一种靶向Frizzled7人源化抗体及其制备方法与应用

本申请是分案申请，本分案申请的母案申请日为2019年11月6日，申请号为201911078254.4，发明名称为“一种靶向Frizzled7人源化抗体及其制备方法与应用”。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种靶向Frizzled7人源化抗体及其制备方法与应用。

背景技术

Wnt信号通路是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路，其在动物胚胎的早期发育、器官形成和肿瘤的发生发展中，发挥至关重要的作用。Wnt蛋白家族与受体Frizzled(Fzd)的N端胞外结构区CRD(cysteine-rich domain)结合，与Dvl(disheveled)蛋白相互作用并激活下游信号通路。Fzd蛋白是一类具有七次跨膜分子结构的Wnt受体家族，该家族中有10个成员蛋白，Frizzled-7(Fzd7)为成员之一。研究表明Wnt受体Fzd7异常表达于不同种类的癌症中(包括三阴性乳腺癌(TNBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝癌(HCC)等)(Polakis P,2012,EMBO J,31:2737-46；King TD et al,2012,J Cell Biochem,113:13-8)；Fzd7通过激活经典Wnt通路(Wnt/β-catenin)来诱导肿瘤的发生和转移。

Wnt通路参与肿瘤的侵袭和转移，且对肿瘤血管生成也有调节作用，对Fzd7进行基因敲除可以显著抑制肿瘤细胞增殖、移植瘤生长及血管新生。Wnt信号和肿瘤干细胞行为也存在密切联系，Fzd7就是肿瘤干细胞标记物之一，且这些肿瘤干细胞中Fzd7的上调与肿瘤化疗耐受以及病人的低生存率显著相关(Barker N et al.,2009,Nature,457:608-11)。另外Fzd7的“context-specific functions”暗示了选择性靶向Fzd7可以在不影响正常组织稳态的前提下治疗癌症。综上，Fzd7是多种肿瘤的潜在治疗靶点(Kahn M,2014,Nat RevDrug Discov,13:513-32)。

目前靶向Fzd7方法主要有RNA干扰、小分子抑制剂、小干扰肽、可溶性重组Fzd7蛋白以及抗Fzd7单抗。Fzd7shRNA可以有效抑制TNBC细胞的增殖侵袭及肿瘤生长；小干扰肽RHPDs或小分子抑制剂FJ9干扰Fzd7和分散蛋白(Dvl)的结合来阻断Wnt信号，并有效抑制小鼠移植瘤的生长(Nambotin SB et al.,2011,J Hepatol,54:288-99；Fujii N et al.,2007,Cancer Res,67:573-9)；使用Fzd7的胞外区重组蛋白(sFzd7)与细胞表面Fzd7竞争性结合Wnt3配体来阻断Wnt/β-catenin信号也并抑制肿瘤发生发展(Wei W et al.,2011,MolCancer,10:16)；以上几种方法目前仍处于临床前研究阶段。相比之下，更利于临床转化的方法是利用抗体来特异性靶向Fzd7，OncoMed公司已经开发出了一种靶向Fzd7CRD结构域的单抗OMP-18R5(vantictumab)，目前正处于晚期非小细胞肺癌(NSCLC)、晚期HER2(人表皮生长因子受体2)阴性乳腺癌以及晚期胰腺癌的Ⅰ期临床试验中(Flanagan DJ et al.,2019,Cancer Res,79:970-81；Gurney A et al.,2012,Proc Natl Acad Sci USA,109:11717-22)。OMP-18R5还与Fzd受体家族中的Fzd1、Fzd2、Fzd5和Fzd8有交叉反应，预示OMP-18R5可能被用于多种癌症的治疗，但是对靶标蛋白特异性的缺失可能会导致脱靶效应而影响抗体的功效。

Wnt蛋白家族与Fzd的N端胞外结构区CRD(cysteine-rich domain)特异性结合，与Dvl蛋白相互作用并激活下游信号通路。Fzd的CRD在与配体结合中发挥至关重要的作用，Fzd受体家族该区域序列不管在种属间还是跨种属都高度保守。Fzd7的CRD区序列与Fzd家族其他成员均有超过40％的同源性，特别是与Fzd1和Fzd2，同源性达到近80％(Janda,CYet al.,2012,Science,337:59-63)。选择Fzd7 CRD段为抗原筛选得到的抗体，可以阻断Fzd与其配体结合的关键位点，但其也有可以与Fzd家族其他成员结合的几率，尤其是Fzd1/2，因此该类抗体在治疗过程中会出现脱靶风险(OMP-18R5即是以Fzd7CRD段蛋白为抗原筛选得到的抗体)。若筛选到仅特异性靶向某一Fzd受体的抗体，不仅可以降低脱靶效应增强抗肿瘤活性，还可以作为强大的工具来研究各Fzd受体的“context-specific roles”，进而来阐明Wnt信号通路及其作用机制。

相较于抗体Fab片段、单链抗体(scFv)以及纳米抗体(Nanobody)，IgG样全长抗体(Full-length Antiody)具有完整的抗体结构，性质稳定，体内半衰期长，除了可以阻断靶标信号通路还可以发挥Fc片段介导的ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)、CDC(补体依赖的细胞毒性作用)等免疫效应。2014-2018上市的43个抗体类药物中仅有1个人源Fab片段和1个纳米抗体，除了少数Fc融合蛋白和抗体偶联药物(ADC)外，几乎均为全长抗体，显示出了全长抗体卓越的临床和药物价值。

在常用的抗体筛选技术中，杂交瘤技术筛选获得的鼠源全长抗体具有较高的亲和力。但是鼠源抗体在临床应用中会使患者产生人类抗小鼠抗体反应(HAMA)；将鼠源抗体的可变区(V区)基因与人抗体的恒定区(C区)基因拼接为嵌合抗体基因，表达出的嵌合抗体降低了患者发生HAMA的风险；进一步将鼠源抗体的互补决定区(CDR区)移植到人的可变域中而开发的人源抗体，则进一步降低嵌合抗体中针对小鼠可变区域基因产生抗药物抗体(ADA)反应的风险。抗体人源化设计中通常选择IgG1或者IgG4两个亚型的抗体为模板，其Fc端可根据其生理学机理，通过位点突变或者去糖基化等进一步增强或者削弱ADCC，CDC等细胞免疫活性。

