抗甲状腺激素(T4)重组抗体或抗原结合片段
文献发布时间：2023-06-19 09:29:07
发明领域
本发明涉及抗体、抗原结合片段和免疫诊断的领域。特别地，本发明涉及用于结合甲状腺激素T4(甲状腺素)和卤代双酚A的重组抗体或抗原结合片段。并且，本发明涉及包括编码本发明的重组抗体或抗原结合片段的核苷酸序列的分离的核酸分子，以及包括本发明的核酸分子的表达载体和宿主细胞。此外，本发明涉及生产用于结合T4甲状腺激素和卤代双酚A的重组抗体或抗原结合片段的方法，包括本发明的重组抗体或抗原结合片段的测试试剂盒和免疫测定，以及用于确定受试者的样品中T4甲状腺激素和/或卤代双酚A水平的方法。此外进一步的，本发明涉及处理样品的方法，例如用于从样品中富集卤代双酚A的基于免疫亲和性的样品制备方法。
背景技术
甲状腺激素在分化、生长和代谢中起着重要作用。甲状腺激素、三碘甲状腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4)由甲状腺产生。T4的前体是在甲状腺中表达的甲状腺球蛋白的酪氨酸氨基酸。酪氨酸氨基酸与碘结合，两个碘化酪氨酸缀合并随后从甲状腺球蛋白中裂解出来。T4被靶细胞内的脱碘酶进一步转化为T3。T4-激素和T3-激素之间的区别仅仅是一个碘原子。
T4是血清中占主导地位的甲状腺激素，其浓度比T3高约40倍(分别为90nM和2nM)。血清中仅0.03％的总T4(10-25pM)和0.3％的T3(4.0-8.0pM)以非结合形式进入细胞并具有生物活性(Yen,P.M.Physiological Reviews(2001)81:1097-1142)。
目前，用于从血清中分析T4的常用测试是放射免疫测定(RIA)。游离T4的确定是用于筛查潜在甲状腺功能障碍的重要手段。当得到异常值时，则进行更彻底的诊断以明确甲状腺功能障碍的原因(游离和结合的T4、T3、TSH和自身抗体)。在一些疾患中，产生增加的量的T3，而T4水平是正常的。因此，进行多路诊断对全面了解甲状腺功能是重要的。
T4比T3多一个碘。最重要的甲状腺激素之间的这个微小差异使得发现针对T3或T4的特异性抗体非常具有挑战性。另外，甲状腺激素T3和T4均相对较小且是疏水性的。
一些商业抗体产品，无论是多克隆的还是单克隆的，都可用于甲状腺激素。并且，一些专利申请涉及甲状腺激素抗体。例如JP2010178649(A)描述了一种抗甲状腺素抗体，该抗体包括特异性重链可变区(V
此外，为了确定生物样品中的甲状腺激素T4，需要对T4有特别高亲和性的抗体或抗原结合片段。
发明内容
本发明涉及用于快速且可靠地检测T4甲状腺激素的新型试剂。并且，本发明涉及用于快速且可靠地检测卤代双酚A的新型试剂。
本发明揭示了能够结合甲状腺激素和卤代双酚A的抗体或抗原结合片段的令人惊讶的结合特性。事实上，本发明涉及能够以高亲和性结合甲状腺激素T4并且能够卤素依赖性结合至卤代双酚A的重组抗体或抗原结合片段。
本发明的一个令人惊讶的优点包括，当使用高亲和性抗T4抗体时，人类中观察到的卤代双酚A的水平不会干扰免疫测定。然而，本发明的T4甲状腺激素结合抗体或抗原结合片段对卤代双酚A的交叉反应性使得可以使用相同的抗体对来自例如生物样品、环境样品或食物样品的卤代双酚A进行测量和/或样品制备。交叉反应性还提供了有效的手段，用于评估对甲状腺激素系统有影响的有机分子的内分泌干扰物潜能。
本发明涉及用于结合T4甲状腺激素和卤代双酚A的重组抗体或抗原结合片段(例如分离的抗体或抗原结合片段)。
并且，本发明涉及包括编码本发明的重组抗体或抗原结合片段的核苷酸序列的分离的(重组)核酸分子。
并且，本发明涉及包括本发明的核酸分子的表达载体。
此外，本发明涉及包括本发明的核酸分子或表达载体的宿主细胞。
另外，本发明涉及生产本发明的用于结合T4甲状腺激素和卤代双酚A(例如三碘双酚或四卤双酚A)的重组抗体或抗原结合片段的方法，其中所述方法包括将本发明的表达载体引入宿主细胞中并在允许产生所述抗体或抗原结合片段的条件下生长细胞。
另外，本发明涉及包括本发明的重组抗体或抗原结合片段的测试试剂盒。并且，所述测试试剂盒用于检测样品中的T4甲状腺激素和/或卤代双酚A的用途在本发明的范围内。另外，包括本发明的重组抗体或抗原结合片段的试剂盒用于处理样品的用途在本发明的范围内。
还另外，本发明涉及用于确定样品中T4甲状腺激素和/或卤代双酚A一种或多种浓度的方法，其中所述方法包括允许本发明的重组抗体或抗原结合片段接触样品(诸如生物、环境或食物样品，或者受试者的样品)，并且之后分别确定所述样品中T4甲状腺激素和/或卤代双酚A的浓度。
还另外，本发明涉及用于处理(例如预处理)样品的方法，其中所述方法包括允许本发明的重组抗体或抗原结合片段接触样品(诸如生物样品、环境样品、材料样品或食物样品，或者受试者的样品)。
并且此外，本发明涉及包括本发明的重组抗体或抗原结合片段的免疫测定。
并且还另外，本发明涉及本发明的重组抗体或抗原结合片段或免疫测定用于筛查样品中存在的内分泌干扰物潜能(例如与甲状腺轴相关的内分泌干扰物潜能)的用途。
本发明的其他目的、细节和优点将从以下附图、具体实施方式和实施例中变得显而易见。
附图说明
图1a示出了T4 Fab轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7(在SEQ IDNO:7中，每个DNA密码子NNN独立地选自由DNA密码子TAC、TAT、TTT和TTC组成的组))。
图1b示出了T4 Fab重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8(在SEQ IDNO:8中，每个DNA密码子NNN独立地选自由DNA密码子TAC、TAT、TTT和TTC组成的组))。
图2a示出了T4 Fab轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5(在SEQ IDNO:5中，每个X独立地为Y(酪氨酸)或F(苯丙氨酸)))。CDR区以粗体标记。示出了每个免疫球蛋白链的三个互补区LCDR1(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸24-33，根据Kabat氨基酸24-34)、LCDR2(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸49-55，根据Kabat氨基酸50-56)和LCDR3(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸88-96，根据Kabat 89-97)。
图2b示出了T4 Fab重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6(在SEQ IDNO:6中，每个X独立地为Y(酪氨酸)或F(苯丙氨酸))。CDR区以粗体标记。示出了每个免疫球蛋白链的三个互补区HCDR1(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸31-35，根据Kabat氨基酸31-35)、HCDR2(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸50-66，根据Kabat氨基酸50-65)和HCDR3(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸99-113，根据Kabat氨基酸95-102)。
图3a示出了T4 Fab轻链的氨基酸序列(根据SEQ ID NO:3)。CDR区是加下划线的，且鉴定出了负责T4结合的氨基酸(至少Y93)。
图3b示出了T4 Fab重链的氨基酸序列(根据SEQ ID NO:4)。CDR区是加下划线的，且鉴定出了负责T4结合的氨基酸(至少Y33、Y107、Y109和/或M111，或其任何组合)。
图4示出了通过表面等离子体共振(SPR)确定的T4 Fab的亲和性和特异性数据。将T4-碱性磷酸酶固定在传感器表面，并通过抑制测定法确定Kd值。
图5揭示了L-甲状腺素的ELISA测定的结果。
图6揭示了四碘双酚A的ELISA测定的结果。
图7揭示了四溴双酚A的ELISA测定的结果。
图8揭示了四氯双酚A的ELISA测定的结果。
图9揭示了双酚A的ELISA测定的结果。
图10a揭示了T4和TIBPA配体和抗T4 Fab的原子之间的原子间距离最高达
图10b揭示了负责卤素键合的原子间距离。图10b_1示出了抗T4 Fab和T4的结构中的相关卤素键。A)I5’···CD2距离为
