一种抑制人癌细胞在裸鼠体内增殖的化合物

技术领域

本发明涉及一种从深海热液口嗜热菌中粗提的化合物，具体涉及一种抑制人癌细胞在裸鼠体内增殖的化合物。

背景技术

化合物在细胞内发挥作用，一般是通过与特定的蛋白相互作用，通过影响蛋白质的功能，然后进一步影响细胞的生长。但是如何寻找能够影响靶标蛋白的小分子化合物一直是个挑战。

p53蛋白作为转录因子，是基因组的守卫者，当基因组发生损伤会激活p53蛋白的转录活性，从而引起细胞周期的阻滞和细胞的凋亡。据已有的统计发现，50％的人类癌症中p53均发生了点突变，从而影响了p53蛋白的功能。且有相关文献报道，突变的p53蛋白恢复活性能够显著的阻止癌症的发生和发展。

传统的p53蛋白激活因子的筛选多是从细胞层面的筛选，通过构建p53蛋白突变的细胞系，然后从已有的化合物库中筛选出能够影响p53突变细胞系的化合物，而该化合物不影响p53野生型的细胞系。通过这种筛选方法，目前已经发现了几种能够激活突变型p53蛋白的化合物。这些化合物中，有的是直接与突变的p53蛋白结合从而提高p53蛋白的稳定性而发挥功能，另一方面，有的化合物可以间接的通过改变与p53蛋白相互作用的蛋白而激活突变的p53蛋白。因为p53蛋白在癌症中发生突变的几率很大，所以找到能特异性与突变型p53蛋白结合并恢复其野生型的功能，对于癌症的治疗会提供一个有益的思路。

发明内容

为了解决背景技术中的问题，本发明提出了一种抑制人癌细胞在裸鼠体内增殖的化合物，从深海热液口嗜热菌中通过葡聚糖凝胶的方法筛选靶蛋白结合化合物的方法获取本发明的化合物，本发明中该化合物能够抑制裸鼠体内p53基因突变的人类乳腺癌细胞的生长，并通过衍生物实验证明化合物羟基对抑制肿瘤细胞生长起到重要的作用，最后的毒理实验表明，在正常的剂量条件下，对小鼠的毒副作用不明显。

本发明采用的技术方案如下：

本发明的抑制人癌细胞在裸鼠体内增殖的化合物为2-[(4-羟苯基)氨基]酚(2-[(4-hydroxybenzyl)amino]phenol，简称HBAP)，是一种苯醌类化合物，所述化合物从一株深海热液口嗜热菌中筛选得到。

所述化合物与p53蛋白结合后能够改变p53蛋白构象，p53蛋白通过葡聚糖凝胶G50筛选比未结合的p53蛋白先流出。

所述化合物的衍生物HBAP1、HBAP2、HBAP3、HBAP4能抑制p53基因突变的肿瘤细胞生长；在化合物的衍生物中的羟基均被替代后，对肿瘤细胞的生长抑制作用消失。

按照小鼠体重万分之一的比例喂食与重组p53蛋白结合的化合物HBAP，小鼠的体重和血细胞数目没有明显变化，说明正常剂量下对小鼠毒副作用不明显。

所述化合物能与人的重组p53蛋白结合。

所述化合物与人的重组p53蛋白结合的具体方法包括以下步骤：

步骤a)对被噬菌体GVE2感染后的嗜热菌Geobacillus sp.E263产生的化合物进行萃取后得到嗜热菌粗体化合物；

步骤b)p53蛋白的纯化；

步骤c)获取重组的His标签p53蛋白；

步骤d)获得嗜热菌粗体化合物与重组p53蛋白结合的化合物。

所述步骤a)具体为：Geobacillus sp.E263在TTMM(1升培养基含有蛋白胨4克、酵母膏2克、氯化钠1克、氯化镁1克)培养基中60℃条件下培养24个小时，然后将菌液离心弃上清得到菌体；将含有80％甲醇的萃取液和菌体一起孵育24小时，然后过滤取过滤液，连续萃取三次，将三次萃取液合并然后过滤；最后将过滤的萃取液通过旋转蒸发仪蒸发至半固体状，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到嗜热菌粗体化合物；

所述步骤b)具体为：从人细胞cDNA文库中通过PCR扩增获得人p53基因，并通过点突变的方法得到野生型和突变型为R280K的p53基因片段，然后将p53基因片段双酶切后连接至原核表达载体pET 28a上，经测序正确后，转化至原核表达菌株BL21DE3。