在抗体V区中，起支架作用的框架区(FR区)不仅提供了CDR的空间构象环境，还会参加抗体结合位点正确构象的形成。因此，简单的CDR移植往往会丧失或降低原抗体的亲和力(Jones PT et al.,1986,Nature,321:522-5；Al-Lazikani B et al.,1997,J MolBiol,273:927-48)。应用生物信息学软件Discoverystudio设计鼠源FR区非关键氨基酸人源化突变可以有效降低抗体亲和力丢失风险。应用抗体数据库和生物信息学软件进行人源化设计的优势主要在于：1、根据重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列搜索HumanGermline数据库，分别选择与VH和VL同源性最高的序列作为人源化设计模板；2、通过Discoverystudio软件对鼠源抗体进行结构模拟，挑选可信度最高的模拟结果指导人源化设计，保留对抗体结构稳定性起关键作用的鼠源氨基酸，并依据模板将不重要的位点突变为人源氨基酸。该方法可以得到人源化程度尽可能高的抗体，并且最大程度保证抗体的活性。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种靶向Frizzled7人源化抗体及其制备方法与应用。

本发明使用杂交瘤技术筛选抗Frizzled7(Fzd7)抗体，并对其进行人源化改造。所得靶向Frizzled7人源化抗体保留了鼠源抗体与重组人Frizzled7蛋白(rhFzd7)的高亲和力，可以与肿瘤细胞表面以及肿瘤组织的Fzd7特异性结合，有效阻断Wnt/β-catenin信号通路；是一种全新的具有靶向Fzd7功能和潜在抗肿瘤活性的高特异性基因工程抗体。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种靶向Frizzled7单克隆抗体，记为SHH002，所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002也可以表述为抗Fzd7鼠源抗体SHH002，所述靶向Frizzled7单克隆抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID No.5所示的CDR1，SEQ ID No.6所示的CDR2，和SEQ ID No.7所示的CDR3；

所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID No.8所示的CDR1’，SEQ IDNo.9所示的CDR2’，和SEQ ID No.10所示的CDR3’。

所述靶向Frizzled7单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述靶向Frizzled7单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明的鼠源单克隆抗体SHH002可与Fzd7特异性结合，并表现出与重组人Fzd7蛋白的高亲和力，生物膜层干涉技术(BLI)检测其亲和力常数KD小于1×10

本发明提供一种靶向Frizzled7人源化抗体，记为SHH002-hu1，所述靶向Frizzled7人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQID No.11所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。SHH002-hu1，与鼠源抗体SHH002相比其人源化程度高达96.5％。

所述靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1的重链碱基序列如SEQ ID No.21所示，其中恒定区为从SEQ ID No.21所示碱基序列的第346位至第1335位。

所述靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1的轻链碱基序列如SEQ ID No.22所示，其中恒定区为从SEQ ID No.22所示碱基序列的第334位至第654位。

所述靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1的重链氨基酸序列如SEQ ID No.23所示，其中恒定区为从SEQ ID No.23所示碱基序列的第116位至第445位。

所述靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1的轻链氨基酸序列如SEQ ID No.24所示，其中恒定区为从SEQ ID No.24所示碱基序列的第112位至第218位。

本发明提供另一种靶向Frizzled7人源化抗体，记为SHH002-hu2，所述靶向Frizzled7人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQID No.13所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。

本发明提供另一种靶向Frizzled7人源化抗体，记为SHH002-hu3，所述靶向Frizzled7人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQID No.15所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。

本发明提供另一种靶向Frizzled7人源化抗体，记为SHH002-hu4，所述靶向Frizzled7人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQID No.17所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。

本发明提供另一种靶向Frizzled7人源化抗体，记为SHH002-hu5，所述靶向Frizzled7人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQID No.19所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.20所示。

本发明提供一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu2、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu3、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu4、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu5中的任意一种；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

本发明提供一种核苷酸，所述核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu2、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu3、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu4、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu5中的任意一种；或(2)所述的重组蛋白。

本发明提供一种表达载体，其特征在于，含有所述核酸。

本发明提供一种重组宿主细胞，其特征在于，含有所述表达载体。

本发明提供一种可以稳定表达如所述靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、靶向靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu2、靶向靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu3、靶向靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu4、靶向靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu5中的任意一种的重组细胞株。

本发明提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu2、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu3、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu4、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu5中的任意一种。

本发明提供一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：

(a)所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu2、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu3、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu4、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu5中的任意一种或所述的重组蛋白；和(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

本发明提供一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu2、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu3、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu4、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu5中的任意一种，所述的重组蛋白，或所述免疫偶联物；以及药学上可以接受的载体。

本发明提供所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002的制备方法，包括以下步骤：

用Fzd7胞外CRD区蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得可表达鼠源单克隆抗体SHH002的杂交瘤细胞株，利用此细胞株制备所述抗体。

本发明提供所述靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu2、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu3、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu4、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu5中的任意一种抗体的制备方法，包括以下步骤：

用Fzd7胞外CRD区蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得可表达靶向Frizzled7单克隆抗体的杂交瘤细胞株，利用此细胞株制备得到靶向Frizzled7单克隆抗体；所得杂交瘤细胞株，分类命名为表达抗Fzd7鼠源抗体SHH002的杂交瘤细胞株FL253-1，该细胞株已经进行了保藏，保藏日期为2019年10月30日，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO:C2019279，保藏地址为中国武汉武汉大学；

应用Discoverystudio软件设计靶向Frizzled7单克隆抗体的FR区非关键氨基酸突变，最终获得所述人源化程度大于96％的靶向Frizzled7人源化抗体。

具体而言，将靶向Frizzled7单克隆抗体的V区基因与人IgG1抗体C区基因拼接，构建表达嵌合抗体SHH002-C，BLI法检测亲和力常数为8.02×10

本发明还对靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu2、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu3、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu4、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu5进行了亲和力、特异性、靶向性及初步生物学活性进行了验证。

本发明还提供所述靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu2、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu3、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu4、靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu5在制备治疗肿瘤药物中的应用。