图11a示出了晶体结构的T4 Fab片段的可变结构域。L-链是深灰色的，H-链是浅灰色的。结合的T4分子示出为棒状模型。标记了Fab片段的六个CDR环(L1、L2、L3、H1、H2和H3)。
图11b示出了T4 Fab片段与结合的T4分子的结合槽。参与T4结合的残基示出为棒状模型并进行标记。
序列表
本发明的抗T4甲状腺激素抗体(例如T4)或抗原结合片段的序列或部分序列
SEQ ID NO:1:T4 Fab轻链核苷酸序列
SEQ ID NO:2:T4 Fab重链核苷酸序列
SEQ ID NO:3:T4 Fab轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:4:T4 Fab重链氨基酸序列
SEQ ID NO:5:T4 Fab轻链氨基酸序列(其中每个X独立地是Y或F)
SEQ ID NO:6:T4 Fab重链氨基酸序列(其中每个X独立地是Y或F)
SEQ ID NO:7:T4 Fab轻链核苷酸序列(其中每个DNA密码子nnn独立地选自由DNA密码子TAC、TAT、TTT和TTC组成的组)
SEQ ID NO:8:T4 Fab重链核苷酸序列(其中每个DNA密码子nnn独立地选自由DNA密码子TAC、TAT、TTT和TTC组成的组)
具体实施方式
在本发明的一种实施方式中，本发明的重组抗体或抗原结合片段结合(例如特异性地)T4甲状腺激素。
甲状腺素(3,5,3',5'-四碘甲状腺素)或T4甲状腺激素属于甲状腺激素的组(T
T4是用于诊断甲状腺功能的最常见的测量的甲状腺激素。通过检测血液样品的T4水平来研究甲状腺功能。T4主要影响所有组织中的蛋白质合成和耗氧量，但其对生长、发育和性成熟也很重要。已经在例如患有由于格雷夫氏(Grave’s)病或普卢默氏(Plummer’s)病或者急性或亚急性甲状腺炎而经受甲状腺功能亢进的患者的样品中发现了T4水平增加。低水平的T4已经与先天性甲状腺功能减退症、黏液性水肿、慢性甲状腺炎和一些慢性遗传异常相关联。
T4可以被测量为游离T4，其是身体中T4活性的指标。游离T4指数与总T4乘以甲状腺激素摄入有关，其反过来是未结合的T4结合球蛋白的测量。在本发明的一种实施方式中，T4被测量为游离T4，例如通过利用传感器。T4还可以被测量为总T4，其取决于与T4结合球蛋白结合的T4。在本发明的一种实施方式中，T4被测量为总T4，例如通过利用免疫测定(诸如ELISA或RIA)或传感器或本领域技术人员已知的任何适合的方法。
在本发明的一种实施方式中，本发明的重组抗体或抗原结合片段结合(例如特异性地)卤代双酚A。
双酚A及其卤代类似物是常用的工业化学品，在许多生物体中具有强毒理学效应。BPA被用来制造某些塑料和环氧树脂。双酚A是一种有机合成化合物，其化学式为(CH
双酚A具有下式I：
如本文所用，“卤代双酚A”是指已经被1个或更多个卤素(例如一、二、三、四、五或六个卤素，例如1-4个卤素取代基)卤代的双酚A。在非常特定的实施方式中，卤代双酚A是三碘双酚A或四卤双酚A。卤代双酚A中的一个或多个卤素独立地选自由氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)组成的组。在非常特定的实施方式中，双酚A被碘、溴、氯或其组合卤代。在本发明的其他非常特定的实施方式中，卤代双酚A包括1、2、3或4个碘、溴或氯取代基。
在一种实施方式中，双酚A衍生物具有下式II：
其中，双酚A已经在一个或多个位置X
在本发明的一种实施方式中，同时检测T4甲状腺激素和卤代双酚A。
如本文所用，“抗体或抗原结合片段”是指能够结合T4甲状腺激素的任何抗体或其片段。该术语包括例如具有所需的生物活性的任何片段或单链抗体(例如Fab、scFv)。例如，任何互补决定区、重链可变区、轻链可变区以及它们的任何组合都包括在“抗原结合片段”的范围内。在本上下文中所使用的“片段”是指多肽或蛋白质的任何部分。
如本文所用，“抗体”是指由免疫细胞或通过重组技术产生的对抗原有响应的多肽或蛋白质。抗体是一种免疫球蛋白分子，并且它可以属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD中的任一类；IgG和IgM是最常使用的。如本文所用，“结合多肽”是指与感兴趣的抗原结合的多肽。在一些实施方式中，结合多肽可能抑制或压抑感兴趣的抗原(多肽、蛋白质、多糖)的功能。
在抗体中，β链之间的可变环，每条轻(V
在分子水平上，抗原可以通过其与抗体的可变Fab区或抗原结合片段结合的能力来表征。如本文所用，“配体”是例如与抗T4抗体Fab或scFv形成复合物的分子。
“Fv”(可变结构域)是指负责配体结合的免疫球蛋白分子的可变区。“单链Fv片段(scFv)”是指包括在由单一mRNA分子合成的单一多肽中通过接头连接的免疫球蛋白分子的V
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括恒定区，该恒定区对应于人类或非人类恒定区。在其他实施方式中，重组抗体或抗原结合片段的可变区的至少部分对应于人类或非人类可变区。
如本文所用，“Fab片段”(抗原结合片段)是指抗体的区，其由免疫球蛋白轻链的可变和恒定结构域通过二硫键桥共价连接到免疫球蛋白重链的可变和第一恒定结构域组成。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括选自由以下组成的组的一个或多个(例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个)互补决定区(CDR)的氨基酸：
轻链区1，包括对应于SEQ ID NO:3的氨基酸24-33的氨基酸，
轻链区2，包括对应于SEQ ID NO:3的氨基酸49-55的氨基酸，
轻链区3，包括对应于SEQ ID NO:3的氨基酸88-96的氨基酸，
重链区1，包括对应于SEQ ID NO:4的氨基酸31-35的氨基酸，
重链区2，包括对应于SEQ ID NO:4的氨基酸50-66的氨基酸，以
及
重链区3，包括对应于SEQ ID NO:4的氨基酸99-113的氨基酸。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括选自由以下组成的组的一个或多个(例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个)互补决定区(CDR)的氨基酸：
轻链区1，包括对应于SEQ ID NO:5的氨基酸24-33的氨基酸，
轻链区2，包括对应于SEQ ID NO:5的氨基酸49-55的氨基酸，
轻链区3，包括对应于SEQ ID NO:5的氨基酸88-96的氨基酸，
重链区1，包括对应于SEQ ID NO:6的氨基酸31-35的氨基酸，
重链区2，包括对应于SEQ ID NO:6的氨基酸50-66的氨基酸，以
及
重链区3，包括对应于SEQ ID NO:6的氨基酸99-113的氨基酸。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括含有如在SEQ ID NO:4的氨基酸99-113中列出的CDR3的重链可变结构域氨基酸序列。在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括含有如在SEQ ID NO:6的氨基酸99-113中列出的CDR3的重链可变结构域氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括含有如在SEQ ID NO:4的氨基酸99-113中列出的CDR3以及如在SEQ ID NO:4的氨基酸50-66中列出的CDR2或如在SEQ ID NO:4的氨基酸31-35中列出的CDR1的重链可变结构域氨基酸序列。在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括含有如在SEQ ID NO:6的氨基酸99-113中列出的CDR3以及如在SEQ ID NO:6的氨基酸50-66中列出的CDR2或如在SEQ ID NO:6的氨基酸31-35中列出的CDR1的重链可变结构域氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括含有如在SEQ ID NO:4的氨基酸31-35中列出的CDR1、如在SEQ ID NO:4的氨基酸50-66中列出的CDR2以及如在SEQ ID NO:4的氨基酸99-113中列出的CDR3的重链可变结构域氨基酸序列。在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括含有如在SEQ ID NO:6的氨基酸31-35中列出的CDR1、如在SEQ ID NO:6的氨基酸50-66中列出的CDR2以及如在SEQ ID NO:6的氨基酸99-113中列出的CDR3的重链可变结构域氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括：
