一种桑寄生中具有抗菌活性的油酰乙醇胺化合物、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于植物化学领域，具体涉及一种桑寄生中具有抗菌活性的油酰乙醇胺化合物、制备方法及其在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

桑寄生(Taxillμs chinensis(DC.)Danser)，原名桑上寄生，亦称广寄生，为檀香目桑寄生科钝果寄生属植物，主要分布于我国云南、四川、甘肃、陕西、山西、河南、贵州、湖北、湖南等地。

一方面，桑寄生对寄主植物有不同程度的危害，影响其生长、开花及结实，致使果树或经济树木减产或失收，严重受害时整枝或全株枯死。因此，在许多重要经济作物生长过程中，桑寄生被认为是一种寄生性植物危害，又称“桑寄生害”。

另一方面，由于桑寄生枝叶中富含黄酮、生物碱、萜类、多肽、蛋白、凝集素、多糖、有机酸等多种功能性物质，使得成为桑寄生传统医学中重要的药用植物之一。2015年，《中华人民共和国药典》收录的桑寄生是属于桑寄生科的一种干燥带叶茎枝的植物。传统的临床应用中，桑寄生具有补肝肾、祛风湿、强筋骨、养血、安胎、降血压功能。而在当今对于桑寄生药理的相关研究显示其还对高血压、中风、炎症、高血脂、先兆流产以及对心律失常等都具有不错的功效。

从医疗领域来看，近年来，感染发生率逐年增多，临床多以抗生素治疗为主。然而抗生素的滥用引起耐药菌的出现，导致抗生素治标不治本，且不良反应较多。从天然植物中寻找高效低毒的抗菌活性分子也是当前天然产物化学的研究热点。临床上，多种药用植物资源广泛用于治疗各种感染疾病，如黄连、黄柏、薄荷、连翘、金银花、车前子等。

中国发明专利CN102579413A(油酰乙醇胺及其衍生物的新用途)、CN106821781A(一种皮肤美白化妆组合物及其应用)、CN102579414A(油酰乙醇胺作为降血脂、防治非酒精性脂肪肝药物的用途)公布了油酰乙醇胺降血脂、抑制酪氨酸酶的活性以及控制脂肪肝引发的肝脏炎症水平等功能活性和用途，但未见抗菌活性报道。本专利首次通过实验从传统中药桑寄生中分离出油酰乙醇胺并首次证明了油酰乙醇胺的抗菌活性，为桑寄生及油酰乙醇胺在感染类疾病方面应用提供了依据。

综上，为了充分利用桑寄生资源，对农业生产中不被需要的寄生性危害植物进行再利用，最大限度的减少其在环境中的处置，遵循绿色化学原则，扩宽其应用途径，本发明证明了桑寄生是可以作为一种提供新的抗菌药物来源的天然药用植物。本发明对桑寄生化学成分进行研究，并从中分离到一个脂肪酸乙醇胺类化合物，该化合物为油酰乙醇胺，具有很好的抗菌作用。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种桑寄生中具有抗菌活性的油酰乙醇胺化合物，本发明的第二目的是提供该油酰乙醇胺化合物的制备方法，本发明的第三目的是提供该油酰乙醇胺化合物在制备抗菌药物中的应用。

本发明所述的一种桑寄生中具有抗菌活性的油酰乙醇胺化合物，中文名称为油酰乙醇胺，英文名为N-oleoyl ethanolamine，分子式为C

本发明所述的一种桑寄生中具有抗菌活性的油酰乙醇胺化合物的制备方法，其步骤如下：

A、样品提取：以桑寄生为原料，将其晒干、粉碎至10～70目，用有机溶剂浸泡提取2～4次，再将提取液合并、过滤并浓缩至相对密度1.08～1.25得到桑寄生提取物浸膏；

