二氧杂环丁烷化合物及其用于检测微生物的用途

文献发布时间：2023-06-19 09:29:07

技术领域

本发明涉及二氧杂环丁烷化合物和它们用于通过以下手段来检测是否存在、定量和鉴定包括细菌、细菌碎片(例如，LPS、内毒素)、病毒、真菌以及其它病原体的微生物的用途，所述手段为化学发光指示代谢酶、试剂酶或参比酶(reference enzyme)对适当的分子探针的作用，通过试剂酶指示由微生物代谢产物或营养物质的酶促氧化(enzymaticoxidation)产生的过氧化氢，或者通过试剂酶检测起到营养物质、底物、代谢产物或副产物的作用的无机磷酸盐。

背景技术

例如食物、水和血液储备等的细菌污染造成主要的健康问题。根据世界卫生组织，水源性疾病，即由在水中传播的病原微生物引起的疾病，与世界各地的重大疾病负担有关。例如，水源性腹泻病(waterborne diarrheal disease)每年预计造成200万人死亡，其中大部分发生在5岁以下的儿童中。

因此，非常需要用于检测微生物、特别是细菌的方法和手段。在这方面，发现可以使用在被由这些细菌产生的特定的酶裂解时产生可检测信号(例如，光)的化合物来特异性地检测细菌的属或种。由于与基于荧光或显色的方法相比优异的灵敏度和更高的信噪比，基于化学发光的检测方法对于微生物、特别是细菌的检测是特别有利的。特别地，已显示化学发光导致显著高的信噪比(S/N)，其比使用荧光得到的信噪比高约100至1000倍。这继而导致化学发光相比于荧光的显著更高的灵敏度。

用于微生物的检测的确立已久的系统为荧光素酶-荧光素系统。D-荧光素为生物发光化合物(bioluminogenic compound)，其在分子氧、ATP和镁的存在下被荧光素酶(一种氧化还原酶)氧化成亚稳态的中间体，所述中间体继而衰变以发出蓝绿色的光。可以用酶不稳定基团(enzyme labile group)来遮蔽D-荧光素，将在荧光素酶存在下的发光限制为还存在作用于酶不稳定基团的酶的情况。例如，Masuda-Nishimura等人报道使用作为发光底物的D-荧光素-6-O-β-D-吡喃半乳糖苷来检测大肠菌群(coliform bacteria)(Masuda-Nishimura等人(2000)，Letters in Applied Microbiology，30:130-135)。

近年来，开发了化学探针，与大多数目前使用的化学发光探针和生物发光探针不同，化学探针不需要氧化步骤来引起其(化学)发光，并且因此可以检测宽范围的化学活性和生物学活性。这些化学发光探针包含稳定的二氧杂环丁烷部分。WO2017/130191公开了此类基于二氧杂环丁烷的化学发光探针和它们用于诊断目的和体内成像的用途。此外，Green等人(Green,O.，Eilon,T.，Hananya,N.，Gutkin,S.，Bauer,CR.，Shabat,D.，ACS CentralSci.，2017，4，349-58)公开了适用于水性条件下的化学发光的二氧杂环丁烷探针，所述探针被酶不稳定基团遮蔽并且适用于酶活性的检测。

然而，迄今为止尚未报道化学发光的二氧杂环丁烷探针在微生物学的领域用于检测特定微生物的成功应用。事实上，由于探针之间复杂的相互作用、除去酶不稳定保护基团所需的微生物的酶、和化学发光反应的环境(即包含微生物的介质)而导致用于在“现实(real-life)”条件下检测微生物的化学发光探针的开发是特别困难的挑战。用于检测微生物的适当的化学发光探针必须(i)对要检测的微生物无毒，(ii)在水性介质中具有高的稳定性，(iii)能够在给定的介质中产生强的化学发光信号，并且(iv)能够到达除去酶不稳定保护基团的酶的位点(例如，周质空间(periplasmic space)、革兰氏阴性菌的内膜的外表面或内表面、胞质溶胶(cytosol)等)。此外，出于明显的原因，用于微生物的检测的化学发光探针应当廉价并且方便使用。

由于以上要求，化学发光的二氧杂环丁烷探针是否适合于微生物(在水性介质中)的“现实”检测的问题不能从其化学结构得出或预测。即使探针在“实验室”条件下显示良好的性能，其也可能不适合于“现实”应用。因此，需要大量实验来确定特定的探针是否适合于在“现实”条件下检测微生物。

目前，荧光素酶-荧光素系统是可用于微生物的检测的唯一有效的“现实”的(生物)发光手段。然而，尽管是目前的行业标准，但是该系统具有许多缺点。例如，该系统为复杂的多组分系统(标准组成：1.前荧光素酶底物(pro-luciferin enzyme substrate)(例如，荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷)，2.荧光素酶，3.牛血清白蛋白，4.ATP，5.EDTA，6.D/L-半胱氨酸，7.MgSO

发明内容

鉴于上述情况，本发明的目的在于提供用于检测是否存在、定量和鉴定包括细菌、细菌碎片(例如，LPS、内毒素)、病毒、真菌以及其它病原体的微生物的探针以及方法，所述探针和方法克服了通常应用的荧光素酶-荧光素系统的缺点，特别是具有显著提高的灵敏度并且比基于荧光素酶-荧光素的系统更易于使用。

特别地，应当提供可以用于通过化学发光指示的手段来检测是否存在、定量和鉴定包括细菌、细菌碎片(例如，LPS、内毒素)、病毒、真菌以及其它病原体的微生物的化学发光探针(和方法)，所述手段例如为化学发光指示代谢酶、试剂酶或参比酶对适当的分子探针的作用，通过试剂酶指示由微生物代谢产物或营养物质的酶促氧化产生的过氧化氢，或者通过试剂酶检测起到营养物质、底物、代谢产物或副产物的作用的无机磷酸盐。

通过适用于借助化学发光的手段来检测是否存在、定量和鉴定包括细菌、细菌碎片(例如，LPS、内毒素)、病毒、真菌以及其它病原体的微生物的特定的二氧杂环丁烷化合物来实现以上目的。如以下更详细地阐述的，令人惊讶地发现根据本发明的二氧杂环丁烷化合物是使得能够以与通常应用的荧光素酶-荧光素系统相比更灵敏且更简单的方式检测是否存在、定量和鉴定包括细菌、细菌碎片(例如，LPS、内毒素)、病毒、真菌以及其它病原体的微生物的高效的探针。

在第一方面，本发明提供式I的化合物

其中

Z和Z'独立地选自R

其中R

并且R

其中两个R

Z”选自F、Cl、Br、I，优选Z”为F；

Kat

L为在分析物作用于分析物响应性基团R

如果R

条件是R

Q为包含与式I的化合物的中心芳环的π体系共轭的π体系的基团；

其中Y为H、任选取代的C1-C12烷基或碱金属离子，

其中Y’和Y”独立地选自H和任选取代的C1-C12烷基，或者与氮原子一起形成任选取代的杂环结构，优选任选取代的马来酰亚胺基；并且

条件是，如果R

在第二方面，本发明涉及式I的化合物用于检测目标分析物(例如，过氧化氢)、目标微生物或目标代谢产物、优选微生物例如细菌的用途，并且涉及用于检测目标分析物、目标微生物或目标代谢产物的方法。

在第三方面，本发明涉及式I的化合物用于通过生长底物(growth substrates)、营养物质和代谢产物的酶促氧化来检测所述生长底物、营养物质和/或代谢产物的用途，并且涉及用于通过生长底物、营养物质和代谢产物的酶促氧化来检测所述生长底物、营养物质和/或代谢产物的方法。

在第四方面，本发明涉及式I的化合物用于使用鲎C因子(limulus factor C)来检测细菌内毒素的用途，并且涉及使用鲎C因子来检测细菌内毒素的方法。

在第五方面，本发明涉及式I的化合物用于测试乳制品的巴氏灭菌的用途，并且涉及测试乳制品的巴氏灭菌的方法。

在第六方面，本发明涉及式I的化合物用于测试微生物中的抗生素耐药性的用途，并且涉及用于测试微生物中的抗生素耐药性的方法。

在第七方面，本发明涉及式I的化合物用于检测无机磷酸盐的用途，并且涉及用于检测无机磷酸盐的方法。

在第八方面，本发明涉及式I的化合物用于监测灭菌过程、特别是通过检测指示微生物嗜热脂肪芽孢杆菌的α-D-葡萄糖苷酶活性来监测灭菌过程的用途，并且涉及用于监测灭菌过程、特别是通过检测指示微生物嗜热脂肪芽孢杆菌的α-D-葡萄糖苷酶活性来监测灭菌过程的方法。

在第九方面，本发明涉及式I的化合物用于细菌的抗生素耐药性的终点检测和在线检测和用于抗生素敏感性测试的用途以及涉及用于细菌的抗生素耐药性的终点检测和在线检测和用于抗生素敏感性测试的方法。

本发明的优选实施方案在所附权利要求中列出。本发明的进一步的实施方案以及其它目的、优点和特征将从以下本发明的详细描述和实施例变得显而易见。

具体实施方式

本发明基于以下令人惊讶的发现：虽然基于荧光素酶-荧光素的系统表现出许多缺点(如上所述)，但是此类系统目前是可用于微生物的检测的唯一“现实”的生物发光或化学发光系统。在这方面，本发明的发明人惊讶地发现式I的二氧杂环丁烷化合物是用于检测微生物的高效的探针。特别地，发现式I的二氧杂环丁烷化合物即使在水性介质中也是化学发光的，并且当用于微生物的检测时显示显著高的灵敏度，其显著地高于通常应用的荧光素酶-荧光素系统的灵敏度。此外，可以通过改变取代基R

在第一方面，本发明涉及式I的化合物

其中

Z和Z'独立地选自R

其中R

并且R

其中两个R

Z”选自F、Cl、Br、I，优选Z”为F；

Kat

L为在分析物作用于分析物响应性基团R

如果R

条件是R

Q为包含与式I的化合物的中心芳环的π体系共轭的π体系的基团；

其中Y为H、任选取代的C1-C12烷基或碱金属离子，

其中Y’和Y”独立地选自H和任选取代的C1-C12烷基，或者与氮原子一起形成任选取代的杂环结构，优选任选取代的马来酰亚胺基；并且

条件是，如果R

如本文中所使用的，术语“烷基”是指直链或支链烃基并且包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基等。因此，例如，如本文中所使用的，术语“C