含有如在SEQ ID NO:4的氨基酸31-35中列出的CDR1、如在SEQ ID NO:4的氨基酸50-66中列出的CDR2以及如在SEQ ID NO:4的氨基酸99-113中列出的CDR3的重链可变结构域氨基酸序列；以及
含有如在SEQ ID NO:3的氨基酸88-96中列出的CDR3的轻链可变结构域氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括：
含有如在SEQ ID NO:6的氨基酸31-35中列出的CDR1、如在SEQ ID NO:6的氨基酸50-66中列出的CDR2以及如在SEQ ID NO:6的氨基酸99-113中列出的CDR3的重链可变结构域氨基酸序列；以及
含有如在SEQ ID NO:5的氨基酸88-96中列出的CDR3的轻链可变结构域氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括：
含有如在SEQ ID NO:4的氨基酸31-35中列出的CDR1、如在SEQ ID NO:4的氨基酸50-66中列出的CDR2以及如在SEQ ID NO:4的氨基酸99-113中列出的CDR3的重链可变结构域氨基酸序列；以及
含有如在SEQ ID NO:3的氨基酸88-96中列出的CDR3以及如氨基酸24-33中列出的CDR1或如在SEQ ID NO:3的氨基酸49-55中列出的CDR2的轻链可变结构域氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括：
含有如在SEQ ID NO:6的氨基酸31-35中列出的CDR1、如在SEQ ID NO:6的氨基酸50-66中列出的CDR2以及如在SEQ ID NO:6的氨基酸99-113中列出的CDR3的重链可变结构域氨基酸序列；以及
含有如在SEQ ID NO:5的氨基酸88-96中列出的CDR3以及如氨基酸24-33中列出的CDR1或如在SEQ ID NO:5的氨基酸49-55中列出的CDR2的轻链可变结构域氨基酸序列。
在本发明的特定实施方式中，抗体或抗原结合片段包括含有分别对应于SEQ IDNo:3的氨基酸24-33、49-55和88-96的氨基酸或由其组成的轻链CDR 1-3，以及含有分别对应于SEQ ID No:4的氨基酸31-35、50-66和99-113的氨基酸或由其组成的重链CDR 1-3。在本发明的特定实施方式中，抗体或抗原结合片段包括含有分别对应于SEQ ID No:5的氨基酸24-33、49-55和88-96的氨基酸或由其组成的轻链CDR 1-3，以及含有分别对应于SEQ IDNo:6的氨基酸31-35、50-66和99-113的氨基酸或由其组成的重链CDR 1-3。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括以下或由以下组成：含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成的轻链，和/或含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成的重链。在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括以下或由以下组成：含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成的轻链，和/或含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成的重链。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段的重链可变区(V
在本发明的一种实施方式中，对应于图10A和/或图3A-B中呈现的氨基酸残基的重组抗体或抗原结合片段的一个或多个氨基酸负责结合T4和/或卤代双酚A。在本发明的一种实施方式中，至少对应于SEQ ID NO:3中限定的Y93和/或对应于SEQ ID NO:4中限定的氨基酸Y33、Y107、Y109和M111的重组抗体或抗原结合片段的一个或多个氨基酸负责结合T4(参见例如图3A和B)。在特定的实施方式中，至少对应于SEQ ID NO:3中限定的轻链的氨基酸Y93的重组抗体或抗原结合片段的氨基酸，和/或至少对应于SEQ ID NO:4中限定的重链的氨基酸Y33、Y107、Y109和M111的重组抗体或抗原结合片段的氨基酸结合T4。替代地或除了上述Y93、Y33、Y107、Y109和M111中的任一个之外，对应于例如SEQ ID NO:4中限定的重链的D100、A50、N52、S57、Y59和/或L47和/或SEQ ID NO:3中限定的轻链的L95的重组抗体或抗原结合片段的氨基酸可以负责结合T4和/或卤代双酚A。
在本发明的一种实施方式中，至少对应于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中限定的Y93或F93，和/或对应于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中限定的氨基酸Y33、F33、Y107、F107、Y109、F109和M111的重组抗体或抗原结合片段的一个或多个氨基酸负责结合T4(参见例如图10A、图2A和B或者图3A和B)。在特定的实施方式中，至少对应于SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5中限定的轻链的氨基酸Y93或F93的重组抗体或抗原结合片段的氨基酸，和/或至少对应于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中限定的重链的氨基酸Y33、F33、Y107、F107、Y109、F109和M111的重组抗体或抗原结合片段的氨基酸结合T4。替代地或除了上述Y93、F93、Y33、F33、Y107、F107、Y109、F109和M111中的任一个之外，对应于例如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中限定的重链的D100、A50、N52、S57、Y59、F59和/或L47和/或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中限定的轻链的L95的重组抗体或抗原结合片段的氨基酸可以负责结合T4和/或卤代双酚A。
在本发明的一种实施方式中，对应于图10A或10B中呈现的一种或多种氨基酸残基的重组抗体或抗原结合片段的一个或多个氨基酸负责卤素结合。图10A中提到的任何酪氨酸(Y)都可以独立地用苯基丙氨酸(F)替代。在一种实施方式中，负责卤素结合的重组抗体或抗原结合片段的氨基酸选自由以下组成的组：对应于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中限定的氨基酸的Y33、F33、Y107、F107、Y109、F109、M111、N52和S57以及对应于SEQ ID NO:3或SEQID NO:5中限定的氨基酸的L95以及Y93或F93。在本发明进一步的实施方式中，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中限定的重链的至少对应于氨基酸Y107或F107和M111，或至少对应于至少氨基酸Y33或F33、Y107或F107、Y109或F109和M111的氨基酸负责卤素结合。