B、硅胶柱层析：步骤A得到的桑寄生提取物浸膏用1～3倍浸膏重量份的丙酮、乙醇或甲醇溶解，再用1～1.5倍浸膏重量份的60～120目硅胶拌样后上硅胶柱层析，以三氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，三氯甲烷和甲醇的混合溶液中三氯甲烷的体积百分数为70～80％，收集洗脱液并浓缩至相对密度1.08～1.25；

C、高压液相色谱分离：将步骤B中洗脱浓缩得到的样品经高效液相色谱分离纯化，得目标物粗品；

D、凝胶柱纯化：将步骤C的目标物粗品用异丙醇溶解，以异丙醇为流动相，用凝胶柱层析进一步分离纯化得到油酰乙醇胺化合物纯品。

步骤A中，所述的有机溶剂是质量分数60％～95％乙醇；步骤A中，每次使用5～10倍样品质量份的有机溶剂进行提取，提取时间为2～8h。

步骤C中，高效液相色谱分离纯化条件如下：

以正相硅胶柱(200～300目)为固定相，流动相A为正庚烷：异丙醇(体积比0.5～0.8：1)，流动相B为正庚烷：异丙醇：水(体积比2.5～3：5～6：1)，双泵加入流动相A和流动相B，1～5mL/min；柱温35～45℃，进样量0.5～1.0mL，收集保留时间为10～12min的色谱峰，收集溶液，蒸干后得到目标物粗品。

本发明所述的桑寄生中具有抗菌活性的油酰乙醇胺化合物在制备抗菌药物中的应用，所述抗菌药物包括油酰乙醇胺和/或油酰乙醇胺药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的有益效果为：

1、本发明以桑寄生为原料，提取出一种具有抗菌活性的油酰乙醇胺化合物，其具有较强的抗菌作用，抗菌实验表明，所述化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度MIC值为2～8μg/mL，其抗菌效果远优于对照组庆大霉素(MIC＝512μg/mL)；另外，得到的油酰乙醇胺化合物毒性低，抗菌效果好，可为抗菌药物的研发提供高效、低毒的先导性化合物。

2、本发明化合物的制备方法简单，另外，桑寄生在我国分布广泛，生长迅速、原料来源广泛、成本低，可持续为本发明所述的活性化合物的分离制备提供原料，因此本化合物可以进行可持续的大规模生产与制备。

3、本发明所述药用植物桑寄生，该植物的抗菌活性在公开文献中从未见报道，因此，本植物的抗菌活性研究为其扩宽了应用途径，增加了药用价值。

4、本发明所述化合物为油酰乙醇胺，该化合物的抗菌活性在公开文献中从未见报道，因此，本化合物抗菌活性的分析为抗菌药物筛选及抗菌机制的研究发展提供了一种新的思路。

附图说明

图1：本发明制备的油酰乙醇胺化合物的高效液相色谱图；

图2：本发明制备的油酰乙醇胺化合物的一级质谱图；

图3：本发明制备的油酰乙醇胺化合物的二级质谱图。

如图1所示，为以保留时间(RT)为横坐标、响应值为纵坐标所作的为油酰乙醇胺的高效液相色谱图。高分辨液质采集的数据通过CD2.1(Thermo Fisher)完成数据初步整理与mzCloud，mzVault，ChemSpider数据库进行检索比对，从数据库导入化合物的名称及分子式，进行无目标筛查，保留筛查得到的化合物保留时间。图1所示，在21.662min时检测到油酰乙醇胺。

如图2所示，为油酰乙醇胺正离子检测的一级质谱图，是以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质量数(m)和电荷数(z)的比值(m/z，质荷比)为横坐标所作的质谱图。利用高分辨液质采集的数据通过CD2.1(Thermo Fisher)完成数据初步整理后与mzCloud，mzVault，ChemSpider进行数据库比对检索，从数据库导入化合物的名称及分子式，进行无目标筛查，保留筛查得到的化合物的分子离子。如图2所示，在正离子模式下产生分子离子峰m/z 326.30511。

如图3所示，为油酰乙醇胺正离子检测的二级质谱图。是以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，油酰乙醇胺母离子解离形成的子离子的质量数(m)和电荷数(z)的比值(m/z，质荷比)为横坐标所作的条状图。

