PCR扩增用冻干保护剂及PCR扩增试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种PCR扩增用冻干保护剂及PCR扩增试剂盒及其应用。

背景技术

目前，PCR扩增试剂基本呈液体状态，其组分中的DNA聚合酶、dNTP、引物及探针等均需要储存于-20℃的冷冻环境中。PCR扩增用试剂的反复冻融对于试剂性能会有一定影响。液体检测试剂需要冷链运输，运输成本较高，而且环境温度的变化造成试剂反复冻融会直接影响检测试剂的性能和保质期。鉴于此，冻干技术广泛用于解决PCR扩增试剂产品的长期常温保存及海运的难题。

但是，现有冻干PCR扩增试剂不可兼容快速qPCR程序，扩增时间较长，不满足适用于突发的公共卫生检验或在海关等特定场所的快速检测需求。

发明内容

基于此，有必要提供PCR扩增用冻干保护剂及PCR扩增试剂盒和应用。该PCR扩增用冻干保护剂能够提升PCR扩增试剂的储存稳定性和灵敏度，并可适用于快速qPCR程序。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种PCR扩增用冻干保护剂，包括质量比为(1～50):(1～20):(1～20)的海藻糖、葡聚糖和精氨酸，优选包括质量比为(1～15):(5～10):(1～5)的海藻糖、葡聚糖和精氨酸。

本发明还提供一种PCR扩增试剂盒，包括RT酶、RI酶、HS taq酶、UDG酶和上述PCR扩增用冻干保护剂。

在其中一些实施例中，所述试剂盒包含可冻干用的酶混合液，所述酶混合液包括上述PCR扩增用冻干保护剂，具体组成包括：

在其中一些实施例中，所述试剂盒包含可冻干用的酶混合液A和可冻干用的酶混合液B；

其中，所述酶混合液A包括：

其中，所述酶混合液B包括：

在其中一些实施例中，所述试剂盒包括还包括Buffer缓冲液，组成为：

优选地，Buffer缓冲液的组成为：

本发明还提供上述PCR扩增用冻干保护剂和/或PCR扩增试剂盒在制备快速RT-qPCR扩增反应体系中的应用。

本发明还提供上述PCR扩增试剂盒用PCR反应程序，包括：

UDG反应：温度25℃，时间5min，循环数为1；

反转录：温度50℃，时间5min，循环数为1；

预变性：温度95℃，时间3min，循环数为1；

循环反应：温度95℃时间5～15s，温度60℃时间30～35s，循环数为40～45。

与现有技术相比，本发明的核心优势在于：

本发明通过大量试验探究发现，当采用特定配比的海藻糖、葡聚糖、精氨酸混合作为冻干保护剂，酶混合体系能够实现在37℃保存7天性能稳定，使得冻干后试剂在45℃至少保持30天性能稳定，55℃放置20天后还可以保持扩增性能。同时，包含上述冻干保护剂的PCR扩增试剂盒的应用灵敏度提升，适用于快速PCR程序，便于缩短检测时长。

附图说明

图1为实施例1中含部分分组冻干保护剂的酶冻干粉的外观形态图。

图2为含分组2的冻干保护剂的酶体系应用于如RNA为模板的扩增曲线；其中，三条黑色线代表液体对照组，三条红色线代表采用冻干酶粉的扩增曲线，从左到右的同色扩增曲线分别对应的模板投入量为1ng/μL、100pg/μL和10pg/μL。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

Template：所用的样本为人(human)、小鼠、大鼠、水稻或者新冠病毒的总RNA。

F/R/P(10μM)：

所有引物探针均订购于上海生工。

试验例1

以未经冻干处理的酶混合液为对照(简称“液体对照”)，本试验例探究不同冻干保护剂的种类组成对PCR扩增试剂外观及扩增性能的影响，具体步骤包括：

S1，配制酶混合液并进行冻干处理：

酶混合液的组成为：

RT酶38U，RI酶10U，UDG酶2U，HS taq酶10U，Tris-HCl缓冲液10mM，EDTA1mM，Tween-20 0.2％(V/V)，冻干保护剂50％(M/V)，余量为水。

其中，冻干保护剂的种类及配比选择如下表的试验分组所示：

将上述含各分组的冻干保护剂的酶混合液(试验组)进行冻干和解析处理形成冻干酶混合粉，工艺参数如下表所示：

分别对含上述试验分组冻干保护剂的酶冻干后的外观进行形态观察，发现含分组1-9的冻干保护剂的酶组分冻干后形状致密，而含分组10-14的冻干保护剂的酶组分冻干后底部疏松，有镂空现象。部分试验组的冻干外观如图1所示。

S2，扩增性能测试：

采用上述人(human)的Template及F/R/P(10μM)(h-GAPDH-FAM/h-Actin-VIC/h-Actin beta-ROX)，按照如下反应体系进行扩增测试：

将模板与引物探针的混合液加入到装有冻干后酶混合物反应管中进行复溶，加入水补足至25μL。

按照如下反应程序进行PCR扩增：

经冻干复溶后PCR测试，与分组1-9的冻干保护剂组合相比，含分组10-14的冻干保护剂组合的酶混合液经冻干处理应用测试时，与液体对照检测结果相比，分组10-14的扩增曲线整体后移，即CT值后退，表明分组10-14的冻干保护剂并没有对酶混合液起到实质保护作用。