在本发明的其他实施方式中，重组抗体或抗原结合片段包括与SEQ ID NO:3、4、5或6具有80-100％序列同一性的氨基酸序列，例如至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方式中，根据本发明的抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6，或与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:4具有80-100％序列同一性的氨基酸序列，例如至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在本发明进一步的实施方式中，编码本发明的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子包括与SEQ ID NO:1、2、7或8具有80-100％序列同一性的多核苷酸序列，例如至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在特定的实施方式中，编码本发明的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子包括与SEQ ID NO:1和2，或SEQ ID NO:7和8具有80-100％序列同一性的多核苷酸序列，例如至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段的轻链包括与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸1-109具有80-100％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的氨基酸序列，和/或重组抗体或抗原结合片段的重链包括与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸1-124具有80-100％(例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的氨基酸序列。
相比于本公开的序列的任何序列或其片段的同一性是指相比于本发明的整个序列的任何序列的同一性。如本文所用，两个序列之间的％同一性是序列共享的相同位置的数量的函数(即％同一性＝相同位置#/位置总#x 100)，考虑空位的数量以及每个空位的长度，这些需要被引入以进行两个序列的最佳比对。序列的比较和确定两个序列之间的同一性百分比可以使用现有技术中已有的数学算法来完成。这既适用于氨基酸序列，也适用于核酸序列。例如，可以通过使用BLAST(基本局部比对搜索工具)或FASTA(FAST-AII)来确定序列同一性。在搜索中，设置参数“空位罚分”和“矩阵”典型地被选择为默认值。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体是单克隆抗体或者抗原结合片段是单链Fv或Fab片段。在特定的实施方式中，抗原结合片段是包括选自由以下组成的组的一个或多个CDR的单链Fv或Fab片段：分别含有SEQ ID NO:3的氨基酸24-33、49-55和88-96的轻链CDR1-3，和分别含有SEQ ID NO:4的氨基酸31-35、50-66和99-113的重链CDR 1-3。在特定的实施方式中，抗原结合片段是包括选自由以下组成的组的一个或多个CDR的单链Fv或Fab片段：分别含有SEQ ID NO:5的氨基酸24-33、49-55和88-96的轻链CDR 1-3，和分别含有SEQID NO:6的氨基酸31-35、50-66和99-113的重链CDR 1-3。在更特定的实施方式中，单链Fv或Fab片段包括SEQ ID NO:3和/或4、SEQ ID NO:5和/或6、SEQ ID NO:3和/或6或者SEQ IDNO:5和/或4的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的非常特定的实施方式中，抗体或抗原结合片段的轻链是卡帕(κ)型链。
在本发明的特定的实施方式中，抗体或抗原结合片段是融合多肽，即可已经与例如任何其他片段或多核苷酸融合(例如通过基因工程)以形成融合多肽。适合的融合配偶体的实例包括本领域技术人员已知的任何常规融合配偶体，例如包括但不限于碱性磷酸酶、疏水蛋白和适合功能化的任何肽。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段与人类或动物T4甲状腺激素结合。事实上，重组抗体或抗原结合片段能够识别T4甲状腺激素的表位。
在本发明的一种实施方式中，重组抗体或抗原结合片段对T4甲状腺激素具有800pM或更小(例如10-800pM或30-600pM或200-530pM，或者600pM或更小，或者530pM或更小)的亲和性(例如当通过竞争ELISA和/或SPR传感器测量时，例如，如文章Tullila andNevanen 2017,International Journal of Molecular Sciences 18(6),1169中所述)。在其他实施方式中，重组抗体或抗原结合片段对卤代双酚A具有800nM或更小(例如10-800nM、30-600nM或37-558nM，或者600nM或更小，或者558nM或更小)的亲和性(例如取决于卤素(碘、溴或氯))(例如当通过竞争ELISA和/或SPR传感器测量时，例如，如文章Tullila andNevanen,2017,International Journal of Molecular Sciences 18(6),1169中所述)。在本发明进一步的实施方式中，重组抗体或抗原结合片段对T4甲状腺激素具有800pM或更小(例如10-800pM或30-600pM或200-530pM，或者600pM或更小，或者530pM或更小)的亲和性，并且对卤代双酚A具有800nM或更小(例如10-800nM、30-600nM或37-558nM，或者600nM或更小，或者558nM或更小)的亲和性，取决于卤素(碘、溴或氯)。在本发明的非常特定的实施方式中，亲和性通过利用抑制方法(例如通过利用Biacore 200T设备)来测量，例如，如Tullila和Nevanen的文章(2017,International Journal of Molecular Sciences18(6),1169)中所述。在非常特定的实施方式中，重组抗体或抗原结合片段的KD值如下：T4小于0.6+/-0.04nM(例如，0.53+/-0.04nM)，卤代双酚A小于560+/-0.04nM、小于70+/-1.9nM或小于40+/-1.8nM(例如，四碘双酚A(TIBPA)小于40+/-1.8nM(例如，37.3+/-21nM)，四溴双酚A(TBBPA)小于70+/-1.9nM(例如，69.2+/-1.9nM)和/或四氯双酚A(TCBPA)小于560+/-21nM(例如，558+/-21nM))。在本发明的一种实施方式中，KD通过竞争ELISA和/或SPR传感器测量，例如，如Tullila和Nevanen的文章(2017,International Journal of MolecularSciences 18(6),1169)中所述，或通过利用Biacore 200T设备测量，例如，如Tullila和Nevanen的文章(2017,International Journal of Molecular Sciences 18(6),1169)中所述。
在一种实施方式中，本发明的重组抗体或抗原结合片段对T3和/或T2具有交叉反应性。在非常特定的实施方式中，重组抗体或抗原结合片段的KD值如下：T3 30+/-0.4nM或更小，25+/-0.4nM或更小，或21+/-0.4nM或更小(例如，20.8+/-0.4nM)和/或T2 1850+/-21nM或更小(例如，1810+/-21nM)。在本发明的非常特定的实施方式中，交叉反应性通过利用抑制方法(例如，Biacore 200T设备)来测量，例如，如Tullila和Nevanen的文章(2017,International Journal of Molecular Sciences 18(6),1169)中所述。如本文所用，“交叉反应性”是指抗体或抗原结合片段与除了对所述抗体或抗原结合片段特异性最强的抗原(T4)之外的抗原之间的反应。事实上，交叉反应性测量了不同抗原对抗体或抗原结合片段表现相似的程度。
在本发明的一些实施方式中，抗体或抗原结合区(例如，单链Fv或Fab片段)能够结合T4甲状腺激素，其相对IC