如本文中所使用的，术语“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃基。

如本文中所使用的，术语“炔基”是指具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链烃基。

如本文中所使用的，术语"杂烷基"、"杂烯基"和"杂炔基"是指在骨架残基中包含一个或多个O、S或N杂原子或者其组合的相应的烃基(烷基、烯基和炔基)；因此，相应的烷基、烯基或炔基的至少一个碳原子被指定的杂原子中的一者代替以形成杂烷基、杂烯基或杂炔基。

如本文中所使用的，术语“芳基”是指由单环或稠合的多个环构成的芳香族碳环基团，例如但不限于苯基、萘基、菲基和联苯基。“芳基”可以是取代的或未取代的。

如本文中所使用的，术语“杂芳基”是指包含至少一个杂原子(即与碳或氢不同的原子，例如N、S、O、P、Se、Te，优选N、S、O、P)作为环成员的芳香族基团。

“任选取代的”或“取代的”基团上的适当的取代基独立地为：卤素；-(CH

＝O、＝S、＝NNR

当n或m为0时，这意味着不存在相应的取代基。因此，当m为0时，连接基团L直接结合至中心芳环(即式I中示出的芳环)。另外，当n为0时，R

如本文中所使用的，终止化学部分的键的符号

如本文中所使用的，术语“二氧杂环丁烷化合物”是指包含

如本文中所使用的，术语“分析物响应性基团”是指可以借助特定的分析物来除去(至少部分除去)或修饰的基团，其中除去或修饰使得引起发光。优选地，当n为1(即，存在连接基团L)时，分析物对分析物响应性基团的作用使分析物响应性基团R

如本文中所使用的，术语“酶不稳定基团”是指可以借助特定的酶来除去(至少部分除去)或修饰的基团。

如本文中所使用的，术语目标分析物、目标微生物或目标代谢产物是指要借助式I的化合物来检测的分析物、微生物或代谢产物。

优选地，R

根据优选的实施方案，R

根据另一优选的实施方案，R

Q为包含与式I的化合物的中心芳环的π体系共轭的π体系的基团。已显示，由于所述共轭，基团Q(可能和与其连接的基团R

根据优选的实施方案，Q选自由-(H

根据另一优选的实施方案，R

优选地，由R

特别优选的是由R

令人惊讶地，发现包含由R

进一步发现可以借助取代基R

优选地，所述任选取代的稠环、螺环或桥环或者多环选自任选取代的螺桨烷；由式[A.B.1]戊烷、[A.B.1]己烷、[A.B.1]庚烷、[A.B.1]辛烷、[A.B.1]壬烷、[A.B.1]癸烷、[A.B.1]十一烷、[A.B.1]十二烷限定的任选取代的双环，其中A和B独立地选自1、2、3、4和5；或者任选取代的金刚烷。更优选地，R

根据优选的实施方案，R

特别优选的化合物选自由以下化合物组成的组：

根据优选的实施方案，式I的化合物由式I'表示。

根据优选的实施方案，R

优选的第1代至第5代头孢菌素选自cefacteril、头孢拉定、头孢沙定、头孢来星、头孢克洛、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢曲嗪(cefatrizin)、头孢西酮(cefazedon)、头孢匹林、头孢替唑(ceftezol)、头孢唑啉、头孢氮氟(cefezaflur)、头孢噻吩、头孢噻啶(cefaloridin)、头孢洛宁(cefalonium)，其中与羧酸基团所连接的碳原子相邻的碳原子用于将头孢菌素结合至式I的化合物，

优选的碳青霉烯选自

特别优选的碳青霉烯为

特别优选的β-内酰胺酶不稳定基团选自由以下基团组成的组：

根据优选的实施方案，R

根据另一优选的实施方案，R

连接基团“L”具有在作出本发明之前未知的几个优点。一方面，其导致式I的化合物的更好的水解稳定性，这是特别重要的，因为优选在水性介质中使用式I的化合物。另一方面，其通过在空间上使基团R

优选地，L为在分析物作用于分析物响应性基团R

优选地，L选自由

X为-O-，-N

优选地，L为

优选地，当R

根据优选的实施方案，X为-O-。根据另一优选的实施方案，X为-NH-。

根据优选的实施方案，n为1且m为1。根据另一优选的实施方案，n为0且m为1。

根据优选的实施方案，R

优选地，R

根据优选的实施方案，R

优选的式I的化合物选自由式II、IIa、III、IIIa、IV、IVa、V、Va、VI、VIa、VIb、VIc、VII和VIIa的化合物组成的组：

其中Y为H、任选取代的C1-C12烷基或碱金属离子。特别优选的化合物为其中Y为H的那些。

已证明式II、特别是式IIa的化合物特别适合于沙门氏菌、特别是肠道沙门氏菌的检测。

已证明式III、特别是式IIIb的化合物特别适合于李斯特菌、特别是单核细胞增生李斯特菌的检测。

已证明式IV、特别是式IVa的化合物特别适合于金黄色酿脓葡萄球菌的检测。

已证明式V、特别是式Vb的化合物特别适合于大肠菌(coliform)和大肠杆菌(E.coli)的检测。

已证明式VI、特别是式VIc的化合物特别适合于H

已显示式VII和VIII、优选式VIIb和VIIIa的化合物特别适合于区分碳青霉烯耐药性细菌和碳青霉烯敏感性细菌。

通常，发现当存在基团R

当R

(除了其它之外)可以用于本发明的示例性分析物响应性基团R

表1

示例性优选的R

表2

如本文中所使用的，术语“氨基酸基”是指借助其羧酸基团结合至二氧杂环丁烷化合物的其余部分的氨基酸部分。当氨基酸包含超过一个羧酸基团时，所述羧酸基团中的每一者均可以将氨基酸结合至二氧杂环丁烷化合物的其余部分。优选地，当氨基酸包含超过一个羧酸基团时，所述氨基酸借助其α-羧酸基团结合至二氧杂环丁烷化合物的其余部分。

因此，当R

优选的氨基酸基为：丙氨酰基(A-)、优选L-丙氨酰基，焦谷氨酸基、优选L-焦谷氨酸基，精氨酰基(R-)，天冬酰胺酰基(N-)，天冬氨酸基(D-)，半胱氨酰基(C-)，谷氨酰胺酰基(Q-)，谷氨酸基(E-)，甘氨酰基(G-)，组氨酰基(H-)，异亮氨酰基(I-)，亮氨酰基(L-)，赖氨酰基(K-)，甲硫氨酰基(M-)，苯丙氨酰基(F-)，脯氨酰基(P-)，丝氨酰基(S-)，苏氨酰基(T-)，色氨酰基(W-)，酪氨酰基(Y-)，和缬氨酰基(V-)。

特别优选的氨基酸基为L-丙氨酰基、L-焦谷氨酸基、L-亮氨酰基、或β-丙氨酰基。

优选的三肽基为Boc-Val-Pro-精氨酰基、Boc-Asp(OBzl)-Pro-精氨酰基、和SucOMe-Arg-Pro-酪氨酰基(SucOMe-RPY-)。

当R

根据优选的实施方案，R

特别优选的化合物为如下式I的化合物，其中取代基和变量如以下所定义(其它取代基如以上所定义)(参见表A；如果存在L，则L为

表A

通常，下文中讨论的所有用途和方法应当理解为体外用途和方法。

在第二方面，本发明涉及如第一方面所述的式I的化合物用于检测目标分析物(例如过氧化氢)/目标微生物/目标代谢产物(无论其来源如何)的用途。更优选地，本发明涉及如第一方面所述的式I的化合物用于检测目标微生物、更优选病原微生物、甚至更优选细菌、病毒或真菌的用途。

特别地，本发明涉及如第一方面所述的式I的化合物用于检测是否存在、定量和鉴定包括细菌、细菌碎片(例如，LPS、内毒素)、病毒、真菌以及其它病原体的微生物的用途。更特别地，本发明涉及如第一方面所述的式I的化合物用于借助以下手段来检测是否存在、定量和鉴定包括细菌、细菌碎片(例如，LPS、内毒素)、病毒、真菌以及其它病原体的微生物的用途，所述手段为化学发光指示代谢酶、试剂酶或参比酶对适当的分子探针的作用，通过试剂酶指示由微生物代谢产物或营养物质的酶促氧化产生的过氧化氢，或者通过试剂酶检测起到营养物质、底物、代谢产物或副产物的作用的无机磷酸盐。

优选地，微生物选自由以下微生物组成的组：沙门氏菌；肠道沙门氏菌；李斯特菌，优选单核细胞增生李斯特菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；碳青霉烯耐药性细菌，优选铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌；空肠弯曲杆菌；大肠弯曲杆菌；红嘴鸥弯曲杆菌；杆菌；葡萄球菌；梭菌；结核分支杆菌；产气荚膜梭菌；无乳链球菌；假丝酵母菌属；革兰氏阴性菌；酵母菌；霉菌；铜绿假单胞菌；肠球菌；酿脓链球菌；柠檬酸杆菌；大肠菌；阪崎肠杆菌；MRSA；VRE；嗜热脂肪芽孢杆菌；李斯特菌属；产生肠道菌的ESBL；弧菌；艰难梭菌；白色念珠菌；普氏菌；志贺氏菌(一种含有腺苷三磷酸双磷酸酶的微生物)，优选志贺氏菌；嗜肺军团菌；和杯状病毒科的病毒，优选兔病毒、诺如病毒、札幌病毒、纽布病毒、Recovirus，更优选诺如病毒。

优选地，微生物选自由以下微生物组成的组：沙门氏菌；肠道沙门氏菌；李斯特菌，优选单核细胞增生李斯特菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；碳青霉烯耐药性细菌，优选铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌。

