荧光性化合物及使用了该荧光性化合物的荧光标记生物物质
文献发布时间：2023-06-19 09:29:07
技术领域
本发明涉及一种荧光性化合物及使用了该荧光性化合物的荧光标记生物物质。
背景技术
分析生物体中的生物体分子、细胞及组织等的动态及功能等的生物体成像技术利用于各种疾患的诊断等中。近年来，作为生物体观察的新技术，期待通过荧光色素对生物体的特定的部位进行可视化并观察的生物体荧光成像。
在该生物体荧光成像中，通常使用有机荧光色素。但是，有机荧光色素的耐光性低，由于激励光照射而劣化，有时不能充分进行期望的生物体观察。
二吡咯甲川硼配合物被公知为量子产率高，且显示出清晰的发光特性的荧光色素，被用于各种领域中。
例如，专利文献1中记载了一种期待用于肿瘤的诊断的荧光脂质醚化合物，作为该荧光脂质醚化合物中的荧光团的一例，记载了二吡咯甲川硼配合物。并且，专利文献2中记载了一种通过化学键的能量转移盒，作为该盒的供体或受体一例，记载了二吡咯甲川硼配合物。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2016-193907号公报
专利文献2：美国专利申请公开第2009/0192298号说明书
发明内容
发明要解决的技术课题
但是，二吡咯甲川硼配合物通常水溶性差，耐光性也低。因此，在生物体荧光成像等的生物体观察工具中适用二吡咯甲川硼配合物时，需要以高水准对二吡咯甲川硼配合物赋予水溶性和耐光性这两种特性。从该观点考虑，本发明人等进行深入研究，结果发现尽管有高水溶性的二吡咯甲川硼配合物的报告，但这些高水溶性二吡咯甲川硼配合物容易褪色，耐光性依然差。
本发明的课题在于，提供一种具有二吡咯甲川硼配合物结构，且实现兼顾生物体荧光成像所要求的充分的亲水性和优异的耐光性的荧光性化合物。并且，本发明的课题还在于，提供一种将该荧光性化合物与生物物质键合而成的荧光标记生物物质。
用于解决技术课题的手段
本发明人等认为现有的水溶性二吡咯甲川硼配合物的褪色的主要原因是由活性氧引起的对硼原子的光分解。在该考虑下，发现通过在具有特定结构的化合物进一步导入特定的亲水性基团，可以成功抑制褪色，获得亲水性也优异的荧光色素，所述具有特定结构的化合物是将在二吡咯甲川骨架中导入取代基的化合物作为3齿配体或4齿配体与硼原子配位而得到的化合物。本发明是根据这些见解进一步反复进行研究而完成的。
即，本发明的上述课题通过下述方法得到解决。
＜1＞
一种荧光性化合物，其由下述式(1)或式(4)中的任一者表示。
[化学式1]
式中，X表示CR
R
R
Q
L
环β
其中，R
其中，当X为CR
[化学式2]
*-L
式中，L
R
*表示键合部。
[化学式3]
式中，R
*表示键合部。
＜2＞
根据＜1＞所述的荧光性化合物，其中，
上述Q
＜3＞
根据＜1＞或＜2＞所述的荧光性化合物，其中，
上述X为CR
上述L
＜4＞
根据＜1＞至＜3＞中的任一项所述的荧光性化合物，其中，
上述R
＜5＞
根据＜1＞至＜4＞中的任一项所述的荧光性化合物，其中，
上述R
＜6＞
根据＜1＞至＜5＞中的任一项所述的荧光性化合物，其中，
上述R
＜7＞
根据＜1＞至＜6＞中的任一项所述的荧光性化合物，其中，
上述L
＜8＞
根据＜1＞至＜7＞中的任一项所述的荧光性化合物，其由下述式(2)或式(5)中的任一者表示。
[化学式4]
式中，X表示CR
R
环A表示烃环或杂环。
L
其中，环β
＜9＞
根据＜1＞至＜8＞中的任一项所述的荧光性化合物，其由下述式(3)或式(6)中的任一者表示。
[化学式5]
式中，X表示CR
R
R
其中，环β
＜10＞
根据＜1＞至＜6＞中的任一项所述的荧光性化合物，其由下述式(7)或式(8)中的任一者表示。
[化学式6]