本发明的优点是至少高亲和性和独特特异性。在一种实施方式中，“高亲和性”是指对T4甲状腺激素的亲和性为800pM或更小(更具体地，例如600pM或更小，或者530pM或更小)(例如，当通过利用抑制方法(Biacore T200设备)测量时，例如，如本公开前面所述的Tullila和Nevanen(2017)的文章中所述。如本文所用，“特异性”是指揭示本发明的重组抗体或抗原结合片段如何能够相对于其他甲状腺激素和卤代双酚A(例如，四卤双酚A)检测感兴趣的靶分子(即T4)的程度。如本文所用，“独特特异性”是指本发明的特定的特异性值，例如，当通过利用抑制方法(Biacore T200)测量时，例如，如Tullila和Nevanen(2017)的文章中所述。在本发明的非常特定的实施方式中，重组抗体或抗原结合片段对T4甲状腺激素具有800pM或更小(例如，10-800pM或30-600pM或200-530pM，或者600pM或更小，或者530pM或更小)的亲和性；并且具有对T3或T2的交叉反应性，其KD值T3 30+/-0.4nM或更小，和/或T21850+/-21nM或更小；或者能够以相对IC
哺乳动物细胞系是用于生产重组抗体的广泛使用的表达系统。细菌、酵母、丝状真菌、植物细胞和昆虫细胞也可用于生产重组抗体，以便在糖基化模式不起关键作用的情况下(例如，在体外诊断中)降低生产成本。因此，包括编码抗体或抗原结合片段的重组核酸分子的宿主细胞或者包括该重组核酸分子的表达载体不限于但可选自例如由真核或原核细胞、细菌、酵母、丝状真菌以及动物、人类、哺乳动物、植物和昆虫细胞系组成的组。它甚至可以是杂交瘤细胞，其在转化后产生重组单克隆抗体。
重组抗体或抗原结合片段可以例如通过使用在体外细胞系中表达的基因工程化基因或通过基于传统杂交瘤的技术来开发。重组抗体或抗原结合片段还可以通过合成产生。所有这些用于生产重组抗体的技术都是本领域技术人员已知的，并且描述在描述实验室分子技术的实用手册和指南中。生产抗体或抗原结合片段中的重组技术能够在每个制造批次中产生相同的抗体。此外，该制造工艺提供了高纯度和超低批次间的可变性。
在本发明的一种实施方式中，生产用于结合T4甲状腺激素的重组抗体或抗原结合片段的方法包括：将包括编码本发明的抗体或抗原结合片段的核酸分子的表达载体引入宿主细胞中，并且在允许产生抗体或抗原结合片段的条件下生长细胞，并且任选地进一步回收所产生的抗体或抗原结合片段。
重组抗体或抗原结合片段文库通常是表达文库，其典型地是噬菌体展示文库。展示重组抗体或抗原结合片段文库的一般原理是，它们将抗原结合片段作为融合蛋白呈现在表面上，其可以是微生物细胞(诸如酵母或细菌细胞)或者噬菌体的表面。展示重组文库也可以是展示文库，其中在体外表达系统中产生初生蛋白和mRNA的稳定复合物。噬菌体展示是用于抗体文库的最常用的展示方法。从重组噬菌体展示抗体文库中方便地查找抗体或抗原结合片段。
噬菌体展示抗体文库可以通过编码DNA到适当的噬菌体展示载体中的抗体片段来构建。
编码数百万个抗体片段的变体的DNA被批量克隆到载体中，作为噬菌体外壳蛋白的一部分。通过将载体转化至细菌可以获得包含数百万个具有不同特异性的抗体片段的大型文库。细菌的培养导致在噬菌体表面上展示抗体片段的噬菌体的表达。所展示的抗体的基因携带在封装在噬菌体内的噬粒质粒中，从而将基因型与表型连接。所展示的蛋白质与其DNA之间的物理连接允许通过一种被称为淘选(淘洗/淘筛)的简单在体外选择程序筛选大量的蛋白质变体，每个都与其相应的DNA连接。
按其最简单的方式，淘选可以通过以下来进行：将展示变体的噬菌体的池与已经固定在载体上的感兴趣的抗原或配体一起孵育，洗掉未结合的噬菌体，并通过破坏与配体的结合来洗脱特异性结合的噬菌体。然后，在体内扩增洗脱的噬菌体。
重复该工艺几次，得到有利于最紧密结合的序列的逐步富集的噬菌体池。在约3至6轮选择之后，接下来对单个抗体克隆进行筛选测定，对最佳克隆进行测序并检查结合物的多样性。
本发明涉及新型T4甲状腺激素特异性重组抗体。当与常规的单克隆抗体和多克隆抗体相比时，重组抗体的优点包括减小的尺寸、有效的固定化和廉价的细菌生产。
抗体文库能够体外选择新型抗体。抗体文库可包含约10
根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(1977)》(BudapestTreaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms forthe Purposes of Patent Procedure,1977)，包含抗体的菌株的子类已经保藏在VTT培养物保藏，P.O.Box 1000,FI-02044VTT，芬兰(http://culturecollection.vtt.fi)，具有以下代码(E-编号)：T4 Fab/pKKtac/RV308；VTT E-173550。
本发明还涉及用于甲状腺激素(T4)(特异性)和/或卤代双酚A(特异性)抗体的快速且简单的测定以及各种诊断平台和传感器中的免疫测定。本发明的一方面涉及包括本发明的重组抗体或抗原结合片段的免疫测定。此外，本发明涉及所述免疫测定用于本发明的方法，即用于确定样品中T4甲状腺激素和/或卤代双酚A浓度的方法。在本发明的一种实施方式中，所述免疫测定进一步包括用于执行所述免疫测定所必需的额外试剂和/或执行所述免疫测定的说明书。在一种实施方式中，免疫测定包括用于执行免疫测定所必需的试剂，诸如选自由反应溶液、缓冲液、洗涤溶液和检测手段诸如标记(例如酶标记)组成的组中的一种或多种。
任选地，本发明的免疫测定中还可包括揭示特异性T4甲状腺激素和/或卤代双酚A水平或浓度的对照样品(例如，阳性或阴性对照样品)或参考水平。并且，免疫测定中可以任选地包括质量控制。在特定的实施方式中，免疫测定包括用于进行确定样品的T4甲状腺激素和/或卤代双酚A浓度的免疫测定的说明书。
在一种实施方式中，免疫测定是竞争性或非竞争性免疫测定。在其他实施方式中，用于确定T4甲状腺激素和/或卤代双酚A浓度的方法包括或为竞争性或非竞争性免疫测定。竞争性免疫测定包括同质性(例如荧光极化测定)和异质性(例如竞争性ELISA)免疫测定。在竞争性免疫测定中，样品中未标记的分析物与标记的分析物竞争以结合抗体或抗原结合片段。然后，测量标记的未结合的分析物的量。样品中存在的分析物越多，检测到的标记的分析物就越少。如本文所用，“非竞争性免疫测定”是指例如免疫复合物测定(Pulli,
本发明中任选地使用的一种或多种标记可以是任何常规标记，诸如放射性标记、酶、核苷酸序列或荧光化合物。免疫测定不限于但可以选自例如由ELISA、免疫PCR或FIA组成的组。在一种实施方式中，用于T4甲状腺激素和/或卤代双酚A的免疫测定可以是例如微量滴定孔中常规的夹心测试或侧流式测试。在其他实施方式中，本发明中包括的抗体、抗原结合片段和/或其任何工程化版本用于基于免疫测定的传感器中。此外，任何其他测定类型，诸如凝集测试、侧流式测试、毛细管电泳、抗体阵列、悬臂(cantiliver)和/或微流体测定系统或者它们的任何组合，都可应用于本发明。事实上，用于确定T4甲状腺激素和/或卤代双酚A浓度的方法可包括使用所述(免疫)测定中的一种或多种。
本发明的方法或免疫测定的检测模式可以是任何常规的检测模式，包括但不限于比色、荧光、顺磁、电化学或无标记(例如，表面等离子体共振和石英晶体微天平)检测模式。
在用于确定样品中T4甲状腺激素和/或卤代双酚A浓度的本发明的方法中，使重组抗体或抗原结合片段与样品接触，例如在上述免疫测定中。样品中T4甲状腺激素和/或卤代双酚A的水平或量的确定可以例如基于比色、荧光、顺磁、电化学或无标记(例如，表面等离子体共振和石英晶体微天平)的检测模式来进行。任选地，确定还可包括使用本领域技术人员已知的任何适合的统计方法。
本发明还涉及包括本发明的重组抗体或抗原结合片段的测试试剂盒。并且，本发明涉及所述测试试剂盒用于本发明的方法。在本发明的一种实施方式中，测试试剂盒可以进一步包括用于执行测试的一种或多种试剂，以及任选地用于使用或执行测试的说明书。在一种实施方式中，测试试剂盒包括选自由反应溶液、缓冲液、洗涤溶液和检测手段诸如标记和荧光计组成的组中的一种或多种试剂。在本发明的特定实施方式中，测试试剂盒包括至少酶标记。在一种实施方式中，所述测试试剂盒是免疫测定试剂盒，并且在进一步的实施方式中，所述免疫测定是竞争性或非竞争性免疫测定。在非常特定的实施方式中，测试试剂盒包括用于执行所述免疫测定的试剂和/或用于执行所述免疫测定的说明书。