式I的化合物的何种取代基R

如上所述，令人惊讶地发现，式I的化合物在用于微生物的检测时显示许多优点。特别地，式I的化合物使得微生物的检测非常简单、直接且可靠，这是因为可以将式I的化合物简单地原样添加至含微生物的介质而无需任何其它化合物或者介质的额外准备。这是优于通常应用的荧光素酶-荧光素系统的巨大优势，所述荧光素酶-荧光素系统需要使用多种化合物，其中之一，即荧光素酶，是非常昂贵的并且由于众所周知的不稳定性而限制了保存期限。此外，已显示式I的化合物在水性介质中是稳定的并且具有显著高于荧光素酶-荧光素系统的灵敏度(参见实施例9和10)。

当用于微生物的检测时，可以将式I的化合物以固体形式或以溶液添加至微生物(一种或多种)中、特别是添加至含微生物的介质(优选水性介质)。然而，由于以下原因优选使用在溶液中、优选在DMSO溶液中的式I的化合物。由于高的灵敏度(显著高于荧光素酶-荧光素系统的灵敏度)，因此仅需要非常少量的式I的化合物。通常，以小于0.1μg、优选小于0.09μg、更优选小于0.08μg、甚至更优选小于0.07μg、甚至更优选小于0.065μg、甚至更优选0.04至0.06μg、甚至更优选0.045至0.055μg、最优选约0.05μg的量使用式I的化合物。因此，使用在溶液中、特别是在DMSO溶液中的式I的化合物使得借助从已知浓度的储备溶液等分(aliquotation)容易确定添加至含微生物的介质的正确的量。此外，发现式I的化合物在DMSO溶液中是高度稳定的(在室温下数月和在4℃下数年)。

根据优选的实施方案，式I的化合物用于检测目标分析物(例如过氧化氢)/目标微生物/目标代谢产物，优选微生物，其中基团R

根据优选的实施方案，微生物为沙门氏菌优选肠道沙门氏菌、李斯特菌优选单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、或大肠杆菌。

根据优选的实施方案，微生物为沙门氏菌，优选肠道沙门氏菌，并且该化合物为式II的化合物：

其中Y为-H、任选取代的C

根据特别优选的实施方案，微生物为沙门氏菌，优选肠道沙门氏菌，并且该化合物为式IIa的化合物。

根据另一优选的实施方案，微生物为李斯特菌，优选单核细胞增生李斯特菌，并且该化合物为式III的化合物：

其中Y为-H、任选取代的C

根据特别优选的实施方案，微生物为李斯特菌，优选单核细胞增生李斯特菌，并且该化合物为式IIIb的化合物。

根据另一优选的实施方案，微生物为金黄色葡萄球菌并且该化合物为式IV的化合物：

其中Y为-H、任选取代的C

根据特别优选的实施方案，微生物为金黄色葡萄球菌并且该化合物为式IVa的化合物。

根据另一优选的实施方案，微生物为大肠杆菌并且该化合物为式V的化合物：

其中Y为-H、任选取代的C

根据特别优选的实施方案，微生物为大肠杆菌并且该化合物为式Vb的化合物。

根据优选的实施方案，目标分析物/目标微生物/目标代谢产物为过氧化氢并且式I的化合物为式VI、VIa、VIb或VIc的化合物。特别地，当将式I的化合物(其中R

根据另一优选的实施方案，微生物为碳青霉烯耐药性细菌，例如，铜绿假单胞菌或肺炎克雷白杆菌，并且该化合物为式VII或VIII的化合物。

其中Y为-H、任选取代的C

根据特别优选的实施方案，微生物为碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌并且该化合物为式VIIb或VIIIa的化合物。

其它目标分析物/目标微生物/目标代谢产物以及适合于它们的检测的特定的式I的化合物、特别是基团R

此外，本发明涉及用于目标分析物(例如过氧化氢)/目标微生物/目标代谢产物的检测的方法。

优选地，本发明涉及用于目标微生物的检测的方法。特别地，本发明涉及用于检测是否存在、定量和鉴定包括细菌、细菌碎片(例如，LPS、内毒素)、病毒、真菌以及其它病原体的微生物的方法。更特别地，本发明涉及用于通过以下手段来检测是否存在、定量和鉴定包括细菌、细菌碎片(例如，LPS、内毒素)、病毒、真菌以及其它病原体的微生物的方法，所述手段为化学发光指示代谢酶、试剂酶或参比酶对适当的分子探针的作用，通过试剂酶指示由微生物代谢产物或营养物质的酶促氧化产生的过氧化氢，或者通过试剂酶检测起到营养物质、底物、代谢产物或副产物的作用的无机磷酸盐。

所述方法包括以下步骤：a)提供包含一种或多种目标分析物(例如过氧化氢)/目标微生物/目标代谢产物的介质，b)将如第一实施方案中所述的式I的化合物添加至介质以使式I的化合物发光，和c)检测发出的光。

如果式I的化合物包含借助-N

根据优选的实施方案，所述方法包括额外的裂解步骤，所述裂解步骤可以在步骤a)和b)之间进行、或者在步骤b)中在将式I的化合物添加至介质时或之后进行。在一个实例中，可以将非特异性裂解试剂例如乙醇或其它适当的溶剂混合物(优选以15％的量)添加至介质。以此方式，细胞内酶被释放至介质中并且可以借助式I的化合物来检测。在另一实例中，可以将选择性裂解试剂例如噬菌体、肽、蛋白质(特别是内溶素及其衍生物)添加至介质。所述选择性裂解试剂导致仅特定细胞(即，对各自的选择性裂解试剂有响应的细胞)的细胞内酶的释放。因此，所述选择性裂解试剂除了检测到的酶以外还代表防止假阳性结果并且提高特异性的进一步的选择标准。原则上，这也适用于本文中公开的所有其它方面。

提高特异性的另一实例为使用基于抗体的捕获方法。例如，可以在步骤a)和b)之后添加抗体官能化的磁珠。因此，可以将特定细胞从其它细胞中收集/分离，这提高了特异性。以此方式，抗体的高特异性可以与式I的化合物以高的灵敏度检测代谢活性细菌(metabolically active bacteria)的能力结合。原则上，这也适用于本文中公开的所有其它方面。

优选地，介质为水性介质。

优选地，目标分析物/目标微生物/目标代谢产物为微生物。

优选地，微生物为表1中公开的微生物。

优选地，微生物选自由以下微生物组成的组：沙门氏菌；肠道沙门氏菌；李斯特菌，优选单核细胞增生李斯特菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；和碳青霉烯耐药性细菌，优选铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌。

优选地，在步骤b)中添加小于0.1μg、更优选小于0.09μg、甚至更优选小于0.08μg、甚至更优选小于0.07μg、甚至更优选小于0.065μg、甚至更优选0.04至0.06μg、甚至更优选0.045至0.055μg、最优选约0.05μg的式I的化合物。

优选地，在步骤b)中添加至介质的化合物存在于DMSO溶液中。在该情况下，在步骤b)中添加的式I的化合物的总量可以借助从已知浓度的储备溶液等分来简单地确定。

优选地，在步骤b)之后，介质中的化合物的最终浓度为2-50μM，优选2-40μM，更优选2-30μM，更优选5-20μM，更优选8-15μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM。

优选地，微生物为病原微生物，更优选细菌，甚至更优选沙门氏菌、李斯特菌或金黄色葡萄球菌。

根据优选的实施方案，微生物为沙门氏菌，优选肠道沙门氏菌，并且该化合物为式II的化合物：

其中Y为-H、任选取代的C

根据特别优选的实施方案，微生物为沙门氏菌，优选肠道沙门氏菌，并且该化合物为式IIa的化合物。

根据另一优选的实施方案，微生物为李斯特菌，优选单核细胞增生李斯特菌，并且该化合物为式III的化合物：

其中Y为-H、任选取代的C

根据特别优选的实施方案，微生物为李斯特菌，优选单核细胞增生李斯特菌，并且该化合物为式IIIa或IIIb、优选式IIIb的化合物。

根据另一优选的实施方案，微生物为金黄色葡萄球菌并且该化合物为式IV的化合物：

其中Y为-H、任选取代的C

根据特别优选的实施方案，微生物为金黄色葡萄球菌并且该化合物为式IVa的化合物。

根据另一优选的实施方案，微生物为大肠杆菌并且该化合物为式V的化合物：

其中Y为-H、任选取代的C

根据特别优选的实施方案，微生物为大肠杆菌并且该化合物为式Va或Vb、优选式Vb的化合物。

根据另一优选的实施方案，微生物为碳青霉烯耐药性细菌，优选铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌，并且该化合物为式VII或VIII的化合物

其中Y为-H、任选取代的C

根据特别优选的实施方案，微生物为碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌并且该化合物为式VIIa、VIIb或VIIIa、优选式VIIIa的化合物。

其它目标分析物/目标微生物/目标代谢产物以及适合于它们的检测的特定的式I的化合物、特别是基团R

此外，优选的是介质包含超过一种微生物，并且所述微生物中的一种导致比一种或多种存在于介质中的其它所述微生物高至少10倍、优选至少20倍的发光。

在可以认为是第二方面的子方面(sub-aspect)的第三方面，本发明涉及如第一方面所述的式I的化合物用于通过生长底物、营养物质和代谢产物的酶促氧化来检测所述生长底物、营养物质和/或代谢产物的用途。

生长底物、营养物质和代谢产物的检测允许病原体的间接检测。

在该方面，通过使生长底物、营养物质和/或代谢产物与将生长底物、营养物质和/或代谢产物氧化并且由此产生过氧化氢的酶接触来检测它们。因此，通过检测由作用于生长底物、营养物质或代谢产物的酶产生的过氧化氢来间接地检测生长底物、营养物质或代谢产物。

在一个实施方案中，营养物质为碳水化合物或氨基酸，并且酶为相应的氧化酶。例如，营养物质为葡萄糖并且酶为葡萄糖氧化酶；或者营养物质为D-氨基酸并且酶为D-氨基酸氧化酶(DAO)；或者营养物质为D-天冬氨酸并且酶为D-天冬氨酸氧化酶。