利用高分辨液质采集的数据通过CD2.1(Thermo Fisher)完成数据初步整理后与mzCloud，mzVault，ChemSpider进行数据库比对检索，从数据库导入化合物的名称及分子式，进行无目标筛查，保留筛查得到的化合物相关信息，并进行二级碎片离子与成分结构的匹配，根据匹配度>80％并结合成分碎片离子断裂规律来鉴定成分。

油酰乙醇胺为乙醇胺类化合物，在正离子模式下产生分子离子峰m/z326.30511。正离子模式下MS

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：桑寄生中具有抗菌活性的化合物的制备

将桑寄生晒干、粉碎到60目，取该样品3kg以95％的乙醇水溶液提取3次，每次提取8h；将3次提取液合并，过滤，减压浓缩得到桑寄生提取物浸膏160g。将桑寄生提取物浸膏用180g的甲醇溶解，然后加入80目粗硅胶200g拌样，用160目硅胶1.0kg装柱，拌样后上硅胶柱层析；以体积比为75：25的三氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液并浓缩至相对密度1.15，收集洗脱液并浓缩得到15.6g浓缩物。以正相硅胶柱色谱柱(250目)为固定相，流动相A为正庚烷－异丙醇(64：115，v/v)，流动相B为正庚烷－异丙醇－水(30：63：12，v/v/v)，流速1.0mL/min。柱温40℃，进样量1mL，收集保留时间为11.83min的色谱峰，收集溶液后蒸干，即得到油酰乙醇胺粗品；将所述油酰乙醇胺粗品用异丙醇溶解，以异丙醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析纯化即得到1.2g油酰乙醇胺纯品。

实施例2：桑寄生中具有抗菌活性的化合物的抗菌能力测定

1.实验材料与方法

1.1菌株及试剂：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300(广东省菌种保存中心)；BHI琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；MH肉汤培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；无菌TTC溶液(广东环凯微生物科技有限公司)。

1.2菌种活化：将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300冻干菌粉复苏后接种到BHI培养基中，放入37℃恒温培养箱中培养12h。以相同接种方法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行传代纯化培养后备用。

1.3药物的配制：准确称取4.096g实施例1制备的油酰乙醇胺纯品，溶于10mL、质量分数50％的二甲基亚砜(DMSO)中，油酰乙醇胺浓度为409.6mg/mL，作为储备液；取1mL储备液过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，再用水稀释至4096μg/mL，供测量MIC使用。准确称取庆大霉素硫酸盐0.4096g，溶于100mL水，庆大霉素硫酸盐浓度为4096μg/mL，取1mL庆大霉素硫酸盐溶液过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，以供测量MIC使用。

1.4菌液的配制：取试管置于麦氏比浊仪中，先加一定量的生理盐水，调比浊仪显示100，再加入步骤1.1得到的传代后的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，调菌液的浓度显示到85。然后用MH培养液对该菌液再做1000倍稀释，稀释后菌液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的浓度约为1.0×10

1.5二倍稀释法测MIC：向无菌96孔板(8排12列)每孔中加入经高温灭菌的MH肉汤培养基100μL，然后向每排的第1孔中加入100μL、4096μg/mL油酰乙醇胺药液，混匀后吸取100μL第1孔内的混合液加入到第2孔中，按照此倍比稀释法加满第2孔～第10孔。另向该排的第11孔中加入步骤1.3得到的100μL、4096μg/mL庆大霉素硫酸盐溶液作为阳性对照，向该排的第12孔中加入100μL、质量分数为1％的DMSO溶液作为阴性对照。最后再向每排的每孔中均加入步骤1.4得到的浓度为1.0×10

2.实验结果

油酰乙醇胺对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC测定：1％的DMSO的每孔均被染色，无抑菌效果；油酰乙醇胺对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300的MIC值为4μg/mL，庆大霉素硫酸盐对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300的MIC值为512μg/mL，具有显著性差异。