所述靶向Frizzled7单克隆抗体、靶向靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、靶向靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu2、靶向靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu3、靶向靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu4、靶向靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu5的作用机理是：特异性与人Fzd7结合，抑制Wnt配体与Fzd7受体的结合，阻断Wnt信号通路的转导。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明的抗Fzd7靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1保留了鼠源单抗SHH002与重组人Fzd7蛋白的高亲和力(KD值均小于1×10

附图说明

图1为Western blot验证鼠源抗体SHH002与免疫原rhFzd7结合的结果图。图1A：免疫原重组蛋白rhFzd7 SDS-PAGE电泳后转印至NC膜，并进行立春红染色，泳道1-5为rhFzd7蛋白。图1B：对NC膜不同泳道进行抗体孵育，泳道1-4分别用1#、2#、3#、11#腹水进行孵育，泳道5用小鼠血清孵育(作为阳性对照)，随后用羊抗鼠-HRP标签二抗进行孵育，最后DAB避光显色。四株腹水均检测到目标条带，其中腹水1#、2#、3#效果较好。箭头所指条带为目的条带所在位置，下部条带疑为蛋白降解结合条带(蛋白立春红染色后图片在该位置也有明显条带)。

图2为SDS-PAGE电泳对纯化后抗体1#、2#、3#检测结果。泳道1-7为非还原样品，泳道8-10为还原样品。泳道1-3：1#、2#、3#抗体；泳道4：IPI阳性对照抗体；泳道5：Blank；泳道6：N/A质控；泳道7：Control BSA；泳道8-10：1#、2#、3#抗体；泳道11：IPI阳性对照抗体；泳道12：Blank；泳道13：Control BSA。

图3为间接ELISA法测定鼠源抗Fzd7抗体亲和力的反应曲线图。图3A：1#抗体与rhFzd7的反应曲线图；图3B：2#抗体与rhFzd7的反应曲线图；3#抗体与rhFzd7的反应曲线图。测得的抗体亲和力分别为1#抗体：4.06×10

图4为Fortebio仪器测得的抗原(rhFzd7)抗体(SHH002)结合解离动力学过程拟合曲线图。600s到1000s表示结合，1000s到1580s表示解离，图中的2条曲线从上到下分别表示抗体与750nM、300nM浓度的rhFzd7结合的曲线。每个rhFzd7浓度都两条曲线，绿色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。

图5为PCR扩增SHH002重轻链V区基因的核酸电泳检测图。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳，泳道1-5分别对应不同引物PCR结果；泳道1：SHH002重链可变区PCR结果，泳道2-5：SHH002轻链可变区PCR结果，目的抗体基因为330bp位置。

图6为SHH002 VH和VL序列与Human Germline数据库序列比对结果。图6A：SHH002VL序列与Human Germline数据库序列比对结果，VL与人Germline IGKV1大类序列同源性最高。图6B：SHH002 VH序列与Human Germline数据库序列比对结果，VH与人Germline IGHV1大类序列同源性最高。图中VH和VL序列中红色标记序列依次为CDR1、CDR2、CDR3。

图7为SHH002潜在修饰位点分析和免疫原性分析结果。图7A：SHH002潜在修饰位点分析结果，预测VH/VL有潜在修饰位点(双划线标记序列，单划线标记序列依次表示CDR1、CDR2、CDR3)。图7B：SHH002免疫原性分析结果，预测VH/VL有部分强免疫原性位点(框内标记序列，单划线标记序列依次表示CDR1、CDR2、CDR3下划线标记序列，双划线标记为HotSpot)。

图8为使用生物信息学软件Discoverystudio对SHH002进行结构模拟结果。图8A：可变区结构模拟，可信度98％，左侧为重链可变区，右侧为轻链可变区；图8B：可变区CDR结构模拟，CDR区域(灰色标记)在结构模型中位置；图8C：可变区表面电荷模拟图，表面电荷图描述：红色为负电荷、蓝色为正电荷，箭头指向CDR区域(左)、白色椭圆框标示为CDR区域(右)。

图9为嵌合抗体SHH002-C SDS-PAGE电泳检测结果。泳道1-4为非还原样品，泳道5-7为还原样品。泳道1：N/A质控；泳道2：SHH002-C；泳道3、4：IPI阳性对照抗体；泳道5：N/A质控；泳道6：SHH002-C；泳道7：IPI阳性对照抗体。

图10为Fortebio仪器测得的抗原(rhFzd7)抗体(SHH002-C)结合解离动力学过程拟合曲线图。600s到1000s表示结合，1000s到1580s表示解离，图中的3条曲线从上到下分别表示抗体与300nM、100nM，33.33nM浓度的rhFzd7结合的曲线。每个rhFzd7浓度都两条曲线，蓝色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。

图11为靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu SDS-PAGE电泳检测结果。泳道1-7为非还原样品，泳道8-14为还原样品。泳道1：N/A质控；泳道2：IPI阳性对照抗体；泳道3-7：SHH002-hu1—SHH002-hu5；泳道8：N/A质控；泳道9：IPI阳性对照抗体；泳道10-14：SHH002-hu1—SHH002-hu5。

图12为靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu SEC-HPLC(分子排阻色谱)检测结果，图12包括图12-1与图12-2。图12-1中A：IPI阳性对照抗体的SEC-HPLC色谱图，参比品出峰时间11.2min，峰型对称，基线平稳，系统适应性通过；图12-1中B：鼠源抗体SHH002的SEC-HPLC色谱图，参比品出峰时间9.5min，峰型对称，基线平稳，系统适应性通过；图12-1与图12-2中C-G：分别为靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1—SHH002-hu5的SEC-HPLC色谱图，参比品出峰时间分别为9.7min、10.8min、9.5min、9.6min、9.5min，峰型对称，基线平稳，系统适应性通过。

图13为ELISA法检测SHH002-hu与rhFzd7的结合结果图。将rhFzd7包被于酶标板，加入不同浓度(8个浓度梯度)的一抗(SHH002及SHH002-hu1—SHH002-hu5)，首孔10μg/ml，往下3倍梯度稀释，室温孵育1h，随后加入对应二抗并进行TMB显色，OD