在优选的实施方案中，代谢产物为组胺并且酶为二氨基氧化酶。

在该方面，R

在一个实施方案中，n为0。在另一实施方案中，n为1。

特别优选的化合物为表A中公开的那些，其中R

可以以固体形式或以溶液使用式I的化合物。然而，出于以上阐述的原因，优选使用在溶液中、优选在DMSO溶液中的式I的化合物。优选地，以小于0.1μg、优选小于0.09μg、更优选小于0.08μg、甚至更优选小于0.07μg、甚至更优选小于0.065μg、甚至更优选0.04至0.06μg、甚至更优选0.045至0.055μg、最优选约0.05μg的量使用式I的化合物。

根据优选的实施方案，以1至100μM、优选5至80μM、更优选10至70μM、更优选20至60μM、更优选30至50μM、甚至更优选35至45μM的最终浓度使用该化合物。

根据另一优选的实施方案，以10至500μM、优选10至250μM、更优选10至50μM的最终浓度使用该化合物。

优选地，介质为包含原核细胞的介质、原核培养物上清液、包含真核细胞的介质、真核培养物上清液、血清或全血。

此外，本发明涉及用于通过生长底物、营养物质和代谢产物的酶促氧化来检测所述生长底物、营养物质和/或代谢产物的方法。

所述方法包括以下步骤：a)提供包含能够被酶氧化的生长底物、营养物质和/或代谢产物的介质，b)(b1)添加能够将生长底物、营养物质和/或代谢产物氧化并且由此产生过氧化氢的酶，(b2)将其中R

优选地，介质为水性介质。

更优选地，介质为包含原核细胞的介质、原核培养物上清液、包含真核细胞的介质、真核培养物上清液、血清或全血。

在一个实施方案中，营养物质为碳水化合物或氨基酸并且酶为相应的氧化酶。例如，营养物质为葡萄糖并且酶为葡萄糖氧化酶；或者营养物质为D-氨基酸并且酶为D-氨基酸氧化酶(DAO)；或者营养物质为D-天冬氨酸并且酶为D-天冬氨酸氧化酶。

在优选的实施方案中，代谢产物为组胺并且酶为二氨基氧化酶。

可以在步骤a)和b)(包括子步骤b1和b2)中的任一者中、或者在步骤a)和b)之间或之后优选以15％的量添加乙醇或其它适当的溶剂或者溶剂混合物。如上所述，可选地，可以使用其它裂解试剂。

可以以固体形式或以溶液使用式I的化合物。然而，出于以上阐述的原因，优选使用在溶液中、优选在DMSO溶液中的式I的化合物。

优选地，以小于0.1μg、优选小于0.09μg、更优选小于0.08μg、甚至更优选小于0.07μg、甚至更优选小于0.065μg、甚至更优选0.04至0.06μg、甚至更优选0.045至0.055μg、最优选约0.05μg的量添加式I的化合物。

优选地，添加式I的化合物以使介质中的化合物的最终浓度为2-50μM，优选2-40μM，更优选2-30μM，更优选5-20μM，更优选8-15μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM。

可选地，并且也是优选地，添加式I的化合物以使介质中的化合物的最终浓度为1至100μM，优选5至80μM，更优选10至70μM，更优选20至60μM，更优选30至50μM，甚至更优选35至45μM。

在可以认为是第二方面的子方面的第四方面，本发明涉及如第一方面中所定义的式I的化合物用于通过检测鲎C因子来检测细菌内毒素的用途。

在该方面，基团R

可以以固体形式或以溶液、优选DMSO溶液使用式I的化合物。优选地，以溶液、优选以DMSO溶液使用式I的化合物。

优选地，以小于0.1μg、优选小于0.09μg、更优选小于0.08μg、甚至更优选小于0.07μg、甚至更优选小于0.065μg、甚至更优选0.04至0.06μg、甚至更优选0.045至0.055μg、最优选约0.05μg的量使用式I的化合物。

此外，本发明涉及通过检测鲎C因子来检测细菌内毒素的方法，其中将式I的化合物和鲎C因子添加至含有内毒素的介质。

优选地，R

在相应的内毒素的存在下，鲎C因子的肽酶活性被激活并且该肽酶活性使R

优选地，用于该方法的介质为水性介质。

可以将乙醇或其它适当的溶剂或者溶剂混合物优选以15％的量添加至介质。如上所述，可选地，可以使用其它裂解试剂。

可以以固体形式或以溶液使用式I的化合物。然而，出于以上阐述的原因，优选使用在溶液中、优选在DMSO溶液中的式I的化合物。

优选地，介质中的式I的化合物的最终浓度为2-50μM，优选2-40μM，更优选2-30μM，更优选5-20μM，更优选8-15μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM。

在可以认为是第二方面的子方面的第五方面，本发明涉及如第一方面所述的式I的化合物用于测试乳制品例如牛奶的巴氏灭菌的用途。

优选地，所使用的化合物为式I的化合物，其中R

优选地，以1至100μM、优选5至80μM、更优选10至70μM、更优选20至60μM、更优选30至50μM、甚至更优选35至45μM的最终浓度使用该化合物。

在另一实施方案中，以1至50μM、优选5至40μM、更优选10至30μM、更优选15至25μM、更优选18至22μM、更优选19至21μM的最终浓度使用式I的化合物。

此外，本发明涉及测试乳制品、优选牛奶的巴氏灭菌的方法。

所述方法包括以下步骤：a)提供乳制品介质，优选牛奶，b)巴氏灭菌，c)将其中R

天然存在于乳制品中的磷酸酶在灭菌期间降解。因此，如果灭菌是成功的，则不会检测到发光，这是因为在乳制品中不存在活性磷酸酶。

优选地，在步骤b)中添加至介质的化合物存在于DMSO溶液中。

优选地，将式I的化合物添加至介质以使其以2-50μM、优选2-40μM、更优选2-30μM、更优选5-20μM、更优选8-15μM、甚至更优选9-11μM、最优选约10μM的最终浓度存在。

在另一实施方案中，将式I的化合物添加至介质以使其以1至50μM、优选5至40μM、更优选10至30μM、更优选15至25μM、更优选18至22μM、更优选19至21μM的最终浓度存在。

优选地，将小于0.1μg、更优选小于0.09μg、甚至更优选小于0.08μg、甚至更优选小于0.07μg、甚至更优选小于0.065μg、甚至更优选0.04至0.06μg、甚至更优选0.045至0.055μg、最优选约0.05μg的式I的化合物添加至介质。

在可以认为是第二方面的子方面的第六方面，本发明涉及式I的化合物用于测试微生物中的抗生素耐药性的用途。

优选地，R

优选地，式I的化合物如表A中所定义，其中R

优选地，微生物选自由以下微生物组成的组：沙门氏菌；肠道沙门氏菌；李斯特菌，优选单核细胞增生李斯特菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；碳青霉烯耐药性细菌，优选铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌；空肠弯曲杆菌；大肠弯曲杆菌；红嘴鸥弯曲杆菌；杆菌；葡萄球菌；梭菌；结核分支杆菌；产气荚膜梭菌；无乳链球菌；假丝酵母菌属；革兰氏阴性菌；酵母菌；霉菌；铜绿假单胞菌；肠球菌；酿脓链球菌；柠檬酸杆菌；大肠菌；阪崎肠杆菌；MRSA；VRE；嗜热脂肪芽孢杆菌；李斯特菌属；产生肠道菌的ESBL；弧菌；艰难梭菌；白色念珠菌；普氏菌；志贺氏菌、嗜肺军团菌；和杯状病毒科的病毒，优选兔病毒、诺如病毒、札幌病毒、纽布病毒、Recovirus，更优选诺如病毒。

更优选地，微生物选自由以下微生物组成的组：沙门氏菌；肠道沙门氏菌；李斯特菌，优选单核细胞增生李斯特菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；碳青霉烯耐药性细菌，优选铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌；空肠弯曲杆菌；大肠弯曲杆菌；红嘴鸥弯曲杆菌；杆菌；葡萄球菌；梭菌；结核分支杆菌；产气荚膜梭菌；无乳链球菌；假丝酵母菌属；革兰氏阴性菌；酵母菌；霉菌；铜绿假单胞菌；肠球菌；酿脓链球菌；柠檬酸杆菌；大肠菌；阪崎肠杆菌；MRSA；VRE；嗜热脂肪芽孢杆菌；李斯特菌属；产生肠道菌的ESBL；弧菌；艰难梭菌；白色念珠菌；普氏菌；志贺氏菌；和嗜肺军团菌。

甚至更优选地，微生物选自铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌。

可以以固体形式或以溶液使用该化合物。然而，优选使用在溶液中、优选在DMSO溶液中的式I的化合物。

优选地，以1至100μM、优选5至80μM、更优选10至70μM、更优选20至60μM、更优选30至50μM、甚至更优选35至45μM的最终浓度使用该化合物。

在另一实施方案中，以约1至50μM、优选2至40μM、更优选3至30μM、更优选4至20μM、更优选5至15μM、更优选7至13μM、更优选9至11μM的最终浓度使用该化合物。

此外，本发明涉及用于测试微生物中的抗生素特别是例如青霉素、头孢菌素、头孢霉素或碳青霉烯等β-内酰胺类抗生素耐药性的方法。

所述方法包括以下步骤：a)提供包含一种或多种微生物的介质，b)将式I的化合物添加至介质，其中R

优选地，式I的化合物如表A中所定义，其中R

优选地，介质为水性介质。

可以在步骤a)和b)中的任一者中或者在步骤a)和b)之间或之后优选以15％的量添加乙醇或其它适当的溶剂或者溶剂混合物。如上所述，可选地，可以使用其它裂解试剂。

在另一实施方案中，将式I的化合物添加至介质以使其以1至50μM、优选2至40μM、更优选3至30μM、更优选4至20μM、更优选5至15μM、更优选7至13μM、更优选9至11μM的最终浓度存在。