式中，X表示CR
R
L
L
其中，环β
＜11＞
根据＜1＞至＜6＞中的任一项所述的荧光性化合物，其由下述式(9)表示。
[化学式7]
式中，X表示CR
R
L
L
环A表示烃环或杂环。
其中，环β
＜12＞
根据＜1＞至＜11＞中的任一项所述的荧光性化合物，其中，
上述R
＜13＞
一种荧光标记生物物质，其由上述＜12＞所述的荧光性化合物与生物物质键合而成。
＜14＞
根据＜13＞所述的荧光标记生物物质，其中，
上述生物物质为蛋白质、肽、氨基酸、核酸、糖链及脂质中的任一种。
＜15＞
根据＜13＞或＜14＞所述的荧光标记生物物质，其中，
上述荧光性化合物与上述生物物质之间的键合为基于下述i)～v)中的任一种的键合：
i)肽之间的非共价键或共价键、
ii)荧光性化合物中的长链烷基与生物物质中的脂质二重膜或脂质的范德华相互作用、
iii)使荧光性化合物中的N-羟基琥珀酰亚胺酯与生物物质中的氨基进行反应而成的酰胺键、
iv)使荧光性化合物中的马来酰亚胺基团与生物物质中的硫烷基进行反应而成的硫醚键、及
v)使荧光性化合物中的叠氮基与生物物质中的乙炔基、或荧光性化合物中的乙炔基与生物物质中的叠氮基进行点击反应而成的伴随三唑环的形成的键。
发明效果
本发明的荧光性化合物是实现兼顾生物体荧光成像所要求的充分的亲水性和高耐光性的荧光性化合物。并且，本发明的荧光标记生物物质的亲水性和耐光性这两种特性优异，能够优选用于生物体荧光成像。
具体实施方式
在本发明中，在具有多个由特定的符号或式表示的取代基或者连接基团等(以下，称为取代基等)时，或同时规定多个取代基等时，只要没有特别说明，各个取代基等彼此可以相同或不同。这关于取代基等的数量的规定也相同。并且，在多个取代基等靠近时(尤其，相邻时)，只要没有特别说明，它们可以彼此连结而形成环。并且，只要没有特别说明，环、例如脂环、芳香族环及杂环可以进一步稠合而形成稠环。
在本说明书中，只要没有特别说明，关于双键，在分子内存在E型及Z型的情况下，可以是其中的任一种，并且也可以是它们的混合物。并且，只要没有特别说明，在作为化合物存在非对映体及对映体的情况下，可以是其中的任一种，并且也可以是它们的混合物。例如，在本发明的荧光性化合物中的具有3齿配位的二吡咯甲川骨架的化合物中，包含以硼原子为不对称中心的对映体。
在本发明中，关于化合物(包括配合物。)及取代基的表述，除了化合物本身及取代基本身以外，还用于包含其盐、其离子的意思。例如，在式(A)中的R
在盐结构的情况下，其盐的种类可以是一种，也可以混合存在两种以上，也可以在化合物中混合存在盐型和游离酸结构的基团，并且也可以混合存在盐结构的化合物和游离酸结构化合物。
并且，在不损害本发明的效果的范围内，是指包含改变结构的一部分。而且，关于未明确记载取代或未取代的化合物，在不损害本发明的效果的范围内，是指可以具有任意的取代基。这关于取代基(例如，表述为“烷基”、“甲基(Methyl group)”、“甲基(Methyl)”等的基团)及连接基团(例如，表述为“亚烷基”、“亚甲基(Methylene group)”、“亚甲基(Methylene)”等的基团)也相同。在这样的任意的取代基中，本发明中优选的取代基为选自后述的取代基组T中的取代基。
在本发明中，二吡咯甲川硼配合物结构是指，二吡咯甲川骨架相对于硼原子以2齿配位、3齿配位及4齿配位中的任一种进行配位的结构。另外，3齿配位及4齿配位除了通过二吡咯亚甲基的两个氮原子以外，通过二吡咯甲川骨架上的一个或两个取代基与硼原子进行配位来形成。
并且，在本发明中记载的化学结构式中，省略二吡咯亚甲基的两个氮原子中的一个氮原子上的正电荷及硼原子上的负电荷来记载。
并且，在本发明中使用“～”表示的数值范围是指作为下限值及上限值包含记载于“～”前后的数值的范围。
