一种用于检测PCV3的荧光免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及家畜致病性病毒诊断技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒3的Cap蛋白抗原肽、抗体及PCV3检测用免疫组化试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)目前已确认的有四种基因型：PCV1、PCV2、PCV3、PCV4。PCV1为非致病性病毒，后三种皆为致病性病毒。

感染PCV3的猪表现为猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、繁殖障碍、呼吸道、胃肠道和神经系统疾病、多系统炎症、心肌炎等。

PCV3是一个小的无囊膜病毒粒子，直径约为15-20nm，呈二十面体对称。整个基因组是一个单股环状DNA，基因组为2000bp。主要包括两个主要的开放性阅读框(openreading frams,ORFs)：编码病毒复制蛋白(replicaseprotein,Rep)的ORF1和编码病毒衣壳蛋白(capsid protein,Cap)的ORF2。Rep和Cap基因编码方向相反，导致基因组为双义链结构。在Cap和Rep之间的5’间隔区有一个茎状特征(stem-loop)的病毒复制起始位点(Ori)。

目前，PCV3的鉴别诊断主要采用聚合酶链式反应(PCR)以及本动物回归等方法。其中PCR需要已知明确、通用且特异的核酸序列进行设计鉴别引物，对于实验者操作技术要求高且易出现假阳性或假阴性；而动物回归实验需要饲养实验动物攻毒观察临床症状用于鉴别，耗时较长且成本较高，受动物个体的影响也较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测PCV3的荧光免疫试剂盒，可以灵敏特异地检测到PCV3病毒，从而弥补现有技术中的上述不足。

本发明技术方案详述如下：

一种用于检测PCV3的荧光免疫试剂盒，包括：

一抗：PCV3 Cap单因子血清抗体，由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的抗原肽免疫小鼠，分离免疫血清制备而成；

荧光二抗：FITC标记的山羊抗小鼠IgG；

可选或优选的，上述试剂盒中，还包括：

固定液：由多聚甲醛和PBS混合而成，多聚甲醛的体积百分含量为4％；

封闭液：体积百分比8％的正常羊血清；

洗液：PBS。

可选或优选的，上述试剂盒还包括阳性对照品，所述阳性对照品为PCV3病毒组织。

可选或优选的，上述试剂盒中，所述PBS由NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na

可选或优选的，上述试剂盒中，所述PCV3 Cap单因子血清抗体通过以下方法制备：

(1)以猪圆环病毒PCV3 LY株的组织病毒液提取DNA作为模板，以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，获得目的基因；

(2)将目的基因与载体PET-28a(+)分别经双酶切后再连接获得PET-Cap重组质粒；

(3)将PET-Cap重组质粒转入宿主菌大肠杆菌BL21，培养，鉴定阳性克隆；

(4)鉴定正确后，将宿主菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基，37℃条件下振摇培养；

(5)培养至对数生长期，将培养温度降至30℃并加入IPTG至终浓度1.0mmol/L进行诱导培养4小时；

(6)将诱导培养表达的菌液取出，离心去上清，加入PBS重悬菌体，裂解破碎，按体积比1:1加入2×上样buffer煮沸10min，离心取上清；

(7)上清液用His标签纯化试剂盒对目的蛋白进行纯化，获得PCV3 Cap蛋白抗原肽；

(8)将PCV3 Cap蛋白抗原肽稀释至1.05mg/mL，加入等体积的弗氏完全佐剂，对BALB/C小鼠进行第一次免疫注射，注射部位是颈部皮下，注射剂量100～110μg/只，饲养2周；

(9)将PCV3 Cap蛋白抗原肽稀释至1.05mg/mL，加入等体积的弗氏不完全佐剂，进行第二次免疫注射，注射部位是背部皮下，注射剂量100～110μg/只，饲养2周；

(10)按照步骤(9)的方法，进行第三次免疫注射，饲养10天；

(11)取经第三次免疫后饲养10天的小鼠，心脏采血，析出免疫血清，即为PCV3 Cap单因子血清抗体。

说明：

PET-28a(+)：一种表达载体，含有抗卡那霉素基因，对应的表达宿主菌是大肠杆菌，用于表达目的基因，基因组中含有蛋白标签N-His、N-T7或C-His，可用IPTG或乳糖及其类似物进行诱导表达。