SHH002-hu1—SHH002-hu3的EC

图14为Fortebio仪器测得的抗原(rhFzd7)抗体(SHH002-hu1—SHH002-hu3)结合解离动力学过程拟合曲线图。图14A-C分别为SHH002-hu1、SHH002-hu2、SHH002-hu3与rhFzd7结合解离曲线，0s到300s表示结合，300s到600s表示解离，图中的4条曲线从上到下分别表示抗体与400nM、100nM，25nM和6.25nM浓度的rhFzd7结合的曲线。每个rhFzd7浓度都两条曲线，红色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。

图15为Fortebio仪器测得的SHH002-hu1与蛋白

rhFzd1-Fc/rhFzd2-Fc/rhFzd5-Fc/rhFzd8-Fc结合解离动力学过程拟合曲线图。图15A-D分别为SHH002-hu1抗体与rhFzd1-Fc、rhFzd2-Fc、rhFzd5-Fc、rhFzd8-Fc蛋白结合解离曲线，0s到300s表示结合，300s到600s表示解离，图中的4条曲线从上到下分别表示抗体与400nM、100nM，25nM和6.25nM浓度的rhFzd1-Fc/rhFzd2-Fc/rhFzd5-Fc/rhFzd8-Fc结合的曲线。每个蛋白浓度都有两条曲线，波动曲线是仪器实际测定曲线，平稳曲线为计算机拟合所得。图中结果看出SHH002-hu1与rhFzd1-Fc/rhFzd2-Fc/rhFzd5-Fc/rhFzd8-Fc蛋白均没有明显结合。

图16为细胞免疫荧光法检测SHH002-hu1与细胞表面Fzd7结合的结果图，图16包括图16-1与图16-2。图16-1中A：Western blot检测肿瘤细胞(三阴性乳腺癌细胞株：MDA-MB-231，MDA-MB-468；非小细胞肺癌细胞株：H1299，H1975，A549)Fzd7表达情况结果。检测抗体为Rabbit Anti-Human Fzd7 Antibody(购自Abcam)，HEK293T细胞作为正常细胞对照。图16-1中B：细胞免疫荧光法检测SHH002-hu1与过表达Fzd7 HEK293T细胞(Fzd7 OE)结合的结果图，未转染HEK293T以及转染空载体(GFP标签)的HEK293T细胞作为对照，bar＝50μm。图16-2中C：细胞免疫荧光法检测SHH002-hu1与MDA-MB-231、MDA-MB-468、H1299、H1975、A549细胞结合的结果图，bar＝50μm。

图17为免疫组化方法检测SHH002-hu1与肿瘤组织中Fzd7结合的结果图。右边两幅图是非小细胞肺癌病人肿瘤组织的检测结果，左边两幅图是癌旁组织的检测结果。上面两幅图为检测抗体(Rabbit Anti-Human Fzd7 Antibody，购自Abcam)的检测结果，下面两幅图为SHH002-hu1的检测结果。Bar＝20μm。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：抗Fzd7单克隆抗体杂交瘤细胞的制备

1、免疫动物：本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠，由上海第一人民医院(松江)动物实验中心提供，免疫佐剂购自Sigma公司，免疫原为重组人Fzd7胞外CRD区蛋白(rhFzd7)。采用常规免疫方法对BALB/c小鼠进行免疫。初免后每隔四周免疫一次，共免疫三次。使用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清的抗体效价，选取免疫效价检测值最高的小鼠追加免疫一次，三天后取该鼠的脾脏进行细胞融合。

2、细胞融合：

1)骨髓瘤细胞(Sp2/0)的准备：于融合前两周复苏Sp2/0，置于5％CO

2)饲养细胞的准备：细胞融合前一天，取3-4周龄健康BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，调整细胞浓度至l-5×10

3)脾细胞的准备：取三天前加强免疫的小鼠，无菌摘取脾脏，收集脾细胞悬液，脾细胞计数后备用。

4)细胞的融合：将Sp2/0细胞和免疫脾细胞悬液混匀，使用聚乙二醇融合细胞，然后转入96孔细胞培养板中，置于5％CO

5)杂交瘤细胞的筛选：融合后注意观察杂交瘤细胞生长状况，待细胞长到孔底的1/4-1/3时吸出上清进行间接ELISA检测。以P/N≥2.5作为阳性判断标准，用未免疫小鼠血清作阴性对照，用抗体稀释液做空白对照。对检测为阳性的细胞进行扩大培养，同时进行克隆化培养。

6)杂交瘤细胞的克隆化培养：克隆化培养采用有限稀释法，待细胞长到孔底的l/4-1/3时，对细胞上清进行间接ELISA检测。选择克隆数少、OD450nm值高的阳性孔，将其再次克隆。经3-4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株，及时扩大培养并冻存。

实施例2：鼠源抗Fzd7抗体的制备与鉴定

1、腹水收集：杂交瘤细胞扩大培养后，进行小鼠的腹腔注射，7-10天后小鼠腹腔明显肿大，此时采集腹水。4℃，5000g离心20min，去除腹水中细胞碎片与油脂(Western blot检测四株腹水与抗原的结合，图1结果显示1#、2#、3#腹水与抗原rhFzd7结合较好)，然后加入等体积甘油保存于-20℃。

2、鼠源抗Fzd7抗体的纯化：采用Protein G亲和层析柱纯化抗体。

具体步骤如下：

1)用10倍柱体积水清洗Protein G亲和层析柱。

2)用10倍柱体积20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)冲洗Protein G亲和层析柱。

3)将所需纯化样品泵入层析柱。

4)用100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.5，pH 2.7)洗脱，收集洗脱峰；并用1M Tris缓冲液(pH 9.0)中和收集物。

5)用SDS-PAGE电泳初步鉴定抗体(图2)。结果显示：非还原条件下在150KD处出现目的条带，主带明显；还原条件下在50KD和25KD出分别出现目的条带(重链和轻链)；说明1#、2#、3#抗体重轻链表达正确且装配完全。

3、鼠源抗Fzd7抗体的特征分析

1)免疫球蛋白亚型鉴定：

采用武汉三鹰生物技术有限公司的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，鉴定1#、2#、3#细胞株分泌抗体亚型。结果为：1#抗体重链亚型为IgG2b，轻链亚型为Kappa；2#抗体重链亚型为IgG1，轻链亚型为Kappa；3#抗体重链亚型为IgG2a，轻链亚型为Kappa。