并且，在本发明中，C
本发明的荧光性化合物由下述式(1)或后述的式(4)表示。关于本发明的荧光性化合物显示出生物体荧光成像所要求的充分的亲水性和优异的耐光性的理由的详细内容尚未确定，但认为如下。
本发明的荧光性化合物均如由各式所示，是使在二吡咯甲川骨架中导入一个或两个以上的取代基的化合物不以2齿配体而是作为3齿或者4齿配体与硼原子进行配位而成的、具有特定结构的化合物，并且还具有特定的亲水性基团。因此，认为化合物(配合物)中的硼原子的稳定性提高，由活性氧引起的对硼原子部位的光分解得到阻碍，显示出优异的耐光性，也显示出充分的亲水性。
以下，依次对本发明的由式(1)表示的荧光性化合物及本发明的由式(4)表示的荧光性化合物进行详细说明。
＜由式(1)表示的荧光性化合物＞
本发明的由式(1)表示的荧光性化合物如下所述。
[化学式8]
式中，X表示CR
R
Q
L
环β
其中，R
并且，在Q
另外，在X为CR
并且，在X为CR
另外，在X为CR
并且，在X为CR
以下，对式(1)中的取代基等进行详细说明。
·由式(A)表示的基团
[化学式9]
*-L
式中，L
其中，在L
R
另外，在能够用作R
并且，关于亚烷基、亚芳基及由式(1-1)～式(1-8)中的任一者表示的基团的组合，种类为一种或两种以上，组合的数量并没有特别限定。
其中，由式(A)表示的基团中，最接近*的基团为亚烷基或亚芳基(以下，称为“*-亚烷基或*-亚芳基”。)，在满足以下(i)或(ii)的情况下，理解为L
(i)*-亚烷基或*-亚芳基为未取代的基团。
(ii)由式(A)表示的基团为具有特定的亲水性基团Pi的基团，由该式(A)表示的基团所具有的所有特定的亲水性基团Pi与*-亚烷基或*-亚芳基直接键合。
关于除上述以外的具有*-亚烷基或*-亚芳基的由式(A)表示的基团，理解为L
*表示键合部。
能够用作L
能够用作L
能够用作L
作为能够用作L
能够用作L
在能够用作L
作为能够用作R
并且，能够用作R
在1价脂肪族杂环基具有特定的亲水性基团Pi的方式中，除了采用特定的亲水性基团Pi作为取代基的方式以外，例如也包括作为脂肪族杂环的环构成原子的氮原子作为铵基结合的方式(例如，哌嗪鎓基(Piperazinium))。
作为上述R
(1)在L
R
(2)在L
R
(3)在L
R
其中，从通过抑制光化学的分解赋予高耐光性的观点考虑，更优选X为CR
·由式(1-1)～式(1-8)表示的基团
[化学式10]
式中，R
*表示键合部。
作为能够用作R
另外，能够用作R
作为能够用作R
另外，在R
作为组合由上述式(1-1)～式(1-8)表示的基团而成的基团，可优选举出由下述式(1A-1)～式(1A-9)表示的基团。
[化学式11]
R
*及**表示键合部。另外，**表示作为能够用作L
作为能够用作上述L
作为能够用作上述L
由上述式(1A-1)、(1A-4)或(1A-8)表示的基团和由作为R
另外，作为L
作为组合能够用作L
关于能够用作L
·X
上述X表示CR
·R
上述R
作为R
作为上述R
作为上述R
·Q
上述Q
Q
更具体而言，从与硼原子的键合能最高且稳定的观点考虑，Q
·L
上述L
能够用作L
并且，能够用作L
作为能够用作L
在能够用作L
例如，在作为L
能够用作L
能够构成L
能够构成L
前述的能够构成L
L
作为不含有由式(1-1)～式(1-8)中的任一者表示的基团的L
作为含有由式(1-1)～式(1-8)中的任一者表示的基团的L
·特定的亲水性基团Pi：羧基或者其盐、磺基或者其盐、膦酰基或者其盐、鎓基及聚氨基酸残基
R
作为羧基、磺基及膦酰基的盐，例如可举出Na、Li及K等碱金属的盐、Mg、Ca及Ba等碱土类金属的盐、四烷基铵等有机胺的盐。