大肠杆菌BL21：一种广泛蛋白表达用宿主菌，又称大肠杆菌BL21(DE3)菌。染色体上携带由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因，在IPTG诱导下可以高效表达T7启动子驱动的外源目的基因。

IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，化学式为C9H18O5S，能够引起乳糖操纵子的转录过程，因此能够诱导乳糖操纵子下游基因对应蛋白的表达。

上样buffer：上样缓冲液，也称loadingbuffer，上述步骤(6)中的上样buffer是指蛋白上样缓冲液，主要采用Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)或Tris甘氨酸、与EDTA盐(乙二胺四乙酸二钠)，必要情况下还需添加SDS(十二烷基硫酸钠)、DTT(二硫苏糖醇)、溴酚蓝、甘油等。

FITC：异硫氰酸荧光素，能与山羊抗小鼠IgG结合形成荧光二抗，在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光。

PBS：phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。

PCV3 Cap单因子血清抗体中“单因子”是指单一抗原。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的用于检测PCV3的荧光免疫试剂盒，以PCV3 Cap单因子血清抗体作为一抗，特异性好，利用FITC标记的山羊抗小鼠IgG作为荧光二抗，检测PCV3感染猪组织时，利用荧光显微镜观察经一抗二抗孵育的组织标本，即可通过荧光位置来进行病毒显示和定位，特异性强、灵敏度高、可重复性好且检测速度快。

保藏信息：

名称：猪圆环病毒3型PCV3 LY株(简称PCV3 LY株)；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；

保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072；

保藏编号：CCTCC NO.V202208；

保藏时间：2022年3月10日。

附图说明

图1为PCV3 ORF2基因核酸电泳，M:5000Marker；1.目的基因；2.阴性水对照。

图2为表达PCV3 Cap蛋白SDS-PAGE电泳，1.工程菌全菌诱导表达蛋白(未纯化)；2.工程菌未诱导表达蛋白；3.纯化后目的蛋白。

具体实施方式

下面结合较佳的具体实施例对本发明进行详细的描述，本发明所用到的化学药品或试剂，可以根据其功能选用已有的其它类型的产品，而不仅限于实施例的具体记载。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1制备PCV3 Cap单因子血清抗体

1、PCV3的Cap蛋白抗原制备

根据PCV3 ORF2基因两端的一段序列与表达性载体PET-28a(+)的多克隆酶切位点，设计针对PCV3 ORF2的如下特异性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCV3 ORF2-F：5′-GGG GGA TCC ATG AGA CAC AGA GCT ATA TTC-3′(加入了BamHⅠ酶切位点)，

PCV3 ORF2-R：5′-GGGAAG CTT TTAGAGAAC GGACTT GTAACG-3′(加入了HindⅢ酶切位点)。

以发明人前期筛选到的一株猪圆环病毒3型的毒株PCV3 LY株(保藏编号CCTCCNO:V202208)的病毒培养液提取的DNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物大小为645bp的目的基因，详见图1。

用DNA纯化回收试剂盒回收扩增的目的基因，同时将目的基因与载体PET-28a(+)双酶切、连接酶连接获得PET-ORF2重组质粒，将该重组质粒按常规方法转入表达性大肠杆菌BL21宿主菌，培养，挑取单个克隆，酶切法鉴定阳性克隆，摇菌，测序，测序结果显示其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，翻译的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。将此序列经NCBI网站的BLAST工具分析发现其为PCV3新的基因序列，与已知PCV3毒株基因序列同源性在87.08-87.85％左右，与已知PCV3毒株氨基酸序列的同源性在90.70～93.49％，与其他PCV(PCV2/PCV4)基因组的同源性为43.2％～51.5％。

为了排除此基因是由于扩增过程中产生的误差，进行了多次扩增和测序，证明PCV3 LY株中扩增出的表达PCV3的Cap蛋白基因为新基因，能够表达新型Cap蛋白。

2、用Cap蛋白作为抗原制备PCV3 Cap单因子血清抗体(一抗)

将测序结果正确的单个克隆重组质粒PET-ORF2转化的表达性BL21宿主菌，接种于5mL含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB细菌培养基，37℃振摇培养过夜，次日取出1mL培养物接种于120mL的LB培养基中，37℃振摇培养2.5h后，菌液摇至半透明半浑浊状态，吸光光度法测得OD600＝0.6～0.8，在诱导前先取10mL作为诱导前对照，并将振摇温度变为30℃加IPTG(终浓度为1.0mmol/L)诱导，诱导4h收集10mL菌液，以诱导未转化PET载体的菌液作为空白对照，以诱导转化PET载体的菌液作为空载体对照。