其中，部分试验分组的PCR扩增结果如下表所示：

含分组1的冻干保护剂的酶组分的测试结果

含分组6的冻干保护剂的酶组分的扩增测试结果(FAM)

含分组12的冻干保护剂的酶组分的扩增测试结果(FAM)

实际上，本发明通过大量试验探究发现：

以未经冻干处理的酶混合液为液体对照，通过观察冻干后冻干酶粉的形态是否萎缩及PCR扩增性能，综合筛选出酶冻干保护剂分组为：含特定配比的海藻糖、葡聚糖、精氨酸的分组1至9。更优选分组1至3的冻干保护剂体系。

试验例2

以试验例1中优选之一的冻干保护剂(海藻糖、葡聚糖、精氨酸质量比为1:5:1)基准，酶混合液的组成为：RT酶38U，RI酶10U，UDG酶2U，HS taq酶10U，Tris-HCl缓冲液10mM，EDTA 1mM，Tween-20 0.2％(V/V)，冻干保护剂50％(M/V)，余量为水。

本试验例探究不同的Buffer缓冲液体系组成对含上述冻干保护剂的酶体系的扩增性能的影响，试验分组如下：

采用上述人(human)的Template及F/R/P(10μM)(h-GAPDH-FAM/h-Actin-VIC/h-Actin beta-ROX)，按照如下反应体系进行扩增测试：

按照如下反应程序进行PCR扩增：

不同Buffer冲液体系的部分扩增结果统计表

根据相同模板扩增Cq值选出性能最优的Buffer B缓冲液体系。

进一步值得说明的是，发明人团队通过大量试验应用探究发现，当Buffer缓冲液的组成为：

优选地，Buffer缓冲液的组成为：

采用如下反应体系：

液体对照组体系

冻干实验组体系

按照上述PCR扩增程序。

当酶混合液的基础组成为：RT酶10～50U，RI酶10～50U，UDG酶10～50U，HS taq酶10～50U，Tris-HCl缓冲液1～200mM，EDTA 0.01～5mM，Tween-20 0.01～0.5％(V/V)时，与含含特定配比的海藻糖、葡聚糖、精氨酸的冻干保护剂复配组成的酶混合液进行PCR扩增应用时，均能够满足冻干后长期储存稳定性(冻干酶组分分别置于37℃和45℃放置条件下，保持30天性能基本稳定)的要求。

其中，以人总RNA为模板进行扩增的结果如下表所示：

试验例3

参照试验例1和2的方法，以未经冻干处理的酶混合液为对照，以试验例1中优选之一的冻干保护剂(分组1)和试验例2中优选的酶混合液(分组B)基准，本试验例探究上述PCR扩增用试剂体系对不同物种核酸(小鼠、大鼠、水稻、新冠病毒的总RNA)检测的通用性。

实验操作：实验组为冻干后固体酶组分，对照组为液体酶混合液，将25μL体系的模板与引物探针混合液加入到装有冻干后酶混合物反应管中进行复溶，进行PCR扩增反应。验证冻干后的实验组通用性。

扩增结果如下表所示：

测试结果表明：以含分组1的冻干保护剂的PCR扩增用试剂对不同物种核酸检测的通用性良好。

试验例4

参照试验例1和2的方法，以未经冻干处理的酶混合液为对照，以试验例1中优选之一的冻干保护剂(分组1)和试验例2中优选的酶混合液(分组B)基准，探究与市售竞品保护剂(宝锐)的试验效果比对，经过冻干后，试验反应体系和程序分别为：

扩增体系(酶组分为冻干后固态)

快速扩增反应程序

快速程序的扩增结果统计见下表：

测试结果表明：在快速扩展程序下，含分组1的冻干保护剂应用于RT-qPCR扩增性能整体优于竞品保护剂RT-qPCR扩增性能。

试验例5

参照试验例1和2的方法，以未经冻干处理的酶混合液为对照，以试验例1中优选之一的冻干保护剂(分组1)和试验例2中优选的酶混合液(分组B)基准，按照上述反应体系，探究不同反应程序的影响：

常规扩增程序

快速扩增程序

其中，常规扩增程序的测试结果如下表：

快速扩增程序的测试结果如下表：

试验结果表明：含分组1的冻干保护剂的冻干RT-qPCR扩增试剂可兼容快速程序。

试验例6

本试验例可以提供一种PCR扩增试剂盒，本实施例优选PCR试剂盒的酶混合组分产品形式为冻干产品，具体组成包括：

冻干酶混合物A:含质量比为(1～50):(1～20):(1～20)的海藻糖、葡聚糖、精氨酸的冻干保护剂，以及HS taq酶、Tris、EDTA和Tween-20。

冻干酶混合物B：含RT、RI酶、UDG酶、Tris、EDTA和Tween-20。

若为液体酶混合物A和酶混合物B，建议分装到反应管中立即转移到冷冻干燥机(参照试验例1中的工艺参数)并进行适合的干燥循环。为了样本能在室温下长期保存，冻干后产品应在相对湿度较低环境下进行包装。

推荐配制25μL扩增反应体系：

推荐采用如下快速反应程序进行扩增测试：

快速扩增反应程序

冻干产品的储存推荐：低于37℃条件下，不超过45天。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。