2)间接ELISA法检测鼠源抗Fzd7抗体的亲和力：

A.将rhFzd7以1、0.5、0.25μg/mL的浓度包被酶标板；B.应用间接ELISA方法测定不同抗原包被浓度的抗体效价；C.以单抗浓度对数值为横坐标，OD450为纵坐标，绘制反应曲线；D.取各曲线上部趋于平坦段的OD值为OD-100，查出OD-50对应的单抗摩尔浓度(mol/L)，[Ab1]、[Ab0.5]、[Ab0.25]，根据公式：

K1＝1/(2×[Ab0.5]－[Ab1])

K2＝1/(2×[Ab0.25]－[Ab0.5])

K3＝1/(2×[Ab0.25]－[Ab1])

计算得到三个K值，取平均数即为抗体亲和力常数。间接ELISA测得的抗体亲和力分别为1#抗体：4.06×10

3)挑选亲和力最高的1#抗体(即为SHH002)，用BLI法进一步验证其亲和力：

A.使用仪器：蛋白质相互作用仪Fortebio Octet Red96。

B.溶液配制：KB buffer：0.1％BSA，0.05％Tween 20以pH 7.2的PBS溶解；抗体工作溶液：Biotin标记的SHH002抗体用KB buffer配制成10μg/mL；抗原工作溶液：rhFzd7用KBbuffer配制成300nM和750nM。

C.操作流程：打开Fortebio仪器及相关软件，选择Advance Kientics实验模式。首先利用Anti-Biotin Sensor捕获与Biotin偶联的抗体SHH002，然后利用捕获的抗体结合不同浓度的抗原rhFzd7，接着在缓冲液中进行解离，最后通过仪器算法计算出抗原抗体结合的亲和动力学常数KD。

实验结果显示SHH002与rhFzd7的结合常数ka(1/Ms)＝2.85×10

本实施例中表达1#抗体(SHH002)的杂交瘤细胞株，分类命名为表达抗Fzd7鼠源抗体SHH002的杂交瘤细胞株FL253-1，该细胞株已经进行了保藏，保藏日期为2019年10月30日，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO:C2019279，保藏地址为中国武汉武汉大学。

实施例3：1#杂交瘤细胞株重轻链V区基因的克隆和测序

1、抗Fzd7单抗SHH002重轻链V区基因提取、扩增及初步鉴定

1)提取总RNA：收集对数生长期杂交瘤细胞，用RNA提取试剂盒(上海生工生物)提取总RNA，溶于20-50μL无RNA酶水，-70℃保存。

2)cDNA合成：以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链(逆转录试剂盒购自上海生工生物)。

3)PCR扩增抗体重轻链V区基因：

A.聚合酶：PrimerSTAR高保真聚合酶

B.引物：根据杂交瘤细胞株抗体重轻链V区上下游基因序列设计的简并引物，重链V区两条上游引物VH F1、VH F2和下游引物VH R以及轻链V区上游引物VL F和下游引物VL R序列分别为：

VH F1：ctt ccg gaa ttc sar gtn mag ctg sag tc

VH F2：ctt ccg gaa ttc sar gtn mag ctg sag tcw gg

VH R：gga aga tct ata gac aga tgg ggg tgt cgt ttt ggc

VL F：gg gag ctc gay att gtg mts acm car wct mca

VL R：ggt gca tgc gga tac agt tgg tgc agc atc

(简并密码子说明：r＝a，g；y＝c，t；m＝a，c；s＝c，g；w＝a，t)

C.按表1配置PCR反应体系来扩增抗体重轻链V区基因(30个总体系，27个反应体系PCR)

表1 PCR反应体系及反应条件

D.PCR产物经1.5％琼脂糖电泳，目的条带大小均为330bp左右的条带(如图5)。

E.胶回收DNA产物3’端加腺嘌呤(A)

2、抗Fzd7单克隆抗体重轻链V区基因测序及分析

1)将1所得PCR产物链接至pMD18-T载体并将链接产物转化至感受态DH5α细胞，挑选阳性克隆进行测序。

2)测序结果显示成功获得1#杂交瘤细胞株抗体V区基因。利用IMGT-VQUEST数据库分析抗SHH002抗体重轻链V区基因。

靶向Frizzled7单克隆抗体SHH002重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQID No.5所示的CDR1，SEQ ID No.6所示的CDR2，和SEQ ID No.7所示的CDR3；轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID No.8所示的CDR1’，SEQ ID No.9所示的CDR2’，和SEQID No.10所示的CDR3’。靶向Frizzled7单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述靶向Frizzled7单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

实施例4：SHH002抗体人源化设计

1、SHH002的VH和VL与Human Germline序列对比，结果如图6所示。

2、SHH002潜在修饰位点分析预测VH/VL有潜在修饰位点，结果如图7A所示。

3、SHH002免疫原性分析预测VH/VL有部分强免疫原性位点(B细胞免疫原性：弱，T细胞免疫原性：中)，结果如图7B所示。

4、SHH002序列分析结果：

1)VH与人Germline IGHV1大类序列同源性最高：FR 1-3含26个鼠源位点(Vgene)，FR 4含0个鼠源位点(J gene)。

2)VL与人Germline IGKV1大类序列同源性最高：FR 1-3含24个鼠源位点(Vgene)，FR 4含0个鼠源位点(J gene)。

3)选择同源性最高的IGHV1/IGKV1为人源化设计模板，IGHV1/IGKV1为常见配对形式，上市药物占比高。

5、使用生物学信息学软件Discoverystudio对SHH002进行结构模拟：

1)可变区结构模拟(图8A)

2)可变区CDR结构模拟(图8B)

3)可变区表面电荷模拟图(图8C)

4)SHH002模拟结构结果分析：

A.SHH002序列与抗体结构数据库同源度(Identity)接近90％，模拟结构可信度(Confidence)超过95％。

B.SHH002结构模拟结果显示为常见抗体结构，无特殊二级三级结构。

C.SHH002鼠源抗体表面电荷分布均一，形成聚体或聚集可能性低。

D.选取两个可信度最高的结构模型指导人源化设计。

6、根据5中选择的结构模型为指导，保留对抗体结构稳定性起关键作用的鼠源氨基酸，并依据模板IGHV1/IGKV1将不重要的位点突变为人源氨基酸，获得以下5种人源化设计方案(SHH002-hu1，SHH002-hu2，SHH002-hu3，SHH002-hu4，SHH002-hu5)。