将诱导表达的菌液取出，离心弃上清，再用0.5mL 1×PBS重悬菌体，超声波裂解破碎细菌后，按1:1加2×上样Buffer煮沸10min，离心取上清，上清用12％SDS-PAGE电泳鉴定分析获得约27～28kDa的目的蛋白，详见图2，利用阳离子亲和纯化试剂盒按规定操作对目的蛋白进行纯化。

将纯化好的目的Cap蛋白用分光光度法定量，稀释至(1.0mg/mL)加等量的弗氏完全佐剂，颈部皮下注射20只BALB/C小鼠，每只0.2mL(100μg/只)。2周后用含弗氏不完全佐剂的Cap蛋白抗原背部皮下免疫第二次，0.2mL/只。再经2周后第三次免疫(方法同第二次)，其中10只未免疫抗原的BALB/C小鼠作为阴性对照组。第三次免疫后第10天，心脏采血致死，析出的免疫血清置-20℃保存，即为PCV3 Cap单因子血清抗体。

3、单因子血清多克隆抗体的敏感性和特异性鉴定

将本实验室OCT包埋保存的腹股沟淋巴结组织(PCV3病毒核酸载量为3.65×10

(1)冰冻切片厚度至少10μm，空气干燥2分钟后，-20℃储存；

(2)切片从-20℃取出后，在通风橱放10分钟以去除水汽，体积浓度4％多聚甲醛固定15分钟；

(3)1×PBS清洗玻片3次，保持玻片湿润；

(4)8％正常羊血清室温孵育30分钟；

(5)PCV3单因子血清抗体(对照用PBS代替)4℃孵育过夜；

(6)1×PBS洗3次，2min/次；

(7)FITC标记羊抗小鼠IgG二抗37℃孵育1小时；

(8)1×PBS洗3次，2min/次；

(9)抗淬灭剂封片；

(10)干片后4℃保存。

将步骤(5)中的PCV3单因子血清抗体血清分别用1×PBS按1:50、1:100、1:200、1:500作四个稀释度进行，在显微镜下观察实验结果，鉴定结果在1：200稀释度时效果较好，阳性猪腹股沟淋巴结组织细胞的细胞质被染成绿色荧光；阴性猪组织细胞未染出绿色荧光；PBS代替一抗作对照。

结果证实本发明制备的PCV3 Cap单因子血清抗体(一抗)敏感性和特异性高，具体可能与优化表达的新毒株Cap蛋白氨基酸序列发生变异有关，使得免疫后的单因子血清产生了针对PCV3特异性抗原表位的抗体。

实施例2荧光免疫试剂盒制备及其敏感性、特异性、重复性验证

1、PCV3荧光免疫试剂盒构建

试剂盒内包括以下表1中所列成分：

表1、猪圆环病毒3免疫荧光检测试剂盒

上述试剂盒中，优选还包括抗淬灭剂，可直接买市售商品，用于减少实验样品的光漂白，以提高固定细胞样品中荧光染料的光稳定性。

2、试剂盒灵敏性、特异性和重复性试验

(1)IFA和PCR对比检测

分别应用IFA(immunofluorescence assay，免疫荧光法，用表1成分的试剂盒)和PCR方法和对由河北、辽宁、河南、山东及四川等地猪场送检的134份临床诊断疑似PCV3感染的组织样品进行对比检测。IFA和PCR检测不同地区来源组织样品结果见下表2。

表2、两种方法对134份样本阳性检出率比较

(2)重复性试验

利用表1成分的试剂盒对134份临床病料进行检测，同时提取样品DNA用PCR方法进行扩增验证该试剂盒检测结果，其中除了山东和四川组织样品检测阳性数一致外：其余检测结果均不一致，PCR方法比IFA方法阳性率均较多，其中河北样品PCR阳性检出率较IFA多2个，辽宁样品PCR阳性检出率较IFA多3个，河南样品PCR阳性检出率较IFA多1个。