特别地，该方法适合于区分抗生素耐药性微生物和抗生素敏感性微生物，这是因为仅对于抗生素耐药性微生物发生发光。

在可以认为是第二方面的子方面的第七方面，本发明涉及式I的化合物用于检测无机磷酸盐、优选通过酶促反应产生的无机磷酸盐的用途。

优选地，R

优选地，无机磷酸盐由腺苷三磷酸双磷酸酶、优选志贺氏菌腺苷三磷酸双磷酸酶产生。在该情况下，该化合物适合于检测志贺氏菌，其为世界各地腹泻的主要细菌原因之一。

可以以固体形式或以溶液使用该化合物。然而，优选使用在溶液中、优选在DMSO溶液中的式I的化合物。

优选地，以1至100μM、优选5至80μM、更优选10至70μM、更优选20至60μM、更优选30至50μM、甚至更优选35至45μM的最终浓度使用该化合物。

此外，本发明涉及用于检测无机磷酸盐、优选通过酶促反应产生的无机磷酸盐的方法。

所述方法包括以下步骤：a)提供包含无机磷酸盐的介质，b)将式I的化合物添加至介质，其中R

优选地，式I的化合物如表A中所定义，其中R

优选地，介质中包含的无机磷酸盐由腺苷三磷酸双磷酸酶、优选志贺氏菌腺苷三磷酸双磷酸酶产生。因此，优选的是步骤a)中的介质包含腺苷三磷酸双磷酸酶，优选志贺氏菌腺苷三磷酸双磷酸酶。特别优选的是步骤a)中的介质包含志贺氏菌。

优选地，介质为水性介质。

优选地，在步骤b)中添加至介质的化合物存在于DMSO溶液中。

优选地，介质中的化合物的最终浓度为2-50μM，优选2-40μM，更优选2-30μM，更优选5-20μM，更优选8-15μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM。

在可以认为是第二方面的子方面的第八方面，本发明涉及式I的化合物用于优选通过检测指示微生物嗜热脂肪芽孢杆菌的α-D-葡萄糖苷酶活性来监测灭菌过程的用途。嗜热脂肪芽孢杆菌产生α-葡萄糖苷酶，然而α-葡萄糖苷酶在灭菌时失活。

优选地，R

另外，在该方面，可以以固体形式或以溶液使用式I的化合物。然而，优选使用在溶液中、优选在DMSO溶液中的式I的化合物。

优选地，以1至100μM、优选5至80μM、更优选10至70μM、更优选20至60μM、更优选30至50μM、甚至更优选35至45μM的最终浓度使用该化合物。

此外，本发明涉及用于优选通过检测指示微生物嗜热脂肪芽孢杆菌的α-D-葡萄糖苷酶活性来监测灭菌过程的方法。

所述方法包括以下步骤：a1)提供包含在正常条件下产生α-葡萄糖苷酶的微生物、优选嗜热脂肪芽孢杆菌的介质，a2)将介质灭菌，b)将式I的化合物添加至介质，其中R

优选地，式I的化合物如表A中所定义，其中R

优选地，介质为水性介质。

可以在步骤b)中或之后优选以15％的量添加乙醇或其它适当的溶剂或者溶剂混合物。如上所述，可选地，可以使用其它裂解试剂。

优选地，将小于0.1μg、更优选小于0.09μg、甚至更优选小于0.08μg、甚至更优选小于0.07μg、甚至更优选小于0.065μg、甚至更优选0.04至0.06μg、甚至更优选0.045至0.055μg，最优选约0.05μg的式I的化合物添加至介质。

优选地，添加至介质的化合物存在于DMSO溶液中。

优选地，介质中的化合物的最终浓度为2-50μM，优选2-40μM，更优选2-30μM，更优选5-20μM，更优选8-15μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM。

在可以认为是第二方面的子方面的第九方面，本发明涉及如第一方面所述的式I的化合物用于细菌的抗生素耐药性的终点检测和在线检测、以及用于抗生素敏感性测试的用途。

在该方面，可以在培养开始时或在测量时将该化合物添加至含有细菌和抗生素的介质。抗生素耐药性细菌即使在抗生素的存在下也会繁殖，这会借助基团R

何种基团R

另外，在该方面，可以以固体形式或以溶液使用式I的化合物。然而，优选使用在溶液中、优选在DMSO溶液中的式I的化合物。

优选地，以1至100μM、优选5至80μM、更优选10至70μM、更优选20至60μM、更优选30至50μM、甚至更优选35至45μM的最终浓度使用该化合物。

此外，本发明涉及用于细菌的抗生素耐药性的终点检测和在线检测以及用于抗生素敏感性测试的方法。

所述方法包括以下步骤：a)提供包含微生物、优选细菌的介质，b)添加抗生素，c)添加式I的化合物，其中R

何种基团R

优选地，添加至介质的化合物存在于DMSO溶液中。

优选地，介质中的化合物的最终浓度为2-50μM，优选2-40μM，更优选2-30μM，更优选5-20μM，更优选8-15μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM。

优选地，介质为水性介质。

可以在步骤b)中或之后优选以15％的量添加乙醇或其它适当的溶剂或者溶剂混合物。如上所述，可选地，可以使用其它裂解试剂。

现在将通过以下非限制性实例进一步说明本发明。

通用方法：

除非另有说明，所有反应均在室温下进行。化学品和溶剂为A.R.级或者通过标准技术来纯化。薄层色谱法(TLC)：硅胶板Merck 60F254：通过用UV光照射使化合物显现。柱色谱法(FC)：硅胶Merck 60(粒径0.040-0.063mm)，洗脱液在括号中给出。反相高压液相色谱法(RP-HPLC)：C18 5μm，250×4.6mm，洗脱液在括号中给出。制备型RP-HPLC：C18 5μm，250×21mm，洗脱液在括号中给出。荧光和化学发光记录在Molecular Devices Spectramax i3x上。

如果没有另外说明，所有化学品均购自Merck和Biosynth AG并且按原样使用。

缩写.AcOH-乙酸，MeCN-乙腈，DCM-二氯甲烷，DMF-N,N'-二甲基甲酰胺，EtOAc-乙酸乙酯，Hex-己烷，MeOH-甲醇，TFA-三氟乙酸，THF-四氢呋喃，TIPSCl-三异丙基氯硅烷。

将DCC(457mg，2.21mmol，1.1eq)添加至辛酸(350μl，2.21mmol，1.1eq)和4-羟基苯甲醇(250mg，2.01mmol，1eq)在DCM(2ml)中的混合物中。将反应混合物在室温下搅拌并且通过TLC(40:60EtOAc:Hex)来监测。完成后，将DCC滤除并且将粗产物通过在硅胶上的柱色谱(30:70EtOAc:Hex)来纯化以得到作为浅黄色固体的化合物1a(246mg，产率49％)。

将化合物1a(200mg，0.8mmol，1eq)溶解于4mL ACN中并且冷却至0℃。添加碘化钠(360mg，2.4mmol，3eq)，然后快速添加TMS-Cl(306μl，2.4mmol，3eq)。使反应升温至室温并且通过TLC(30:70EtOAc:Hex)来监测。完成后，将反应混合物用EtOAc稀释，并且用饱和Na

在氩气氛下将化合物1c(按照Green,O.,Eilon,T.,Hananya,N.,Gutkin,S.,Bauer,CR.,Shabat,D.,ACS Central Sci.,2017,4,349-58来制备)(30mg，0.08mmol，1.1eq)溶解于干燥的DMF中并且冷却至0℃。添加氢化钠(6.4mg，0.16mmol，2.2eq)，并且使反应升温至室温。在搅拌15分钟之后，添加化合物1b(26mg，0.07mmol，1eq)并且通过RP-HPLC(在水中的90-100％ACN，20min)来监测反应。完成后，将反应混合物通过减压蒸发来浓缩并且将粗产物通过制备型RP-HPLC(在水中的95-100％ACN，20min)来纯化以得到作为白色固体的化合物1d(18mg，产率45％)。

将化合物1d(18mg，0.03mmol)和几毫克亚甲蓝溶解于5mL DCM和几滴DMF(以提高溶解度)中。在用黄光照射的同时，将氧气鼓泡通过溶液。通过RP-HPLC(在水中的90-100％ACN，20min)来监测反应。完成后，将反应混合物通过减压蒸发来浓缩。将粗产物通过制备型RP-HPLC(在水中的90-100％ACN，20min)来纯化以得到作为灰白色固体的化合物IIa(15mg，产率79％)。

将1,2:4,5-二-O-异亚丙基-肌醇(250mg，0.96mmol，1eq)和咪唑(98mg，1.44mmol，1.5eq)溶解于干燥的吡啶(3ml)中并且冷却至-10℃。通过注射器缓慢地添加叔丁基二苯基氯硅烷(275μl，1.06mmol，1.1eq)。使反应升温至室温并且通过TLC(50:50EtOAc:Hex)来监测。完成后，将反应混合物用EtOAc稀释，并且用饱和NH

将化合物1a(170mg，0.341mmol，1eq)溶解于DCM中，并且添加乙基乙烯基醚(652μl，6.8mmol，20eq)，然后添加吡啶对甲苯磺酸盐(39mg，0.153mmol，0.45eq)。通过TLC(20:80EtOAc:Hex)来监测反应，并且完成后，将反应用Et

将化合物1b(90mg，0.16mmol，1eq)溶解于THF(1ml)中并且添加四丁基氟化铵(在THF中为1M，240μl，0.24mmol，1.5eq)。将反应在室温下搅拌过夜。完成后，在减压下将溶剂除去。将粗品溶解于Et

将化合物1c(39mg，0.117mmol，1eq)溶解于干燥的DCM中。添加二异丙基乙胺(63μl，0.351mmol，3eq)，然后滴加氯(N,N-二异丙基氨基)甲氧基膦(45μl，0.234mmol，2eq)。将反应在室温下放置过夜。此后，在减压下将溶剂除去。将粗品再溶解于DCM中，然后添加4-羟基苯甲醛(20mg，0.164mmol，1.4eq)和四唑(在ACN中为0.45M，780μl，0.351mmol，3eq)。通过TLC(20:80EtOAc:Hex)来监测反应。在2小时之后，在0℃下缓慢地滴加叔丁基氢过氧化物(在癸烷中为5.5M，43μl，0.234mmol，2eq)。通过TLC(30:70EtOAc:Hex)来监测反应。完成后，将反应混合物用DCM稀释，并且用5％NaHCO

将化合物1e(95mg，0.18mmol，1eq)溶解于MeOH和几滴DCM中。缓慢地添加NaBH

将化合物1e(305mg，0.57mmol，1eq)溶解于DCM中。滴加甲磺酰氯(54μl，0.68mmol，1.2eq)和三甲胺(97μl，0.68mmol，1.2eq)。通过TLC(30:70EtOAc:Hex)来监测反应。完成后，将反应混合物用DCM稀释，并且用饱和NaHCO