在特定的实施方式中，包括在免疫测定或测试试剂盒中的抗体或抗原结合片段包括抗体轻链和重链的互补决定区(CDR)，其中，所述轻链CDR区包括或具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸24-33、49-55和88-96的氨基酸序列，并且所述重链CDR区具有SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸31-35、50-66和99-113的氨基酸序列。
任选地，本发明中还可以利用揭示特异性T4甲状腺激素和/或卤代双酚A水平的对照样品(例如，阳性或阴性对照样品)或参考水平。并且，测试试剂盒中可以任选地包括质量控制。在特定的实施方式中，测试试剂盒包括用于进行确定样品的T4甲状腺激素和/或卤代双酚浓度的方法的说明书。
测定或测试的执行可以是使得试剂(至少抗体或抗原结合片段)在微量滴定板的孔中预先干燥，并将至少一种样品的稀释系列加入至孔中。在这样的情况下，测试试剂盒可以包括物理上彼此分离的多种试剂对，例如以微阵列的形式，从而可以从样品中同时测试多种抗原。本发明的测定或测试试剂盒也可应用于大量样品的高通量测定。
在特定的实施方式中，本发明可以应用于例如临床人类或动物样品中的T4甲状腺激素和/或卤代双酚A的快速诊断。如本文所用，“快速诊断”是指至少免疫测定(诸如ELISA)、侧流式测定、传感器解决方案和技术人员已知的且允许的类似应用。
在一种实施方式中，在体外从样品诸如从受试者获得的样品或任何生物样品中确定T4甲状腺激素和/或卤代双酚A水平。在本发明的一种实施方式中，样品是生物样品、环境样品、材料样品或食物样品，或者受试者的样品。在本发明的一种实施方式中，受试者是人类或动物、儿童、青少年或成年。并且，任何动物，诸如宠物、家畜或生产动物，可以是本发明的受试者。从受试者获得的样品包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、眼泪、汗液、分泌物、活体组织检查或组织的样品。
在一种实施方式中，本发明的重组抗体、抗原结合片段或免疫测定可用于筛查样品中存在的与甲状腺轴相关的内分泌干扰物潜能。如本文所用，“甲状腺轴”是指神经内分泌系统的一部分，且顾名思义，它取决于甲状腺。甲状腺轴调节发育、能量代谢和生长，并且该轴通过主要由下丘脑促甲状腺素释放激素(TRH)和垂体促甲状腺激素(TSH)介导的复杂的中枢和外周信号来控制。
在将人类或动物归类为适合根据本发明确定T4甲状腺激素和/或卤代双酚A水平之前，临床医师可以或不可以进行其他医学评估或分析。例如，可以在本发明的方法或测定之前、同时或之后测定任何其他生物标记物或其水平。在这些初步研究之后，并且例如基于偏离正常的结果，临床医师可以向受试者建议本发明的方法或测定。替代地，本发明的方法和测定也适合用于筛选小群体样品以及大群体样品。
在本文中，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。
如本文所用，“多核苷酸”是指包括编码讨论中的氨基酸聚合物或多肽的核酸序列或者其保守序列变体的任何多核苷酸，诸如单链或双链DNA(基因组DNA或cDNA)或RNA。保守核苷酸序列变体(即核苷酸序列修饰，其不显著改变所编码的多肽的生物学特性)包括由遗传密码退化以及由沉默突变引起的变体。
说明书和权利要求书中所列出的任何一个序列或子序列的微小变化或修饰仍在本发明范围内，只要它们不影响抗体或抗原结合片段的结合活性和/或亲和性。制造任何遗传修饰的方法通常是众所周知的，并且描述在描述实验室分子技术的各种实用手册中。
通常，样品中T4多肽(或其活性)或多核苷酸的存在、缺失或量可以通过本领域已知的任何适合的方法进行检测。适合的检测方法的非限制性实例包括酶学测定、基于PCR的测定(例如，qPCR、RT-PCR)、免疫学检测方法及其组合。
给出以下实施例进一步说明本发明的实施方式，但不旨在限制本发明的范围。对于本领域技术人员来说，很明显随着技术的进步，本发明的构思可以以各种方式来实现。本发明及其实施方式不限于下面描述的实施例，而是可以在权利要求书的范围内变化。
实施例
实施例1.抗体基因文库的构建，抗T4抗体的选择与筛选
用弗氏(Freund’s)佐剂中的T4-和T3-
从LB-amp平板上挑取总共384个单个菌落置于96孔微量滴定板上，该微量滴定板包含补充有100μg/ml氨苄青霉素、10μg/ml四环素并使用+1％(w/v)葡萄糖的100μl的SB-培养培养基。在第二天，将9μl过夜培养物添加到包含100μg/ml氨苄青霉素、10μg/ml四环素、0.1％葡萄糖和1mM异丙基-β-D-硫代半乳-吡喃糖苷的100μl的SB(IPTG，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)/孔)中，并于34℃下、80％湿度中在振荡下生长过夜。对于ELISA筛选测定，在+4℃下，将于pH 9.6碳酸氢钠缓冲液中的300ng的T4-HSA涂覆到MaxiSorp平板(Nunc)的每个孔上过夜。在第二天，将平板用PBST洗涤，用
将编码抗体的插入转移到pKKtac表达载体(Takkinen,K.等人,ProteinEngineering,Design and Selection,4(7),837-841)中，其在Fab重链的C端位置处包括His
实施例2.亲和性和特异性确定
纯化的抗T4 Fab片段对各种分析物的亲和性使用表面等离子体共振仪器BIAcoreT200(GE Healthcare，美国新泽西州皮斯卡塔韦)与抑制测定来分析(Nieba,L.等人1996,Anal.Biochem.234,155–165；Badescu,G.O.等人2016,PLoS ONE,11,e0152148；Persson,B.D.等人2009,J.Virol.83,673–686；Tullila,A.,and Nevanen,T.K.2017,InternationalJournal of Molecular Sciences,18(6),1169；Adamczyk,M.等人1998,Bioconjugatechemistry,9(1),23-32。在固定化之前，如Cannon等人(2004,Analytical biochemistry,330.1:98-113)所述对BIAcore CM5传感器芯片(29104988,GE Healthcare，美国新泽西州皮斯卡塔韦)的表面进行预处理。将T4-AP和AP(P5931,Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市)在10mM乙酸钠pH 4.0(BR100351,GE Healthcare，美国新泽西州皮斯卡塔韦)中稀释至100μg/mL浓度。按照制造商的说明书，使用EDC/NHS–化学将T4-AP和AP固定化至预处理的CM5芯片。使用抗T4 Fab片段的理论消光系数(ExPASy ProtParam工具，http://web.expasy.org/protparam)并通过用NanoDrop 2000c仪器(Thermo Disher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)测量A280来计算抗T4 Fab片段的浓度。将4nM抗T4 Fab片段制备到补充有DMSO(D5897,Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市)的2％(v/v)DMSO-PBSP(20mM磷酸酶、2.7mM KCl、137mM NaCl、0.05％吐温20(制备自10×PBSP+,28-9950-84,GEHealthcare，美国新泽西州皮斯卡塔韦)中，并进一步稀释3/5倍到相同的缓冲液中以获得游离Fab片段抗体的校正系列。每个分析中使用总共八个稀释度。缔合的接触时间设置为420秒，且解离的设置为30秒。用补充有0.05％(v/v)P20的10mM NaOH获得了抗T4 Fab的成功再生。在所有循环步骤中流速均设置为30μl/min。
