗糖的添加质量为基质与纯水重量之和的9％wt；所述基质组成，按照蔬菜与水果3:9的重量比例混合，其中蔬菜为白菜、土豆、南瓜、西红柿(重量比1：1：1：1)，水果为菠萝、库尔勒香梨、甘蔗、西瓜(重量比1：1：1：1)，分别洗净、切块/粉碎(长度<1.9cm)并去除杂质后存放。

将步骤(3)中确定的个性化菌剂配方中的天然微生物活性菌群按比例以1:900稀释与发酵基质进行混合发酵，设定发酵罐温度29℃，前4天完全密封，4天少量通气，使活性复合微生物充分进行扩增，随后，密封发10天。

然后固液分离、干燥、制粒，经过客户试用，试用组与对照组差别明显，试用组在叶片大小，光泽度，结果率等方面均优于对照组。