将化合物1h(20mg，0.022mmol，1eq)溶解于丙酮中并且添加碘化锂(6mg，0.044mmol，2eq)。将反应加热至回流并且通过RP-HPLC(10-60％ACN，碳酸铵15mM缓冲液，20min)来监测。将溶剂除去并且将粗品溶解于DCM。添加几毫克亚甲蓝，并且在用黄光照射的同时，将氧气鼓泡通过溶液。通过RP-HPLC(15-70％ACN，碳酸铵15mM缓冲液，20min)来监测反应。完成后，将反应混合物通过减压蒸发来浓缩。将粗产物通过制备型RP-HPLC(15-70％ACN，碳酸铵15mM缓冲液，20min)来纯化以得到作为灰白色固体的化合物1i(13mg，经两步后的产率为63％)。MS(ES-)：C

将化合物1i(13mg，0.041mmol)添加至冷却的(0℃)AcOH:H

将4-羟基苯甲醇(1)(0.0400mol，4.97mol)溶解于DCM(80ml)中并且添加DMAP(2eq.，0.0800mol，9.77g)。在另外的烧瓶中，将亚磷酸三烯丙酯(2.2eq.，0.0880mol，17.8g，17.8mL)溶解于DCM(80mL)中，将混合物冷却至0℃并且分批添加碘(2eq.，0.080mol，20.3g)，并且在0℃下搅拌混合物直至所有碘消失(约20min)，导致形成无色溶液。将该溶液(包含鏻盐)分批添加至酯1和DMAP的溶液。将所得混合物在室温下搅拌。在1h之后向反应混合物(黄色溶液)中添加盐水(80mL)，将分离的有机物干燥(MgSO

将醇2(2.00g，0.00700mol)在DCM(100mL)中的溶液冷却至0℃。添加NBS(2eq.，0.014mol，2.5g)和Ph

将酯4(1.34g，0.00345mol)在DMF(9mL)中的溶液(无色溶液)冷却至0℃(黄色悬浮液)，添加K

向酯5(1.9g，0.0029mol)在CH

将水(28mL)和NaOH(3eq.，0.0087，0.35g)添加至酯6(0.0029mol，来自上一步的理论摩尔数)，将混合物用Et

向RA-0173(0.1g，0.00016mol)在DCM(30mL)和MeOH(30mL)中的溶液中添加亚甲蓝三水合物(0.04eq.，0.0065mmol，2.4mg)，并且将所得混合物通过注射器式过滤器(25mm，0.45μm)来过滤。用LED灯(Peschl Ultraviolet，100W，625nm)以均相流(homogeneousflow)(0.9-1.1mL min

可以通过本领域技术人员已知的手段例如离子交换用氢来交换钠原子以产生“OH”基团。

将酯2(0.00644mol，2.51g)溶解于DMF(50mL)中并且将所得混合物冷却至0℃。在0℃下添加K

将酯3(0.00300mol，2.48g)溶解于THF(60mL)和H

将4(50mg，0.076mmol)和亚甲蓝(1.2mg，3.2mmol)溶解于DCM/MeOH混合物(30mL，5:1)中，并且使溶液通过注射器式过滤器(0.45mm)。将澄清的溶液用MPLC泵(Labomatic MD80/100)泵入至气-液混合室(gas-liquid mixing cell)(Peschl Ultraviolet)中并且与氧气(1.0bar)混合。然后在室温下用LED灯(625nm，novaLIGHT FLED 100-625，PeschlUltraviolet)以连续流照射氧饱和溶液。将混合物收集在250mL圆底烧瓶中并且用氮气连续吹扫溶液。将获得的反应混合物用20mL EtOAc稀释、通过二氧化硅短垫(short pad)过滤并且用EtOAc/MeOH(120mL，9:1)洗涤。将滤液在室温下在避光下浓缩，并且将获得的固体残余物与Et

将酚1(0.00100mol，3.54g)在DCM(40mL)中的溶液冷却至0℃，并且在氩气下添加Tf

将三氟甲磺酸酯2(0.00925mol，4.50g)、B

向硼酸酯3(0.00500mol，2.30g)和THF(20mL)的混合物中添加水(5mL)和NaOH(3eq.，0.0150mol，0.600g)，并且将所得混合物在40℃下搅拌。在14h之后，向混合物中添加0.5M HCl(200ml)并且将混合物用EtOAc(3次，50ml)萃取。将合并的有机物用盐水(50mL)洗涤、干燥(MgSO

向酸4(0.00019mol，0.085g)在DCM(18mL)中的溶液中添加亚甲蓝(9mg)，将反应烧瓶用橡胶隔片来密封并且连接填充有氧气的气球(深蓝色溶液)。用黄光(589nm)照射所得混合物。在6h之后，将反应混合物在真空中浓缩，产生蓝色油状物。将该残余物通过柱色谱来纯化，产生作为淡黄色固体的化合物VIa，0.052g，57％。

4-((2R,3S)-3-((R)-1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)-4-氧代氮杂环丁-2-基)-2-重氮-3-氧代戊酸(R)-4-硝基苄酯(3)

在氩气氛下，向商购可得的美罗培南中间体2(2.6g，6.8mmol)在无水DMF(15mL)中的溶液中添加TBDMSCl(4.0g，27.1mmol)和咪唑(2.8g，40.8mmol)。将所得混合物在室温下搅拌5h。在用乙酸乙酯(50mL)稀释之后，将溶液用水(20mL×3)洗涤并且随后用盐水(20mL×1)洗涤。将有机层经Na

(4R,5R,6S)-4-硝基苄基-6-((R)-1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)-4-甲基-7-氧代-3-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸酯(4)

在氩气下，向圆底烧瓶中添加ZnCl

(E)-3-(4-(((1r,3r,5R,7S)-金刚烷-2-叉基)(甲氧基)甲基)-3-氯-2-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苄基)氧基)苯基)丙烯酸甲酯(7)

将烯醇醚5(按照Green,O.,Eilon,T.,Hananya,N.,Gutkin,S.,Bauer,CR.,Shabat,D.,ACS Central Sci.,2017,4,349-58来制备)(500mg，1.3mmol)溶解于3mL干燥的DMF中并且冷却至0℃。在添加化合物6(参见，Karton-Lifshin N.,Albertazzi L.,Bendikov M.,Baran PS.,Shabat D.,J Am Chem Soc.,2012,134(50),20412-20)(536.6mg，1.6mmol)之前，添加K

(4S,5R,6S)-3-(4-((3-(((1r,3r,5R,7S)-金刚烷-2-叉基)(甲氧基)甲基)-2-氯-6-((E)-3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-6-((R)-1-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)-4-甲基-7-氧代-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸-4-硝基苄酯(8)

向频哪醇硼酸酯7(304mg，0.50mmol)和三氟甲磺酸乙烯酯4(304mg，0.50mmol)在CH

(4S,5R,6S)-3-(4-((3-(((1r,3r,5R,7S)-金刚烷-2-叉基)(甲氧基)甲基)-2-氯-6-((E)-3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-6-((R)-1-羟基乙基)-4-甲基-7-氧代-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸-4-硝基苄酯(9)

在室温下，向8(350mg，0.4mmol)在N-甲基吡咯烷酮/DMF(1:3，0.7ml)中的溶液中添加二氟化氢铵(150mg，2.8mmol)，并且将所得反应混合物在室温下搅拌72h(通过TLC来监测)。然后将反应用乙酸乙酯(40mL)稀释并且用水和盐水洗涤。在经Na

(4S,5R,6S)-3-(4-((3-(((1r,3r,5R,7S)-金刚烷-2-叉基)(甲氧基)甲基)-2-氯-6-((E)-3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯氧基)甲基)苯基)-6-((R)-1-羟基乙基)-4-甲基-7-氧代-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(10)

在20℃下，向化合物7(20mg，0.02mmol)在0.5mL DME的溶液中添加0.2mL磷酸盐缓冲液(0.35M，pH 6.0)和活化的锌粉。然后将反应混合物在相同的温度下搅拌1h。用0.22μMPTFE注射器式过滤器将沉淀物除去并且使用制备型RP-HPLC、使用CH

(4S,5R,6S)-3-(4-((2-氯-6-((E)-3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)-3-((1r,3r,5S,7S)-4'-甲氧基螺[金刚烷-2,3'-[1,2]二氧杂环丁烷]-4'-基)苯氧基)甲基)苯基)-6-((R)-1-羟基乙基)-4-甲基-7-氧代-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸(1)

将烯醇醚10和几毫克亚甲蓝溶解于15mL DCM中。在用黄光照射20分钟的同时，将氧气鼓泡通过溶液。通过RP-HPLC来监测反应。完成后，将反应混合物通过减压蒸发来浓缩。通过制备型RP-HPLC、使用CH

向500ml三颈烧瓶中加入10g对甲酚(92.5mmol/1eq.)，然后加入干燥的DCM(200mL)。使混合物在冰水冷却浴中冷却。向该溶液中添加吡啶(10.24g/12.9mmol/1.4eq.)。在保持反应混合物的温度低于12℃的情况下，从滴液漏斗滴加辛酰氯(18g/110.7mmol/1.2eq.)(溶解于50mL干燥的DCM中)。在15分钟之后，将冷却浴移除并且在环境温度下搅拌混合物。反应在50分钟后完成(通过TLC(石油醚/AcOEt＝2/1)来控制)。将反应混合物用200mL水洗涤，然后用2×200mL 0.2M NaOH溶液洗涤。将有机相经Na

向装有CCl

将4-溴甲基-苯基-辛酸酯(27.7g/88mmol/1.2eq.)和2-氰基-6-羟基-苯并噻唑(13.07g/7mmol/1eq)溶解在干燥的丙酮(120mL)中并且在加热油浴(80℃)中搅拌。一次性添加K

将1.3g起始物料(1.3g/3.18mmol/1eq)溶解于DCM(30mL)和MeOH(30mL)的混合物中。在将固体溶解之后，添加10mL水。将获得的溶液用氩气鼓泡15分钟。添加半胱氨酸盐酸盐一水合物(592mg/3.37mmol/1.06eq)并且使其在约3min内溶解。将K