将不同浓度的分析物T4(T2376,Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市)、T3(T2877,Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市)、T2(D0629,Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市)、T0(T5905,Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市)、四碘双酚A(4971-59-9,Spectra Group Limited)、四溴双酚A(330396,Sigma-Aldrich美国密苏里州圣路易斯市)、四氯双酚A(TCI-T0062,Tokio Chemical Industry,)和双酚A(239658,Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市)与2nM浓度的抗T4 Fab片段预孵育。将预孵育的混合物注射到传感器芯片表面上持续七分钟并解离30秒。用10mM NaOH+0.05％(v/v)吐温20将结合的抗T4 Fab片段成功地从表面再生。数据收集点设置为开始解离阶段后10秒。所有样品系列均一式三份进行，其中单个样品系列由预孵育混合物中增加的小分子浓度组成。数据均减去了参考和空白。此外，样品之间DMSO的小差异使用DMSO溶剂校正系列补偿，如仪器制造商GE Healthcare)所推荐的。通过比较获得的响应相对于抗T4 Fab片段的标准曲线来计算预孵育的混合物中剩余的游离抗T4 Fab片段的浓度。使用BIAcore T200评价软件(GE Healthcare，美国新泽西州皮斯卡塔韦)应用四参数逻辑函数计算亲和性常数。(参见图4A和B以及表1。)
表1.使用BIAcore T200评价软件的亲和性常数
实施例3.ELISA测定
L-甲状腺素
在+37℃于600rpm振荡下，用于PBS(15mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.3)中的100μl的4μg/ml T4-BSA(Fitzgerald,80-IT50)涂覆微量滴定板孔(Nunc,436023)一小时。然后将孔用补充有0.05％(v/v)吐温20(Sigma-Aldrich,93773-250G)的300μl PBS洗涤三次。在室温于600rpm振荡下将孔用200μl的
如图5中所见，在竞争性ELISA测定中，检测限(LOD)值是84pM且定量限(LOQ)是314pM，表明了T4 Fab用于测量样品中总甲状腺素浓度的潜能(参见图5的结果)。
四碘双酚A
如前述段落(标题L-甲状腺素下)进行测定，除了使用TIBPA(四碘双酚A)代替T4(甲状腺素)。
LOD和LOQ的竞争性ELISA结果与Biacore亲和性测量结果具有可比性。TIBPA的竞争性ELISA测定的敏感性比L-甲状腺素的低两个数量级。参见图6中的结果。
四溴双酚A
如标题L-甲状腺素下的段落中进行测定，除了使用TBBPA(四溴双酚A)代替T4(甲状腺素)。
LOD和LOQ的竞争性ELISA结果与Biacore亲和性测量结果具有可比性。TBBPA的竞争性ELISA测定的敏感性比L-甲状腺素的低两个数量级以上。参见图7中的结果。
四氯双酚A
如标题L-甲状腺素下的段落中进行测定，除了使用TCBPA(四氯双酚A)代替T4(甲状腺素)。
LOD和LOQ的竞争性ELISA结果与Biacore亲和性测量结果具有可比性。TCBPA的竞争性ELISA测定的敏感性比L-甲状腺素的低三个数量级。参见图8中的结果。
双酚A
如标题L-甲状腺素下的段落中进行测定，除了使用BPA(双酚A)代替T4(甲状腺素)。
在竞争性ELISA测定中，即使在高浓度(5μM)的BPA下也没有观察到竞争。参见图9中的结果。
实施例4.抗T4抗体的三维结构
用在由2μl的T4-Fab(4mg/ml，事先与T4孵育)和2μl的池液组成的悬滴液中的蒸汽扩散来进行T4-Fab与T4的结晶。在20℃在0.1M硫酸铵、0.1M HEPES、pH 7.2和25％(w/v)PEG3350的池液条件下获得T4-Fab/T4复合物的初始晶体。使用划线接种来改善晶体质量。将晶体通过浸泡在补充有20％甘油的结晶溶液中并随后在液氮中极速冰冻来进行冷冻保护。分别在钻石同步加速器的光束线I04上以及在ESRF(Grenoble,France)的光束线ID23上，在100K收集T4-Fab/T4复合物结构的数据。用XDS(Kabsch)处理数据集，并用XSCALE进行缩放。该晶体属于空间群C2并且每个不对称单元具有一个分子。T4-Fab/T4的
序列表
<110> 芬兰国家技术研究中心股份公司(Teknologian tutkimuskeskus VTT Oy)
<120> 抗甲状腺激素(T4)重组抗体或抗原结合片段
<130> PPI20031421FI
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T4 Fab轻链核苷酸序列
<400> 1
gatattgttc tcaaccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca attccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca taagccagga 120
tcctcccccc gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc cgctcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg aaataacccg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 360
agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 420
aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 480
agttggactg atcaggacag caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgctc 540
accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 600
acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgt 639
<210> 2
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T4 Fab重链核苷酸序列
<400> 2
gaagtgaagc ttgaggagtc tgggggaggc ttagtgaaac ttggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctattaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagagaaga ggctggagtt ggtcgcagcc attaatagta atggtggtag cacctactat 180
ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccttgt attactgtgc aagaggggat 300
tactacggta gtagcttata ttactatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct cagccaaaac gacaccccca tctgtctatc cactggcccc tggatctgct 420
gcccaaacta actccatggt gaccctggga tgcctggtca agggctattt ccctgagcca 480
gtgacagtga cctggaactc tggatccctg tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc 540
ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc tcagtgactg tcccctccag cacctggccc 600
agcgagaccg tcacctgcaa cgttgcccac ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa 660
attgtgccca gggattgt 678
<210> 3
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T4 Fab轻链氨基酸序列
<400> 3