关于由式(1)表示的化合物中的特定的亲水性基团Pi的数量，只要R
在由式(1)表示的荧光性化合物中含有多个上述羧基等的情况下，该多个基团可以是盐结构及游离酸结构中的任一个，可以彼此相同或不同。
其中，“聚氨基酸”是指2个以上的氨基酸利用肽键连接而成的化合物，是包含肽及蛋白质的概念。构成“聚氨基酸”的氨基酸的数量优选为2～30，更优选为4～20，进一步优选为6～10。“聚氨基酸残基”是由聚氨基酸获得的基团。“聚氨基酸残基”优选为将构成聚氨基酸的氨基酸所具有的-NH
上述鎓基可举出铵基(包括吡啶鎓盐、哌啶鎓盐、哌嗪鎓盐及吡咯烷鎓盐等环状铵基。)、锍基及膦基，优选为铵基。
作为构成鎓基的抗衡离子，例如可举出磺酸根离子及碘离子等无机离子。
其中，认为通过在HOMO(Highest Occupied Molecular Orbital，最高被占领分子轨道)丰富的R
从上述观点考虑，R
·其他规定事项
环β
其中，环β
在环β
本发明的荧光性化合物除由式(1)表示的二吡咯甲川硼配合物结构以外，可以含有具有二吡咯甲川硼配合物结构的取代基作为取代基。在同一分子内具有2个以上的二吡咯甲川硼配合物结构的情况下，任一个二吡咯甲川硼配合物结构均具有相对于硼原子的3齿配位骨架或4齿配位骨架。由此，能够显示出高耐光性。
并且，R
并且，R
在X为CR
并且，在X为CR
作为另一方式，在X为CR
并且，在X为CR
＜由式(2)表示的荧光性化合物＞
本发明的由式(1)表示的荧光性化合物优选由下述式(2)表示。
[化学式12]
式中，X表示CR
R
环A表示烃环或杂环。
L
其中，环β
能够用作L
并且，能够用作L
能够用作L
作为L
式中的两个L
上述环A在由式(2)表示的荧光性化合物中作为2价的基团并入。
作为上述环A能够采用的烃环及杂环，可举出芳香族烃环、脂肪族烃环、芳香族杂环及脂肪族杂环。该脂肪族烃环及脂肪族杂环中的环可以具有不饱和键。这些环与将选自后述的取代基组T的芳基、环烷基及环烯基、杂芳基以及杂环基中的连接键部分取代为氢原子的环含义相同，优选的环也相同。
在上述环A为杂环的情况下，构成环β
具体而言，作为芳香族烃环，可举出苯及萘等，作为脂肪族烃环，可举出环丙烷、环戊烷、环己烷、环丙烯、环戊烯及环己烯等，作为芳香族杂环，可举出呋喃、噻吩、吡咯、噁唑、噻唑、咪唑、异噁唑、异噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、1,2,3-三嗪及它们的稠环等，作为脂肪族杂环，可举出吡咯烷、哌啶、哌嗪及吗啉等。
式中的两个环A分别可以彼此相同，也可以不同。
尤其，在环A为苯环，Q为由式(1-1)表示的基团的情况下，如下所述，从显示更高耐光性的观点考虑，优选环β
即，L
＜由式(3)表示的荧光性化合物＞
本发明的由式(1)表示的荧光性化合物更优选由下述式(3)表示。
[化学式13]
式中，X表示CR
R
R
n为0～4的整数，优选为0～3的整数，更优选为0～2的整数，尤其优选为0或1。
其中，环β
作为能够用作上述R
其中，从提高本发明的荧光性化合物在水溶液中的耐光性的观点考虑，优选由式(3)表示的苯环相对于与L
其中，从提高使用含有本发明的荧光性化合物的荧光标记生物物质作为荧光色素的染色细胞的耐光性的观点考虑，优选由式(3)表示的苯环相对于与L
＜由式(7)表示的荧光性化合物＞
本发明的由式(1)表示的荧光性化合物也优选由下述式(7)表示。
[化学式14]
式中，X表示CR
R
L
L
其中，环β
式中的两个L
能够用作L
L
上述亚烷基的碳原子数优选为1或2。
能够用作L
L
＜由式(9)表示的荧光性化合物＞
本发明的由式(1)表示的荧光性化合物也优选由下述式(9)表示。