SHH002-hu1，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。SHH002-hu1，与鼠源抗体SHH002相比其人源化程度高达96.5％。

所述靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1的重链碱基序列如SEQ ID No.21所示，其中恒定区为从SEQ ID No.21所示碱基序列的第346位至第1335位。所述靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1的轻链碱基序列如SEQ ID No.22所示，其中恒定区为从SEQ ID No.22所示碱基序列的第334位至第654位。

所述靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1的重链氨基酸序列如SEQ ID No.23所示，其中恒定区为从SEQ ID No.23所示碱基序列的第116位至第445位。所述靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1的轻链氨基酸序列如SEQ ID No.24所示，其中恒定区为从SEQ IDNo.24所示碱基序列的第112位至第218位。

SHH002-hu2，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。

SHH002-hu3，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。

SHH002-hu4，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。

SHH002-hu5，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.20所示。

实施例5：抗Fzd7嵌合抗体SHH002-C的表达与鉴定

1、抗体人源化的关键第一步为嵌合抗体的构建：将SHH002的重链恒定区替换成人IgG1重链恒定区，将SHH002的轻链恒定区替换成人IgG1 Kappa轻链恒定区。将重组重轻链基因分别链接至pCDNA3.4载体，共转染EXPICHO-S细胞(购买自Invitrogen)，收集细胞培养上清液，过Protein G柱进行分离纯化。SDS-PAGE电泳对目的蛋白进行检测(图9)，结果显示：非还原条件下在150KD处出现目的条带，主带明显；还原条件下在50KD和25KD出分别出现目的条带(重链和轻链)；说明SHH002-C重轻链表达正确且装配完全。

2、BLI法测定SHH002-C与rhFzd7的亲和力常数

1)使用仪器：同实施例2

2)溶液配制：KB buffer：0.1％BSA，0.05％Tween 20以pH 7.2的PBS溶解；抗体工作溶液：SHH002-C抗体用KB buffer配制成10μg/mL；抗原工作溶液：rhFzd7用KB buffer配制成300nM、100nM和33.33nM。

3)操作流程：打开Fortebio仪器及相关软件，选择Advance Kientics实验模式。首先利用Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation Sensor捕获SHH002-C，然后利用捕获的抗体结合不同浓度的抗原rhFzd7，接着在缓冲液中进行解离，最后通过仪器算法计算出抗原抗体结合的亲和动力学常数KD。

实验结果显示SHH002-C与rhFzd7的结合常数ka(1/Ms)＝8.24×10

嵌合抗体SHH002-C的成功构建与表达鉴定为SHH002的进一步人源化奠定了坚实的基础。

实施例6：抗Fzd7靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu的表达与鉴定

1、将实施例4中SHH002重链可变区5种人源化序列与人IgG1重链恒定区连接，SHH002轻链可变区5种人源化序列与人IgG1 Kappa轻链恒定区连接，得到5对重组人源化重轻链基因；将这5对重轻链基因分别链接至pCDNA3.4载体，共转染EXPICHO-S细胞，收集细胞培养上清液，过Protein G柱分离纯化获得5种靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1、SHH002-hu2、SHH002-hu3、SHH002-hu4、SHH002-hu5。SDS-PAGE电泳对目的蛋白进行检测(图11)，结果显示：非还原条件下在150KD处出现目的条带，主带明显；还原条件下在50KD和25KD出分别出现目的条带(重链和轻链)；说明SHH002-hu重轻链表达正确且装配完全。

2、使用SEC-HPLC(分子排阻色谱)方法进一步验证靶向Frizzled7人源化抗体的纯度(使用IPI阳性蛋白以及鼠源抗体SHH002作为对照)。抗体纯化样品中的高分子聚合物质、单体物质和低分子量物质因在分子排阻色谱柱中的保留时间不同，通过对色谱图中不同时间出峰的各物质进行积分，并依据峰面积的占比确定各物质的含量。实验步骤如下：

1)使用仪器：Agilent HPLC 1100(购自日本安捷伦)

2)分子排阻色谱柱：TSKgelG3000SWXL(7.8×300，购自日本东曹株式会社)

3)柱温：20℃

4)进样量：5μL

5)检测器参数：检测波长280nm，带宽16nm，参比波长360nm，带宽100nm，峰宽(响应时间)>0.1min(2s)；狭缝4nm；负吸光度基线100mAU。

6)系统适应性标准：参比品蛋白出峰时间11.2min，峰型对称，基线平稳，则视为系统适应性通过。

结果显示鼠源抗体SHH002与5株靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu的单体峰含量均大于90％，如图12所示。

3、ELISA法测定SHH002-hu与rhFzd7结合的EC

1)将rhFzd7蛋白包被于酶标板，4℃过夜。

2)PBST洗板，室温封闭1h。

3)PBST洗板，加对应一抗室温孵育1h(SHH002、SHH002-hu1—SHH002-hu5 6株抗体分别设置8个浓度梯度，首孔10μg/ml，往下3倍梯度稀释)。

4)PBST洗板，加二抗Anti-Mouse-IgG-Fc-HRP/Anti-Huamn-IgG-Fc-HRP孵育。

5)PBST洗板，TMB显色，OD

结果显示，SHH002与抗原结合的EC

4、BLI法测定SHH002-hu与rhFzd7的亲和力常数

1)使用仪器：同实施例5

2)溶液配制：KB buffer：0.1％BSA，0.05％Tween 20以pH 7.2的PBS溶解；抗体工作溶液：SHH002-hu1、SHH002-hu2、SHH002-hu3抗体分别用KB buffer配制成10μg/mL；抗原工作溶液：rhFzd7用KB buffer配制成400nM、100nM、25nM和6.25nM。

3)操作流程：打开Fortebio仪器及相关软件，选择Advance Kientics实验模式。首先利用Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation Sensor捕获SHH002-hu抗体，然后利用捕获的抗体结合不同浓度的抗原rhFzd7，接着在缓冲液中进行解离，最后通过仪器算法计算出抗原抗体结合的亲和动力学常数KD。

