新型PCV3病毒株及PCV3基因工程亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一株新型的PCV3病毒株，及基于该病毒株制备的PCV3基因工程亚单位疫苗。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)目前已确认的有四种基因型：PCV1、PCV2、PCV3、PCV4。PCV1为非致病性病毒，后三种皆为致病性病毒。

PCV3最先由Palinski等人从某猪场母猪发生不明原因皮炎综合征和流产的死胎样本中通过宏基因组测序方式首次发现报道，命名为猪圆环病毒3型(PCV3)。随后世界上大部分养猪国家都报道了PCV3在猪场中的流行。自PCV3在美国发现以来，中国、韩国、波兰、巴西和意大利也相继报导了该病毒的存在。感染PCV3的猪表现为猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、繁殖障碍、呼吸道、胃肠道和神经系统疾病、多系统炎症、心肌炎等。PCV3基因组已通过PCR方法在口腔液和鼻拭子以及粪便、精液和初乳中检测到，通过直接接触的水平传播可能是主要的传播途径。PCV3的致病性和免疫机理目前尚不清楚，它的高发生率可能对全球养猪业构成潜在威胁，PCV3的广泛存在已引起世界各国养猪业的高度关注。

由于PCV3毒株很难在细胞上分离，针对PCV3体外的鉴别诊断方法发展受到极大的限制，对PCV3病毒的预防和治疗也存在一定难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型猪圆环病毒3型(PCV3)毒株，及基于该毒株的基因工程亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明技术方案详述如下：

第一方面，本发明提供了一株新型PCV3病毒株，其含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示Cap蛋白，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:V202208。

第二方面，本发明提供了上述PCV3病毒株在制备PCV3疫苗中的应用。

第三方面，本发明提供了一种PCV3基因工程亚单位疫苗，由氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示Cap蛋白制备而成。

可选或优选的，上述疫苗，是将Cap蛋白用可水解灭火剂进行灭活后，加入水性佐剂进行乳化制备而成。

可选或优选的，上述疫苗，所述Cap蛋白与水性佐剂的质量比为8:2。

可选或优选的，上述疫苗，Cap蛋白的含量不低于50μg/mL。

可选或优选的，上述疫苗，所述Cap蛋白通过如下方法制备：

以权利要求1所述病毒株为模板，以SEQ ID NO:3-4为引物进行PCR扩增，扩增产物插入表达载体PET-28a(+)，构建表达重组质粒PET-ORF2；

PET-ORF2转化大肠杆菌BL21宿主菌，在IPTG诱导下表达His-Cap重组融合蛋白；

采用针对His(组氨酸)标签的纯化柱对重组融合蛋白进行纯化，获得带His标签的Cap蛋白。。

说明：

PET-28a(+)：一种表达载体，含有抗卡那霉素基因，对应的表达宿主菌是大肠杆菌，用于表达目的基因，基因组中含有蛋白标签N-His、N-T7或C-His，可用IPTG或乳糖及其类似物进行诱导表达。

大肠杆菌BL21：一种广泛蛋白表达用宿主菌，又称大肠杆菌BL21(DE3)菌。染色体上携带由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因，在IPTG诱导下可以高效表达T7启动子驱动的外源目的基因。

IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，化学式为C

水性佐剂：主要作用是吸附抗原，使抗原在体内缓释，增强体液免疫，帮助提高抗原提呈效率，刺激免疫细胞快速增值。可直接购买市售商品。有些水性佐剂不需要乳化，直接与抗原混合均匀即可使用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一株新型PCV3病毒株PCV3 LY株，与已公开的PCV3病毒的基因序列同源性为87.08-87.85％，氨基酸序列同源性90.70～93.49％。利用该病毒株的Cap蛋白制备了基因工程亚单位疫苗，可用于PCV3紧急免疫评价，方法是对PCV3检测感染阳性的4～6周龄断奶仔猪进行注射免疫两次。该亚单位苗应用前后PCV3核酸阳性率由100％降至10％，ELISA抗体阳性率由自然感染初期的20％提高至疫苗免后的80％，临床应用效果良好。

保藏信息：

名称：猪圆环病毒3型PCV3 LY株(简称PCV3 LY株)；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；