所述步骤c)具体为：将步骤b)中的原核表达菌株BL21DE3置于LB培养基中，在37℃培养至OD600为0.6左右时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其在培养液中的终浓度为0.5mM，然后继续在37℃下培养4个小时；将培养好的菌液离心获得含有p53蛋白的菌体细胞；用含有20mM咪唑的Hepes缓冲液(pH 8.0)将菌体重悬，然后通过超声破碎菌体，离心后取上清液与Ni-NTA琼脂糖介质结合，4℃孵育3个小时后，用50ml的p53蛋白结合缓冲液清洗琼脂糖介质，再用300mM咪唑浓度的Hepes缓冲液洗脱介质，得到重组的His标签p53蛋白；

所述步骤d)具体为：将步骤a)中获得的嗜热菌粗体化合物与步骤c)得到的重组蛋白在25℃温度下孵育1小时，通过填料为sephadex G50(葡聚糖凝胶G50)的葡聚糖凝胶层析柱，收集280nm波长下的蛋白峰的流出液，当靶标蛋白p53蛋白与嗜热菌粗体化合物结合后，可能会改变靶标蛋白结构，使靶标蛋白在葡聚糖G50凝胶中先流出，因此通过监测蛋白流出峰可以筛选得到靶标蛋白结合的化合物；流出液中加入终浓度为80％的甲醇溶液萃取，萃取结束后离心去除变性的蛋白后，将上清液旋转蒸发浓缩即为与重组p53蛋白结合的化合物。

将得到的化合物，用GC-MS(气相色谱质谱联用仪)进行鉴定，与标准质谱数据库比对后，得到与重组p53蛋白结合的化合物结构。

本发明的有益效果：

本发明使用分子筛的方法从中筛选得到一种能够与突变型p53蛋白结合的化合物的方法，该化合物能够在有效浓度10mg/mL时，抑制裸鼠体内p53基因突变的癌细胞的增殖，并对小鼠的免疫细胞没有明显影响。

附图说明：

图1是原核表达His标签的野生型和R280K突变的p53蛋白，通过SDS-PAGE电泳分析蛋白的表达。

图2是重组的野生型p53蛋白与化合物孵育后，经过分子筛sephadexG50分离，以及GST野生型蛋白单独和化合物分别经过分子筛，纵坐标为在280nm下吸光值。

图3是重组的R280K突变型p53蛋白与化合物孵育后，经过分子筛sephadexG50分离，以及重组突变型p53蛋白和化合物分别经过分子筛，纵坐标为在280nm下吸光值。

图4是重组p53蛋白与化合物孵育后，经过分子筛sephadexG50分离，以及重组p53蛋白和化合物分别经过分子筛，纵坐标为在280nm下吸光值。

图5是能够与突变型R280Kp53蛋白结合的四种衍生化合物结构。

图6是三种衍生物的合成途径。

图7是四种衍生物对突变型p53蛋白在细胞内的转录活性的影响。

图8是本发明的化合物和玉米油喂食小鼠后，对小鼠体重的影响情况。

图9是本发明的化合物和玉米油喂食小鼠后，小鼠白细胞和红细胞数目变化的情况，(a)为小鼠白细胞数目变化的情况，(b)为小鼠红细胞数目变化的情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的抑制人癌细胞在裸鼠体内增殖的化合物为2-[(4-羟苯基)氨基]酚(2-[(4-hydroxybenzyl)amino]phenol，简称HBAP)，HBAP包含有两个羟基，这两个羟基可能对化合物功能起十分重要的作用，为此合成了HBAP的四种衍生物，即两个羟基中的一个羟基分别被氯原子取代(HBAP-1和HBAP-2)、两个羟基都被氯原子取代(HBAP-3)和两个羟基都变为羟甲基(HBAP-4)，具体结构式如图5所示。

三种衍生物的合成途径如图6所示。

图7是四种衍生物对突变型p53蛋白在细胞内的转录活性的影响。分别用HBAP的4种衍生物分别处理带有突变型p53R273H的乳腺癌细胞(MDA-MB-468)，通过双荧光报告试验分析突变型p53蛋白的转录活性。试验结果表明，当两个羟基都被氯原子或甲基取代后，化合物就不能激活突变型p53蛋白的转录活性，但是当两个羟基只有一个被氯原子取代时，对化合物的活性影响不明显。这些试验结果说明，HBAP的两个羟基在HBAP激活突变型p53的转录活性中发挥至关重要的作用，这两个羟基是HBAP的活性位点。