实验结果如表2所示，结合解离动力学过程拟合曲线图如图14所示。KD表示亲和力的数值，kon表示结合的数值，kdis表示解离的数值，R

表2 SHH002-hu亲和动力学检测结果

实施例7：SHH002-hu1与Fzd受体家族其他成员亲和力检测

综合ELISA和BLI实验的结果，SHH002-hu1在ELISA检测中与rhFzd7结合的最大反应值(吸光度)最大，且在BLI检测中的Kon值最大，选择SHH002-hu1进行进一步研究。

Fzd7的CRD区序列与Fzd家族其他成员均有超过40％的同源性，特别是与Fzd1和Fzd2，同源性达到近80％，以Fzd7 CRD段为抗原筛选得到的抗体，除了可以与Fzd7结合，也有与Fzd家族其他成员结合的可能性。OMP-18R5即是以Fzd7 CRD段蛋白为抗原筛选得到的抗体，研究表明其与Fzd1/2/5/8均有交叉反应，导致该抗体在治疗过程中的脱靶风险。因此，本发明重点考察了SHH002-hu1是否可以与Fzd1/2/5/8(Fzd受体家族中与Fzd7 CRD区同源性最高的4个)发生交叉反应，使用BLI法测定SHH002-hu与rhFzd1-Fc/rhFzd2-Fc/rhFzd5-Fc/rhFzd8-Fc(购自R&D Systems)的亲和力，步骤如下：

1)使用仪器：同实施例5

2)溶液配制：KB buffer：0.1％BSA，0.05％Tween 20以pH 7.2的PBS溶解；抗体工作溶液：SHH002-hu1用KB buffer配制成10μg/mL；流动相工作溶液：

rhFzd1-Fc/rhFzd2-Fc/rhFzd5-Fc/rhFzd8-Fc分别用KB buffer配制成400nM、100nM、25nM和6.25nM。

3)操作流程：打开Fortebio仪器及相关软件，选择Advance Kientics实验模式。首先利用Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation Sensor捕获SHH002-hu1抗体，然后利用捕获的抗体结合不同浓度的rhFzd1-Fc/rhFzd2-Fc/rhFzd5-Fc/rhFzd8-Fc蛋白，接着在缓冲液中进行解离，最后得到结合解离模拟曲线。

结果显示SHH002-hu1与rhFzd1-Fc/rhFzd2-Fc/rhFzd5-Fc/rhFzd8-Fc蛋白均没有明显结合，如图15所示。

实施例8：SHH002-hu1与细胞表面Fzd7结合能力的检测

实施例6验证了靶向Frizzled7人源化抗体SHH002-hu1具有与重组人Fzd7蛋白的高亲和力，接着本发明使用细胞免疫荧光法验证SHH002-hu1能否与细胞表面天然表达的Fzd7结合，具体步骤如下：

1、构建过表达人Fzd7蛋白(跨膜与胞外区)的HEK293T细胞模型：将人Fzd7蛋白的跨膜区及胞外区基因(序列如SEQ ID No.25所示)与慢病毒载体

pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO(购自Hanbio Biotechnology)连接，得到重组质粒HBLV-h-FZD7-3*flag-GFP-PURO，将其与HBLV-GFP-PURO(GFP对照)进行慢病毒包装，并感染HEK293T细胞。

2、Western blot法筛选出5株高表达Fzd7的肿瘤细胞(三阴性乳腺癌细胞株：MDA-MB-231，MDA-MB-468；非小细胞肺癌细胞株：H1299，H1975，A549)，结果如图16A所示。

3、将HEK293T(空白细胞组、GFP对照组、Fzd7过表达组)、MDA-MB-231，MDA-MB-468、H1299，H1975，A549细胞铺六孔板，细胞汇合度达到80-90％进行免疫荧光检测，使用一抗为SHH002-hu1，二抗为Goat Anti-Human IgG H&L(Alexa Fluor 647，购自Abcam)。

实验结果表明SHH002-hu1与空白HEK293T细胞以及GFP对照HEK293细胞没有明显结合，而与过表达Fzd7的HEK293T细胞有明显结合；SHH002-hu1也可与表面高表达Fzd7的肿瘤细胞(MDA-MB-231，MDA-MB-468、H1299，H1975，A549)有效结合，如图16B、C所示。综上，SHH002-hu1可以与细胞表面Fzd7特异性结合。

实施例9：SHH002-hu1与肿瘤组织中Fzd7结合的检测

实施例8验证了SHH002-hu1与肿瘤细胞表面天然Fzd7的特异性结合，接着本发明使用免疫组化(IHC)方法对非小细胞肺癌病人的肿瘤组织Fzd7的表达情况进行检测(使用检测抗体为Rabbit Anti-Human Fzd7 Antibody，购自Abcam)，使用癌旁组织作为对照；并使用相同方法检测SHH002-hu1能否与瘤组织中的Fzd7结合。检测抗体免疫组化结果显示，非小细胞肺癌肿瘤组织中有Fzd7的高表达，而在其癌旁组织中几乎没有表达；SHH002-hu1的组化结果显示，其可以与高表达Fzd7的肺癌组织有效结合，与癌旁组织几乎没有结合，如图17所示。以上结果暗示，SHH002-hu1可以有效检测出肿瘤组织中的Fzd7，且有潜在的肿瘤组织特异靶向性。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海健康医学院

<120> 一种靶向Frizzled7人源化抗体及其制备方法与应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

caggtgaagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctacacga tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gaagtggtta taccaattac 180

aatcagaaat tcaaggacaa ggccacagtg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactga acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgc aagaaggggc 300

tattttgact actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 307

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 3

gacattgagc tcacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atatcctgca gagccagtga aagtgttgat gattatggca atacttttat gcactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 240

cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaataatga ggatccctac 300

acgttcg 307

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Arg Arg Gly Tyr Phe Asp

1 5

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Glu Ser Val Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Phe Met His