保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072；

保藏编号：CCTCC NO.V202208；

保藏时间：2022年3月10日。

附图说明

图1为PCV3 ORF2基因核酸电泳，M:5000Marker；1.目的基因；2.阴性水对照。

图2为表达PCV3 Cap蛋白SDS-PAGE电泳，1.工程菌全菌诱导表达蛋白(未纯化)；2.工程菌未诱导表达蛋白；3.纯化后目的蛋白。

具体实施方式

下面结合较佳的具体实施例对本发明进行详细的描述，本发明所用到的化学药品或试剂，可以根据其功能选用已有的其它类型的产品，而不仅限于实施例的具体记载。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1PCV3 LY毒株的分离与鉴定

1.1发病情况

辽宁省辽阳市某猪场仔猪在断奶后2-3天或一周左右出现生长缓慢、逐渐消瘦、咳嗽、呼吸困难、没精神、皮肤苍白、黄疸、拉稀、淋巴结肿大(摸下股骨沟淋巴结可以感觉到)、毛发蓬乱等症状，发病率在20％-60％，死亡率在10％-40％。

1.2临床解剖症状

解剖病死猪可见肠系膜、腹股沟等多处组织淋巴结中大、充血、淤血，肺脏充血、淤血，肾脏充血、淤血、有斑块，并有多种不同程度的病变。

1.3实验室诊断

1.3.1病料的处理和组织病毒总DNA/RNA提取

根据发病死亡猪的临床表现、剖检病变，初步怀疑是猪圆环病毒感染引起的断奶仔猪衰竭综合征(PMWS)，于是无菌取死猪肺脏组织病料，病料采用组织捣碎机进行组织破碎匀浆，并采用病毒总DNA/RNA提取试剂盒提取组织中病毒总核酸，测定核酸浓度为396ng/uL。

1.3.2病毒PCR鉴定

利用设计的检测PCV2和PCV3特定引物(上、下游引物序列详见表1)对单个菌落进行PCR扩增，并于1％琼脂糖凝胶中电泳。

表1引物序列表

1.3.3基因序列测定

核酸电泳结果显示PCV3扩增泳道出现特异性目的条带，详见图1。将目的条带切下，送上海生工测序。测序结果经BLAST分析发现其为PCV3新的基因序列，与已知PCV3毒株基因序列同源性在87.08-87.85％左右，与已知PCV3毒株氨基酸序列的同源性在90.70～93.49％，与其他PCV(PCV2/PCV4)基因组的同源性为43.2％～51.5％。

为了排除此基因是由于扩增过程中产生的误差，进行了多次扩增和测序，测序结果显示核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。证明该组织病料中扩增出的PCV3 ORF2基因为新基因，是当前流行毒株的变异株，命名为PCV3 LY株。将此毒株保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202208。

实施例2PCV3基因工程亚单位疫苗核心抗原Cap蛋白的制备

2.1含PCV3 ORF2新基因的基因工程大肠杆菌构建及鉴定

根据PCV3 ORF2新基因两端的一段序列与表达性载体PET-28a的多克隆酶切位点，设计特异性扩增引物如下：

PCV3新ORF2-F：5′-GGG GGA TCC ATG AGA CAC AGA GCT ATA TTC-3′(加入了BamHⅠ酶切位点)，

PCV3新ORF2-R：5′-GGG AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG-3′(加入了HindⅢ酶切位点)。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以实施例1的PCV3 LY株(CCTCCNO:V202208)组织病毒液提取的DNA为模板，进行PCR扩增。

扩增产物为645bp大小的目的基因序列，用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因。将目的基因与载体PET-28a(+)双酶切并连接获得PET-ORF2重组质粒，将该重组质粒按常规方法转入表达性大肠杆菌BL21宿主菌，挑取单个克隆，酶切法鉴定阳性克隆，摇菌，测序，测序结果见SEQ ID NO:2，其翻译的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.2新PCV3 Cap蛋白的制备

将测序结果正确的单个克隆重组质粒PET-ORF2转化的表达性BL21宿主菌，接种于5mL含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB细菌培养基，37℃振摇培养过夜，次日取出1ml培养物接种于120mL的LB培养基中，37℃振摇培养2.5h后，菌液摇至半透明半浑浊状态，吸光光度法测得OD600＝0.6～0.8(致对数生长期)，在诱导前先取10mL作为诱导前对照，并将振摇温度变为30℃加IPTG(终浓度为1.0mmol/L)诱导，诱导4h收集10mL菌液，以诱导未转化PET载体的菌液作为空白对照，以诱导转化PET载体的菌液作为空载体对照。将诱导表达的菌液取出，离心弃上清，再用0.5mL 1×PBS重悬菌体，超声波裂解破碎细菌后，按1:1加2×上样Buffer煮沸10min，离心取上清，上清用12％SDS-PAGE电泳鉴定分析获得27～28kDa的目的蛋白，详见图2。利用His标签纯化试剂盒按规定操作对目的蛋白进行纯化，纯化后的His-Cap蛋白的纯度为95％以上。