通过分别选择起始物料根据如以上阐述的过程来合成本文中公开的其它化合物。

通用合成方案

将化合物1a(根据Green,O.；Eilon,T.；Hananya,N.；Gutkin,S.；Bauer,C.R.；Shabat,D.ACS Cent.Sci.2017,3,349来合成)(2.0g，7.4mmol)和咪唑(756mg，11.1mmol)溶解于20mL DCM中。添加三异丙基氯硅烷(1.7mL，8.1mmol)并且在室温下搅拌溶液。通过TLC来监测反应。完成后，将白色沉淀物滤除并且在减压下将溶剂蒸发。通过柱色谱(Hex:EtOAc95:5)的纯化得到3.1g(产率99％)的无色油状物。

将化合物2a(根据Green,O.；Eilon,T.；Hananya,N.；Gutkin,S.；Bauer,C.R.；Shabat,D.ACS Cent.Sci.2017,3,349来合成)(2.0g，6.6mmol)和咪唑(671mg，9.7mmol)溶解于20mL DCM中。添加三异丙基氯硅烷(1.5mL，7.2mmol)并且在室温下搅拌溶液。通过TLC来监测反应。完成后，将白色沉淀物滤除并且在减压下将溶剂蒸发。通过柱色谱(Hex:EtOAc95:5)的纯化得到2.9g(产率97％)的无色油状物。

将化合物1b(2.00g，4.7mmol)、双(频哪醇合)二硼(2.14g，8.44mmol)、(1,5-环辛二烯)(甲氧基)铱(I)二聚体(63mg，0.93mmol)和4,4′-二-叔丁基-2,2′-联吡啶(51mg，0.189mmol)溶解于密封管中的20mL无水THF中。将反应混合物在80℃下搅拌2小时并且监测。完成后，在减压下将溶剂蒸发。使粗产物通过硅胶柱(Hex:EtOAc 65:35)以得到1.73g(产率83％)的白色固体，其用于下一步骤而无需进一步纯化。

将化合物2b(2.00g，4.3mmol)、双(频哪醇合)二硼(1.97g，7.76mmol)、(1,5-环辛二烯)(甲氧基)铱(I)二聚体(58mg，0.856mmol)和4,4′-二-叔丁基-2,2′-联吡啶(47mg，0.173mmol)溶解于在密封管中的20mL无水THF中。将反应混合物在80℃下搅拌2小时并且监测。完成后，在减压下将溶剂蒸发。使粗产物通过硅胶柱(Hex:EtOAc 70:30)以得到1.84g(产率89％)的白色固体，其用于下一步骤而无需进一步纯化。

将化合物1c(1.5g，3.40mmol)溶解于150mL甲苯中并且冷却至0℃。分批添加N-碘代琥珀酰亚胺(635mg，2.81mmol)。通过TLC来监测反应。完成后，在减压下将溶剂蒸发。通过柱色谱(Hex:EtOAc 90:10)的纯化得到900mg(产率47％)的白色固体。

将化合物2c(1.5g，3.16mmol)溶解于150mL甲苯中并且冷却至0℃。分批添加N-碘代琥珀酰亚胺(592mg，2.63mmol)。通过TLC来监测反应。完成后，在减压下将溶剂蒸发。通过柱色谱(Hex:EtOAc 90:10)的纯化得到967mg(产率51％)的白色固体。

在N

将化合物1e(150mg，0.48mmol)和(三苯基亚正膦基)乙酸甲酯(191mg，0.57mmol)溶解于MeCN(3mL)中，并且将混合物加热至回流，同时通过RP-HPLC(梯度为在水中的ACN，0.1％TFA)来监测。在起始物料完全消耗后，将反应混合物冷却，用EtOAc(100mL)稀释，用盐水(50ml)洗涤。将有机层经Na

将化合物2e(150mg，0.43mmol)和(三苯基亚正膦基)乙酸甲酯(172mg，0.51mmol)溶解于MeCN(3mL)中，并且将混合物加热至回流，同时通过RP-HPLC(梯度为在水中的ACN，0.1％TFA)来监测。在起始物料完全消耗后，将反应混合物冷却，用EtOAc(100mL)稀释，用盐水(50ml)洗涤。将有机层经Na

将化合物1f(50mg，0.15mmol)和催化量的亚甲蓝溶解于20mL DCM中。然后，在用黄光照射的同时，将氧气鼓泡通过溶液。通过RP-HPLC来监测反应。完成后(10min)，将溶剂减压浓缩并且将产物通过制备型RP-HPLC(梯度为在水中的ACN，0.1％TFA)来纯化。获得作为白色固体的产物(40mg，73％)。

将化合物2f(50mg，0.13mmol)和催化量的亚甲蓝溶解于20mL DCM中。然后，在用黄光照射的同时，将氧气鼓泡通过溶液。通过RP-HPLC来监测反应。完成后(10min)，将溶剂减压浓缩并且将产物通过制备型RP-HPLC(梯度为在水中的ACN，0.1％TFA)来纯化。获得作为白色固体的产物(36mg，67％)。

将化合物IIa添加至包含10％v/v二甲亚砜的磷酸盐缓冲生理盐水(pH 7.4)中，达到最终浓度为62.5μM。将分析混合物在室温下预温育20min，然后添加1:5v/v的包含不同酶浓度的猪肝酯酶溶液，并且在室温下使用SpectraMax M5酶标仪以发光模式记录发光20min。在黑色微量滴定板中以0.25mL的总液体体积进行分析。在20min测量周期内的猪肝酯酶的浓度和最大RLU(相对光单位)值在两个数量级上显示正线性相关。图1示出该实施例的结果。

将弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090(C.f.，C8E阴性)、大肠杆菌ATCC 25922(E.c.，C8E阴性)、鼠伤寒沙门氏菌(D)ATCC 14028(S.T.，肠道沙门氏菌属I型鼠伤寒(Salmonellaenterica ssp.I ser.Typhimurium)，C8E阳性)、肠炎沙门氏菌(D)ATCC 13076(S.E.1，肠道沙门氏菌属肠道型肠炎(Salmonella enterica ssp.enterica ser.Enteritidis)，C8E阳性)和肠炎沙门氏菌RKI05/07992(S.E.2，肠道沙门氏菌属肠道型肠炎(Salmonellaenterica ssp.enterica ser.Enteritidis)，C8E阳性)在营养肉汤(5g/L蛋白胨，5g/LNaCl，2g/L酵母提取物，1g/L牛肉膏，pH 7.4)中培养17h然后在无菌生理盐水(0.9％NaCl)中连续稀释。将类似细胞浓度的所有菌株用营养肉汤接种在一式三份的试管中。此外，将S.E.2细胞在无菌生理盐水中的进一步的稀释物接种在一式三份的试管中。将无菌生理盐水添加至阴性对照管中。在37℃和150rpm下培养6h之后，将样品从培养物(0.205mL)中取出并且在白色微量滴定板中与45μL在二甲亚砜中的化合物IIa溶液混合。化合物IIa的最终浓度为10μM，二甲亚砜的最终浓度为15％v/v。用装配有发光检测系统的平板酶标仪(platereader)来记录发光。比较了在添加化学发光底物后27-30min时间段的平均RLU(相对光单位)值(表3)。在类似的接种密度(10

表3：在添加化合物IIa之后，肠道沙门氏菌培养物样品相比于其它细菌种类的发光

将化合物IIIa添加至包含1％v/v二甲亚砜的磷酸盐缓冲生理盐水(pH 7.4)中，达到最终浓度为10μM。添加不同浓度的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)并且在室温下记录发光(表4)。在白色微量滴定板中以0.25mL的总液体体积进行分析。在20min测量周期内的PI-PLC的浓度和最大RLU(相对光单位)值在两个数量级上显示正相关。

表4：用化合物IIIa测量PI-PLC活性

将单核细胞增生李斯特菌ATCC 7644(L.m.1，PI-PLC阳性)、单核细胞增生李斯特菌(4b)ATCC 19115(L.m.2，PI-PLC阳性)、无害李斯特菌(Listeria innocua)(6a)ATCC33090(L.i.，PI-PLC阴性)和大肠杆菌ATCC 25922(E.c.，PI-PLC阴性)在M52肉汤(1.35g/L磷酸二氢钾，9.6g/L磷酸氢二钠，1.11g/L丙酮酸钠，6g/L酵母提取物，17g/L胰蛋白胨，3g/L植物蛋白胨，5g/L氯化钠，2.5g/L葡萄糖，pH 7.3)中培养19h然后在无菌生理盐水(0.9％NaCl)中连续稀释。将类似细胞浓度的所有菌株用M52肉汤接种在一式三份的试管中。此外，将L.m.2细胞在无菌生理盐水中的进一步稀释物接种在一式三份的试管中。将无菌生理盐水添加至阴性对照管中。在37℃和150rpm下培养6h之后，将样品从培养物(0.99mL)中取出并且在白色微量滴定板中与1μL在二甲亚砜中的化合物IIIa溶液混合。化合物IIIa的最终浓度为10μM，二甲亚砜的最终浓度为1％v/v。用装配有发光检测系统的平板酶标仪来记录发光。比较了在添加化学发光底物后16-20min时间段的平均RLU(相对光单位)值(表5)。在类似的接种密度(10

表5：用化合物IIIa检测单核细胞增生李斯特菌

将肠炎沙门氏菌RKI 05/07992在营养肉汤(5g/L蛋白胨，5g/L NaCl，2g/L酵母提取物，1g/l牛肉膏，pH 7.4)中培养20h(37℃，150rpm)，然后在磷酸盐缓冲生理盐水中连续稀释。将细胞悬浮液与包含二甲亚砜(在分析中的最终浓度为15％)的磷酸盐缓冲生理盐水和化合物IIa(最终浓度10μM)或4-甲基伞形酮辛酯(MUCAP，最终浓度0.1mM)以1:1v/v混合。在微孔板中进行分析，总液体体积为0.2mL。用SpectraMax M5(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)平板酶标仪来记录发光和荧光(激发360nm，发射455nm)。由光密度(600nm)来估计未稀释的培养物的细胞浓度。结论：当使用化合物IIa代替MUCAP时，肠道沙门氏菌的检测限低625倍。