[化学式15]
由上述式(9)表示的荧光性化合物在具有式(7)中的环β
因此，在式(9)中，X、R
并且，在上述式(9)中，环β
＜由式(4)表示的荧光性化合物＞
本发明的由式(4)表示的荧光性化合物如下所述。
[化学式16]
由上述式(4)表示的荧光性化合物在不具有由吡咯环中的相邻的碳原子及氮原子、硼原子、L
因此，在式(4)中，X、R
其中，在上述式(4)中，R
在上述式(4)中，R
R
能够用作R
R
＜由式(5)表示的荧光性化合物＞
本发明的由式(4)表示的荧光性化合物优选由下述式(5)表示。
[化学式17]
由上述式(5)表示的荧光性化合物在R
因此，在式(5)中，X、R
在上述式(5)中，R
＜由式(6)表示的荧光性化合物＞
本发明的由式(4)表示的荧光性化合物更优选由下述式(6)表示。
[化学式18]
由上述式(6)表示的荧光性化合物在R
因此，在式(5)中，X、R
在上述式(6)中，R
＜由式(8)表示的荧光性化合物＞
本发明的由式(4)表示的荧光性化合物也优选由下述式(8)表示。
[化学式19]
由上述式(8)表示的荧光性化合物在R
因此，在式(8)中，X、R
在上述式(8)中，R
由上述式(7)及式(8)中的任一者表示的荧光性化合物具有上述特定的基团作为环β
以下示出本发明的由式(1)表示的荧光性化合物及由式(4)表示的荧光性化合物的具体例，但本发明并不限定于这些化合物。在下述具体例中，关于特定的亲水性基团Pi等具有解离性的氢原子的基团，氢原子可以解离而采用盐结构。并且，结构式中的m为平均重复数，表示0～10000。
[化学式20]
[化学式21]
[化学式22]
[化学式23]
[化学式24]
[化学式25]
[化学式26]
[化学式27]
[化学式28]
[化学式29]
[化学式30]
[化学式31]
[化学式32]
[化学式33]
[化学式34]
[化学式35]
[化学式36]
[化学式37]
[化学式38]
[化学式39]
[化学式40]
[化学式41]
[化学式42]
本发明的由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物能够利用公知的方法进行合成。例如，可举出J.Org.Chem.,2008,73(5),1963～1970及J.Mater.Chem.B,2014,2,1576～1583。
本发明的由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物的亲水性优异，并且通过与蛋白质、肽、氨基酸、核酸、糖链及脂质等生物物质键合，能够用作生物体荧光成像用试剂。
而且，本发明的由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物即使在含有水的水溶性溶剂(水溶性溶剂是含有相对多的氧的溶剂)中，耐光性也优异。因此，与使用了以往的荧光性化合物的情况相比，能够长时间、以高分辨率进行生物体观察等。
即，本发明的由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物也包含具有与生物物质之间相互作用(物理吸附及化学键合等)的基团的化合物，从将本发明的荧光性化合物适用于生物体荧光成像的观点考虑，尤其优选这样的方式。
具体而言，本发明的荧光性化合物优选R
以下示出具有与生物物质之间相互作用的基团的化合物的具体例，但本发明并不限定于这些化合物。在下述具体例中，关于特定的亲水性基团Pi等具有解离性的氢原子的基团，氢原子可以解离而采用盐结构。并且，结构式中的m为平均重复数，表示0～10000。
[化学式43]
[化学式44]
[化学式45]