Asp Ile Val Leu Asn Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Asn Ser Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 4
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T4 Fab重链氨基酸序列
<400> 4
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
115 120 125
Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn
130 135 140
Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val
195 200 205
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg
210 215 220
Asp Cys
225
<210> 5
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T4 Fab轻链氨基酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<400> 5
Asp Ile Val Leu Asn Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Asn Ser Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Xaa Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 6
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T4 Fab重链氨基酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(59)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (107)..(107)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa是Tyr或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(113)
<223> Xaa是Tyr或Phe
<400> 6
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Xaa Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Xaa Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Xaa Tyr Xaa Ala Met Asp
100 105 110
Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
115 120 125
Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn
130 135 140
Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val
195 200 205
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg
210 215 220
Asp Cys
225
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<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T4 Fab轻链核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (277)..(279)
<223> n是a, c, g或t
<400> 7
gatattgttc tcaaccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca attccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca taagccagga 120
tcctcccccc gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagtnnnc cgctcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg aaataacccg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 360
agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 420
aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 480
agttggactg atcaggacag caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgctc 540
accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 600
acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgt 639
<210> 8
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T4 Fab重链核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(99)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (175)..(177)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (319)..(321)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (325)..(327)
<223> n是a, c, g或t
<400> 8
gaagtgaagc ttgaggagtc tgggggaggc ttagtgaaac ttggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatnnna tgtcttgggt tcgccagact 120
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ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccttgt attactgtgc aagaggggat 300
tactacggta gtagcttann ntacnnngct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct cagccaaaac gacaccccca tctgtctatc cactggcccc tggatctgct 420
gcccaaacta actccatggt gaccctggga tgcctggtca agggctattt ccctgagcca 480
gtgacagtga cctggaactc tggatccctg tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc 540
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agcgagaccg tcacctgcaa cgttgcccac ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa 660
attgtgccca gggattgtgc ggccgcacat catcatcatc atcat 705