实施例3PCV3基因工程亚单位疫苗的制备及安全性检验

将实施例2纯化好的PCV3 Cap蛋白加无菌生理盐水溶解，所得溶液进行0.22μm无菌滤器过滤，获得无菌蛋白溶液，采用分光光度法对过滤后的无菌蛋白溶液进行浓度测定，蛋白浓度为1.05mg/mL。

将此蛋白溶液用无菌生理盐水进行稀释，稀释至终浓度不低于62.5μg/mL，再与已灭菌的水佐剂按体积比＝8：2进行配苗，并采用无菌的磁力搅拌器进行乳化混合均匀，制备成PCV3基因工程亚单位疫苗制剂，成品相当于每毫升疫苗制剂中含有Cap蛋白不低于50μg。

将此PCV3基因工程亚单位疫苗制剂按照1.0mL/只的剂量对小鼠进行安全检验，分别腹腔注射0.5mL和颈背部皮下注射0.5mL，连续观察7天。观察结果显示，所有注射小鼠的精神、采食、饮水均良好，生产发育均良好，均健活，表明该PCV3基因工程亚单位疫苗安全性检验合格。

实施例4PCV3基因工程亚单位疫苗在临床PCV3感染发病猪场的紧急免疫评价应用

将实验室安检合格的PCV3基因工程亚单位苗用于临床PCV3感染发病场的紧急免疫评价应用试验。其紧急免疫评价应用方法是：随机抽选PCV3检测感染阳性的4～6周龄断奶仔猪100头，按照每头份2.0mL的剂量颈部肌肉注射PCV3基因工程亚单位苗制剂进行免疫。

首次免后14日按相同剂量进行第二次注射免疫，二免后21日所有试验猪均采血，分离血清，分别提取核酸进行PCR检测和血清抗体水平ELISA检测。

应用结果显示，该亚单位苗应用前PCV3核酸阳性率为100％(100/100)，应用后核酸检测阳性率率为10％(10/100)，ELISA抗体阳性率由自然感染初期的20％(20/100)提高至疫苗免后的80％(80/100)，临床应用效果显示良好。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东信得科技股份有限公司

<120> 新型PCV3病毒株及PCV3基因工程亚单位疫苗

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 1

Met Arg His Arg Leu Val Thr Asn Pro Asn Phe Phe Gly Ala Val Glu

1 5 10 15

Val Ala Met Ser Asp Ile His Val Asp Thr Tyr Tyr Thr Lys Gln Cys

20 25 30

Ser Pro Leu Asn Gly Gly Val Ile Cys Val Gln Pro Trp Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Glu Val Glu Glu Ala Leu Ser Trp Val Ser Ala Gly Ser Ser Arg

50 55 60

Gln Asn Trp Phe Gly Gly Glu Val Thr Ala Val Ile Ser Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Lys Asp Glu Ser Tyr Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly Pro

85 90 95

Arg Ala Ile Asp Leu Asp Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Pro Glu

100 105 110

His Ser Phe Cys Leu Leu Ser Arg Arg Asn Tyr Arg Ala Glu Cys Asn

115 120 125

Phe His Leu Arg Tyr Leu Ile Ile Phe Lys Ala Asn Gly Ser Phe Pro

130 135 140

Phe Val Pro Ala Gly Asn Glu Val Val Gly Val Pro Gly Leu Val Ile

145 150 155 160

Leu Arg Gly Ser Asn Gly Asn Asp Val His Gly Gly Val Phe Leu Cys

165 170 175

Val Val Cys Ala Ser Cys Gly Pro Pro Asn Glu Ser Phe Ser Ser Asp

180 185 190

Ile Ala Pro Ser Val Ala Ser Ser Ser Pro Trp Ala Gly Ser Ser Ser

195 200 205

Glu Tyr Ser Ser Val Ser

210

<210> 2

<211> 645

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 2

atgagacaca gacttgtaac gaatccaaac ttctttggtg ccgtagaagt cgctatgtca 60

gatattcatg tcgacacata ctacacaaag cagtgctccc cattgaacgg tggggtcata 120

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