图2显示使用发光化合物IIa(空心符号)或荧光底物MUCAP(实心符号)的肠道沙门氏菌的检测限。

将金黄色酿脓葡萄球菌ATCC 29213(S.a.，磷酸酶阳性)和溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)RKI 06-01354(S.h.，弱磷酸酶活性)在营养肉汤(5g/L蛋白胨，5g/L NaCl，2g/L酵母提取物，1g/L牛肉膏，pH 7.4)中培养17h，然后在无菌生理盐水(0.9％NaCl)中连续稀释。将类似细胞浓度的S.a.和S.h.用营养肉汤接种在一式三份的试管中。此外，将S.a.细胞在无菌生理盐水中的四种进一步连续稀释物接种在一式三份的试管中。将无菌生理盐水添加至阴性对照管中。在37℃和150rpm下培养6h之后，将样品从培养物(0.196mL)中取出并且在白色微量滴定板中与4μL在二甲亚砜中的化合物IVa溶液混合。化合物IVa的最终浓度为10μM，二甲亚砜的最终浓度为2％v/v。用装配有发光检测系统的平板酶标仪来记录发光。比较了在添加化学发光底物后15-20min时间段的平均RLU(相对光单位)值(表6)。结论：可以使用化合物IVa以高的灵敏度检测金黄色酿脓葡萄球菌。

表6：在添加化合物IVa之后葡萄球菌培养物样品的发光

从瑞士超市获得UHT全脂牛奶(牛奶1)和巴氏灭菌的全脂牛奶(牛奶2)。将来自牛小肠的碱性磷酸酶(AP)以0.5U/mL的最终浓度添加至牛奶样品中。将一式三份的在聚丙烯试管中的牛奶样品(添加有(spiked with)碱性磷酸酶)在水浴中在70℃下加热20min，将类似的参比样品保持在室温下。在白色微量滴定板中通过添加2:1(v/v)检测混合物(20μM化合物IVa，100mM三(羟甲基)-氨基甲烷盐酸盐pH 9.7，1mM氯化镁，在室温下预温育20min)来分析加热和未加热的牛奶样品的碱性磷酸酶活性。用SpectraMax M5平板酶标仪来记录发光，总分析体积为0.3mL。与保持在室温下的样品相比，巴氏灭菌的牛奶样品的平均RLU(相对光单位)值低8至10倍(图3：使用化合物IVa的巴氏灭菌对牛奶中碱性磷酸酶活性的影响的化学发光计量分析。n＝3重复实验的平均值和标准偏差)。还可以检测未添加的牛奶(non-spiked milk)中的残余的碱性磷酸酶活性，并且测得的RLU值表明UHT牛奶(牛奶1)中的碱性磷酸酶活性低于巴氏灭菌的牛奶(牛奶2)。

结论：化合物IVa和相关化合物适合于监测牛奶巴氏灭菌和类似过程。

将甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌ATCC 33592(MRSA)(一种对例如甲氧西林和苯唑西林等青霉素衍生物耐药的菌株)和甲氧西林敏感性金黄色酿脓葡萄球菌ATCC29213(MSSA)在37℃下、在营养肉汤(5g/L蛋白胨，5g/L氯化钠，2g/L酵母提取物，1g/L肉膏，pH 7.4)中培养过夜，并且在无菌生理盐水中稀释。将MRSA和MSSA菌株以约10

结论：化合物IVa和相关化合物适合于在短时间(1至2h)检测甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)。

将大肠杆菌ATCC 25922(E.c.，β-半乳糖苷酶阳性)和肠炎沙门氏菌RKI05/07992(S.E.，β-半乳糖苷酶阴性)在营养肉汤中培养17h然后在无菌生理盐水(0.9％NaCl)中连续稀释。将经稀释的细胞悬浮液以1:100(v/v)接种在含有LB全营养培养基(full-strengthLB medium)(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl)或者用超纯水以1:20(v/v)稀释的LB培养基(LB 1:20)的试管中。所有培养基均含有用于诱导β-半乳糖苷酶的1mM IPTG。将无菌生理盐水添加至阴性对照管中。在37℃和150rpm下培养6h之后，将样品(0.255mL)从培养物中取出并且在白色微量滴定板中与45μL化合物Va在乙醇中的储备溶液混合。化合物Va的最终浓度为20μM，乙醇的最终浓度为15％v/v。用SpectraMax M5平板酶标仪来记录发光。比较了在添加化学发光底物后9-10min时间段的平均RLU(相对光单位)值(表VIa)。为了比较，将相同的大肠杆菌菌株以类似的方式预培养并且稀释，然后接种在经稀释的Mueller-Hinton肉汤(MH 1:20，用20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)以1:20(v/v)稀释的全营养培养基)中。培养基补充有1mM IPTG。在37℃和150rpm下培养6h之后，将培养物样品(45μL)转移至微量滴定板，并且与5μL 10×裂解试剂混合，所述裂解试剂包含2％w/v十二烷基-三甲基溴化铵、1mM D-荧光素-6-O-β-D-吡喃半乳糖苷(商购可得，Biosynth Cat.No.L-8600)和10mM氯化镁。裂解和与D-荧光素-6-O-β-D-吡喃半乳糖苷的反应在37℃下进行1h。然后，添加0.2mL荧光素酶分析混合物(5:1v/v)。分析混合物包含62.5mM Tris乙酸盐(pH 7.8)、12.5mM硫酸镁、2.5g/L牛血清白蛋白、7.5mM D/L-半胱氨酸、1.25mM乙二胺四乙酸盐、25μM焦磷酸钠、10g/L环糊精、1.25mM 5-三磷酸腺苷和13.1μg/mL商购可得的萤火虫荧光素酶(Photinuspyralis luciferase)(重组)。用SpectraMax M5平板酶标仪来记录发光。测量的前两分钟的平均相对光单位(RLU)在表VIb中示出。

结论：当依靠化合物Va而不是D-荧光素-6-O-β-D-吡喃半乳糖苷来检测β-半乳糖苷酶时，尽管使用降低了5倍的工作浓度，但是对于大肠杆菌的最低测试接种密度所达到的信噪比高9倍。

根据本领域技术人员已知的方法来合成D-荧光素-6-O-苯基-辛酸酯。将肠炎沙门氏菌RKI 05/07992(S.E.，肠道沙门氏菌属肠道型肠炎，C8酯酶阳性)在营养肉汤(5g/L蛋白胨，5g/L NaCl，2g/L酵母提取物，1g/L酵母提取物，pH 7.4)中培养16h，然后在无菌生理盐水(0.9％NaCl)中连续稀释。将经稀释的细胞悬浮液以1:100(v/v)接种在包含含有0.1mMD-荧光素-6-O-苯基-辛酸酯的营养肉汤的试管中。在37℃和150rpm下培养6.5h之后，将样品(50μL)从培养物中取出并且在微量滴定板中与0.2mL荧光素酶分析混合物(实施例9中描述的组合物)混合。不需要使用例如十二烷基三甲基溴化铵等细胞裂解试剂(数据未示出)。用装配有发光检测系统的平板酶标仪来记录发光。比较了在添加荧光素酶分析混合物后前3min的平均RLU(相对光单位)值(表VII)。

结论：在类似的肠道沙门氏菌浓度下，与D-荧光素-6-O-辛酸酯相比，使用化合物IIa达到的信噪比高9至170倍，有利于降低检测限(参见实施例2)。

将大肠杆菌ATCC 25922在营养肉汤(5g/L蛋白胨，5g/L NaCl，2g/L酵母提取物，1g/L酵母提取物，pH 7.4)中培养16h。通过离心(13000×g，2min)将细胞从培养物上清液中分离。从在水中的100倍浓缩的储备溶液将不同浓度的葡萄糖添加至培养物上清液中，将类似量的水添加至阴性对照。第二阴性对照也包含5mM葡萄糖，但是不包含葡萄糖氧化酶。将含有和不含有葡萄糖的培养物上清液(0.1mL)在白色微量滴定板中与包含40μM化合物VIa(与过氧化氢反应)和1mg/mL商购可得的来自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶的0.1mL的HEPES缓冲液(100mM，pH 7.0)混合。用SpectraMAx M5平板酶标仪来记录发光的经时过程20min，结果在图5(将由过氧化氢引发化学发光的底物化合物VIa与葡萄糖氧化酶(GOX)组合使用来直接在大肠杆菌培养物上清液中检测葡萄糖)中示出。当还存在化合物VIa和葡萄糖氧化酶时，葡萄糖的存在导致发光持续增加。增加的速率与葡萄糖浓度呈正相关。

结论：当将化合物VIa或相关化合物与适当的释放过氧化氢的酶(例如氧化酶)组合使用时，可以通过化学发光直接在微生物培养物的上清液中检测生长底物和代谢产物例如葡萄糖。

分别在补充有8mg/L和4mg/mL亚胺培南的胰酪胨大豆琼脂(trypticase soyagar)上培养碳青霉烯耐药性细菌菌株铜绿假单胞菌RKI 48/09(IMP-2)(P.a.-Imp

结论：可以通过将化合物VIIa添加至培养物样品并且记录发光来将碳青霉烯耐药性细菌与碳青霉烯敏感性细菌相区分。

包含不同取代基R

已经在pH为7.4的PBS缓冲溶液(10％DMSO)[1μM]中测定了化合物A、化合物B和化合物C的化学发光动力学曲线以及总发光。

化合物A：

化合物A、B和C表示在R

在图6A(插图：前2小时的放大图)中比较化合物A和B的化学发光动力学曲线；在图6B中比较化合物A和B的总发光。

在图7A中比较化合物A和C的化学发光动力学曲线；在图7B中比较化合物A和C的总发光。

完整全部详细技术资料下载

该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：D·沙巴特;M·E·罗斯康福特;N·哈纳尼亚;O·格林;U·斯皮茨;L·威克;J·伊森;R·沃伯格;R·柯瑞彪;Z·巴贾科娃;姚春妍;
专利申请人：尼米斯技术公司;拉莫特特拉维夫大学有限公司;