1 5 10

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Leu Ala Ser Asn

1

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro

1 5

<210> 11

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Asp Arg

1 5 10 15

Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr Gly Asn

20 25 30

Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp

85 90 95

Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

1 5 10 15

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr Gly Asn

20 25 30

Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp

85 90 95

Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caggtgcagc tggtgcagtc cggcgctgag gtgaagaagc ccggcgctag cgtgaagatg 60

agctgtaagg cctccggcta caccttcacc acctacacca tgcactgggt gaggcaggcc 120

cctggccagg gactggagtg gatcggctat atcaaccctc ggagcggcta caccaactat 180

aatcagaagt tccagggccg ggccaccgtg accgccgata agtccaccag caccgcttac 240

atggagctga gctccctgag gtccgaggac accgccgtgt attattgcgc taggcggggc 300

tacttcgatt attggggcca gggcaccacc gtgaccgtgt ccagcgcttc caccaagggc 360

ccctccgtgt tccccctggc tccctcttcc aagagcacca gcggcggcac cgctgctctg 420

ggatgtctgg tgaaggacta cttccctgag cctgtgaccg tgtcctggaa ttccggcgcc 480

ctgacctccg gcgtgcacac attccctgct gtgctgcagt cctccggcct gtatagcctg 540

tcctccgtgg tgacagtgcc tagctccagc ctgggcaccc agacctatat ctgcaacgtg 600

aaccacaagc ctagcaatac caaggtggac aagaaggtgg agcctaagag ctgcgacaag 660

acccacacct gtcctccatg tcctgctcca gaactgctcg gcggaccttc cgtgttcctg 720

tttcctccaa agcctaagga caccctgatg atcagcagaa cccctgaagt gacctgcgtg 780

gtggtggatg tgtcccacga ggatcccgaa gtgaagttca attggtacgt ggacggcgtg 840

gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga gaggaacagt acaacagcac ctacagagtg 900

gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960

gtgtccaaca aggccctgcc tgctcctatc gagaaaacca tcagcaaggc caagggccag 1020

cctagggaac cccaggttta cacactgcct ccaagcaggg acgagctgac caagaatcag 1080

gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc tacccttccg atatcgccgt ggaatgggag 1140

agcaatggcc agcctgagaa caactacaag acaacccctc ctgtgctgga cagcgacggc 1200

tcattcttcc tgtacagcaa gctgacagtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg 1260

ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgagc 1320

ctgtctcctg gcaaa 1335

<210> 22

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gatatccagc tgacccagag ccctagctcc ctgtccgtgt ccgtgggcga tcgggccacc 60

atcacctgtc gggcctccga gtccgtggac gactatggca ataccttcat gcactggtac 120

cagcagaagc ctggcaaggc tcccaagctg ctgatctacc tggcctccaa cctgcagagc 180

ggcgtgcctt ccaggttctc cggcagcggc agccggaccg acttcaccct gaccatcagc 240

agcgtgcagg ctgaggacgc cgccacctat tactgccagc agaataatga ggatccttat 300

accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagaggaccg tggctgcccc cagcgtgttc 360

atcttccctc ctagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ctagcgtggt gtgtctgctg 420

aataacttct atcccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggataacgc cctgcagagc 480

ggcaactccc aggagtccgt gaccgagcag gactccaagg acagcaccta ctccctgagc 540

tccaccctga ccctgtccaa ggctgattat gagaagcaca aggtgtatgc ttgcgaggtg 600

acacaccagg gcctgtccag ccctgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654

<210> 23

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 24

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 25

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgcgggacc ccggcgcggc cgctccgctt tcgtccctgg gcctctgtgc cctggtgctg 60

gcgctgctgg gcgcactgtc cgcgggcgcc ggggcgcagc cgtaccacgg agagaagggc 120

atctccgtgc cggaccacgg cttctgccag cccatctcca tcccgctgtg cacggacatc 180

gcctacaacc agaccatcct gcccaacctg ctgggccaca cgaaccaaga ggacgcgggc 240

ctcgaggtgc accagttcta cccgctggtg aaggtgcagt gttctcccga actccgcttt 300

ttcttatgct ccatgtatgc gcccgtgtgc accgtgctcg atcaggccat cccgccgtgt 360

cgttctctgt gcgagcgcgc ccgccagggc tgcgaggcgc tcatgaacaa gttcggcttc 420

cagtggcccg agcggctgcg ctgcgagaac ttcccggtgc acggtgcggg cgagatctgc 480

gtgggccaga acacgtcgga cggctccggg ggcccaggcg gcggccccac tgcctaccct 540

accgcgccct acctgccgga cctgcccttc accgcgctgc ccccgggggc ctcagatggc 600

agggggcgtc ccgccttccc cttctcatgc ccccgtcagc tcaaggtgcc cccgtacctg 660

ggctaccgct tcctgggtga gcgcgattgt ggcgccccgt gcgaaccggg ccgtgccaac 720

ggcctgatgt actttaagga ggaggagagg cgcttcgccc gcctctgggt gggcgtgtgg 780

tccgtgctgt gctgcgcctc gacgctcttt accgttctca cctacctggt ggacatgcgg 840

cgcttcagct acccagagcg gcccatcatc ttcctgtcgg gctgctactt catggtggcc 900

gtggcgcacg tggccggctt ccttctagag gaccgcgccg tgtgcgtgga gcgcttctcg 960

gacgatggct accgcacggt ggcgcagggc accaagaagg agggctgcac catcctcttc 1020

atggtgctct acttcttcgg catggccagc tccatctggt gggtcattct gtctctcact 1080

tggttcctgg cggccggcat gaagtggggc cacgaggcca tcgaggccaa ctcgcagtac 1140

ttccacctgg ccgcgtgggc cgtgcccgcc gtcaagacca tcactatcct ggccatgggc 1200

caggtagacg gggacctgct gagcggggtg tgctacgttg gcctctccag tgtggacgcg 1260

ctgcggggct tcgtgctggc gcctctgttc gtctacctct tcataggcac gtccttcttg 1320

ctggccggct tcgtgtccct cttccgtatc cgcaccatca tgaaacacga cggcaccaag 1380

accgagaagc tggagaagct catggtgcgc atcggcgtct tcagcgtgct ctacacagtg 1440

cccgccacca tcgtcctggc ctgctacttc tacgagcagg ccttccgcga gcactgggag 1500

cgcacctggc tcctgcagac gtgcaagagc tatgccgtgc cctgcccgcc cggccacttc 1560

ccgcccatga gccccgactt caccgtcttc atgatcaagt acctgatgac catgatcgtc 1620

ggcatcacca ctggcttctg gatctggtcg ggcaagaccc tgcagtcgtg gcgccgcttc 1680

taccacagac ttagccacag cagcaagggg gagactgcgg tatga 1725