化合物从深海热液口嗜热菌中筛选方法如下：

a)对被噬菌体GVE2感染后的嗜热菌Geobacillus sp.E263产生的化合物进行萃取后得到嗜热菌粗体化合物。Geobacillus sp.E263在TTMM(1升培养基含有蛋白胨4克、酵母膏2克、氯化钠1克、氯化镁1克)培养基中60摄氏度条件下培养24个小时，然后将菌液离心弃上清得到菌体。将含有80％甲醇的萃取液和菌体一起孵育24小时，然后过滤取过滤液，连续萃取三次，将三次萃取液合并然后过滤。最后将过滤的萃取液通过旋转蒸发仪蒸发至半固体状，用DMSO(二甲基亚砜)溶解，得到嗜热菌粗体化合物。

b)p53蛋白的纯化，从人细胞cDNA文库中通过PCR的方法获得人p53基因，并通过点突变的方法得到野生型和突变型为R280K的p53基因片段，然后将基因双酶切后连接至原核表达载体pET 28a上，经测序正确后，转化至原核表达菌株BLDE3中。

c)将步骤b)中的原核表达菌株BL21DE3在LB培养基中，在37℃培养至OD600为0.6左右时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其在培养液中的终浓度为0.5mM，然后继续在37℃下培养4个小时。将培养好的菌液离心获得含有p53蛋白的菌体细胞。用含有20毫摩尔每升咪唑的Hepes缓冲液(pH 8.0)将菌体重悬，然后通过超声破碎菌体，离心后取上清液与Ni-NTA琼脂糖介质结合，4摄氏度孵育3个小时后，用50ml的p53蛋白结合缓冲液清洗琼脂糖介质，再用300毫摩尔每升咪唑浓度的Hepes缓冲液洗脱介质，得到重组的His标签p53蛋白。

d)将步骤a)中获得的化合物与步骤c)得到的重组蛋白在25℃温度下孵育1小时，通过填料为sephadex G50(葡聚糖凝胶G50)的葡聚糖凝胶层析柱，收集280nm波长下的蛋白峰的流出液，当靶标蛋白与目标化合物结合后，可能会改变靶标蛋白结构，使靶标蛋白在葡聚糖G50凝胶中先流出，因此通过监测蛋白流出峰可以筛选得到靶标蛋白结合的化合物。流出液中加入终浓度为80％的甲醇溶液萃取，萃取结束后离心去除变性的蛋白后，将上清液旋转蒸发浓缩即为与重组p53蛋白结合的化合物。将得到的化合物，用GC-MS(气相色谱质谱联用仪)进行鉴定，与标准质谱数据库比对后，得到与重组p53蛋白结合的化合物结构。

实验结果：

采用野生型及突变型p53重组菌，大量诱导蛋白表达，然后通过GST标签蛋白纯化介质，分别纯化获得野生型和突变型p53蛋白，通过SDS-PAGE电泳分析蛋白的表达结果如图1所示。

为了从GVE2与Geobacillus sp.E263互作产生的化合物中筛选与突变型p53蛋白特异结合的化合物，采用GVE2感染Geobacillus sp.E263，然后萃取化合物，再将萃取的化合物分别与纯化的重组野生型p53蛋白和突变型p53蛋白孵育，随后孵育物通过分子筛(尺寸排阻法)，测定流出物的OD

重组的R280K突变型p53蛋白与化合物孵育后，经过分子筛sephadexG50分离，以及重组突变型p53蛋白和化合物分别经过分子筛，纵坐标为在280nm下吸光值如图3所示。融合蛋白GST-p53

重组p53蛋白与化合物孵育后，经过分子筛sephadexG50分离，以及重组p53蛋白和化合物分别经过分子筛，纵坐标为在280nm下吸光值如图4所示。GST-p53融合蛋白与萃取的化合物孵育后，其通过分子筛的流出时间与GST-p53融合蛋白通过分子筛的时间相同，这表明无化合物与野生型p53蛋白结合。

衍生物的抗肿瘤能力和毒理实验方法如下：

分别替代了其中一个羟基或者两个羟基都被替代，然后检测每种衍生物对突变的p53基因在乳腺癌细胞转录活性的影响。

取10只体重在20克左右的小白鼠，分成两组，然后以2mg化合物每只的剂量喂食小鼠，连续喂食14天，喂食期间每天监测小鼠体重的变化，喂食结束后检测小鼠血细胞数目的变化。

如图8所示，连续喂食小鼠两周后，实验组和对照组小鼠的体重未发生明显的差异性变化，因此说明在低剂量下化合物对小鼠没有毒副作用。

如图9所示，在HBAP化合物喂食和对照组玉米油喂食条件下，小鼠的白细胞数目均维持在10