同时对上述河北、辽宁及河南的样品进行两次重复检测，IFA方法的第二、第三次检测结果与IFA的第一次结果相同。PCR方法的第二、第三次检测结果与IFA的检测结果一致，与PCR方法的第一次检测结果不同。说明PCR检测结果易出现假阳性结果，也表明表1成分的试剂盒检测结果的特异性、灵敏性及可重复性都非常好。重复性检测结果见下表3所示。

表3、IFA和PCR方法对134份样本重复性检测结果比较

(3)交叉实验

随机抽取一批PCV3荧光免疫试剂盒，对实验室保存的一些病料组织样品进行猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒检测，结果在显微镜下观察均未出现绿色荧光，为阴性结果。进一步说明本发明猪圆环病毒3免疫组化检测试剂盒不会出现假阴性，具有良好的特异性。

综上，本发明PCV3荧光免疫试剂盒具有如下优势：

A检测结果准确性高，不会产生假阳性和假阴性结果。

B敏感性和特异性较高：PCV3 Cap单因子血清抗体工作浓度1：200倍稀释效果较好，且能准确灵敏地对PCV3病毒进行检测诊断，其他病毒均呈阴性。

C临床应用效果较好：用本发明试剂盒和灵敏度较高的PCR方法同时对临床134份疑似PCV3引发的猪组织等样品进行检测，结果检测出23份含有PCV3的感染，此试剂盒检测结果与第二、三次PCR方法检测结果一致，证明了此试剂盒检测结果的灵敏性、特异性及可重复性较高，临床应用效果较好。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东信得科技股份有限公司

<120> 一种用于检测PCV3的荧光免疫试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 1

Met Arg His Arg Leu Val Thr Asn Pro Asn Phe Phe Gly Ala Val Glu

1 5 10 15

Val Ala Met Ser Asp Ile His Val Asp Thr Tyr Tyr Thr Lys Gln Cys

20 25 30

Ser Pro Leu Asn Gly Gly Val Ile Cys Val Gln Pro Trp Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Glu Val Glu Glu Ala Leu Ser Trp Val Ser Ala Gly Ser Ser Arg

50 55 60

Gln Asn Trp Phe Gly Gly Glu Val Thr Ala Val Ile Ser Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Lys Asp Glu Ser Tyr Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly Pro

85 90 95

Arg Ala Ile Asp Leu Asp Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Pro Glu

100 105 110

His Ser Phe Cys Leu Leu Ser Arg Arg Asn Tyr Arg Ala Glu Cys Asn

115 120 125

Phe His Leu Arg Tyr Leu Ile Ile Phe Lys Ala Asn Gly Ser Phe Pro

130 135 140

Phe Val Pro Ala Gly Asn Glu Val Val Gly Val Pro Gly Leu Val Ile

145 150 155 160

Leu Arg Gly Ser Asn Gly Asn Asp Val His Gly Gly Val Phe Leu Cys

165 170 175

Val Val Cys Ala Ser Cys Gly Pro Pro Asn Glu Ser Phe Ser Ser Asp

180 185 190

Ile Ala Pro Ser Val Ala Ser Ser Ser Pro Trp Ala Gly Ser Ser Ser

195 200 205

Glu Tyr Ser Ser Val Ser

210

<210> 2

<211> 645

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 2

atgagacaca gacttgtaac gaatccaaac ttctttggtg ccgtagaagt cgctatgtca 60

gatattcatg tcgacacata ctacacaaag cagtgctccc cattgaacgg tggggtcata 120

tgtgttcagc catggggtgg gtctggagaa gttgaagagg ctttgtcctg ggtgagcgct 180

ggtagttccc gccagaattg gtttgggggt gaagtaacgg ctgtgattag ctttgaatat 240

tataagatta aagatgaaag ttaccaaaca aaaactatgt tcgggccaag agccatagat 300

ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg cccgaacata gtttttgttt gctgagccgg 360

agaaattaca gggctgagtg taactttcat cttcgttatc ttataatatt caaagctaat 420

ggcagtttcc cattcgttcc ggcgggtaat gaagtggttg gcgtgccagg gcttgttatt 480

ctgaggggtt ccaacggaaa tgacgttcat ggtggagtat ttctttgtgt agtatgtgcc 540

agctgtgggc ctcctaatga aagcttttct tctgacatag cgccttctgt ggcgtcgtcg 600

tctccttggg cggggtcttc ttctgaatat agctctgtgt cttaa 645