具有用于作用(包括附着)或者键合于生物物质的基团的化合物能够利用公知的方法进行合成。例如，能够参考Bioconjugate Techniques(Third Edition、GregT.Hermanson著)。
＜＜荧光标记生物物质＞＞
本发明的荧光标记生物物质是本发明的由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物与生物物质键合而成的物质。由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物与生物物质之间的键合可以是由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物与生物物质直接键合的方式，也可以是经由连接基团连接的方式。
作为上述生物物质，可优选举出蛋白质、肽、氨基酸、核酸、糖链及脂质。作为蛋白质，可优选举出抗体，作为脂质，可优选举出磷脂、脂肪酸及固醇。
上述生物物质中，作为临床病理上有用的物质，并没有特别限制，例如可举出IgG、IgM、IgE、IgA、IgD等免疫球蛋白、补体、CRP.铁蛋白、α
而且，也可举出白喉病菌、肉毒杆菌、支原体、苍白密螺旋体等细菌及它们的抗体、弓形浆虫、滴虫、利什曼虫、锥虫、疟原虫等原虫类及它们的抗体、ELM3、HM1、KH2、v6.5、v17.2、v26.2(源自小鼠129、129/SV、C57BL/6、BALB/c)等ES细胞及它们的抗体、苯妥英、苯巴比妥等抗癫痫药、奎尼丁、地高辛等心血管药、茶碱等抗哮喘药、氯霉素、庆大霉素等抗生素等药物类及它们的抗体、其他酶、外毒素(苯乙烯吡啶(styrelidine O)等)及它们的抗体等。并且，也能够使用Fab’2、Fab、Fv等抗体片段。
作为本发明的由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物(以下，也简称为荧光性化合物(1)或(4)。)与生物物质相互作用而键合的具体的方式，例如可举出下述记载的方式。可举出：
i)荧光性化合物(1)或(4)中的肽与生物物质中的肽的非共价键(例如，氢键、包含螫合形成的离子键)或共价键、
ii)荧光性化合物(1)或(4)中的长链烷基与生物物质中的脂质二重膜及脂质等的范德华力、
iii)基于荧光性化合物(1)或(4)中的NHS酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)与生物物质中的氨基的反应的酰胺键、
iv)基于荧光性化合物(1)或(4)中的马来酰亚胺基团与生物物质中的硫烷基(-SH)的反应的硫醚键、
v)基于荧光性化合物(1)或(4)中的叠氮基与生物物质中的乙炔基的点击反应或基于荧光性化合物(1)或(4)中的乙炔基与生物物质中的叠氮基的点击反应的三唑环的形成。
其中，在上述ii)中记载的荧光性化合物(1)或(4)中的长链烷基中，如式(1)或式(4)中所规定，在X为CR
除上述i)～v)的方式以外，例如也能够通过Lucas C.D.de Rezende and Flavioda Silva Emery,.A Review of the Synthetic Strategies for the Development ofBODIPY Dyes for Conjugation with Proteins,Orbital:The Electronic Journal ofChemistry,2013,Vol 5,No.1,p.62-83中记载的方式键合。并且，在本发明的荧光标记生物物质的制作中，也能够适当参考该文献中记载的方法等。
[化学式46]
本发明的荧光标记生物物质的亲水性优异，并且在含有水的水溶性溶剂(水溶性溶剂是含有相对多的氧的溶剂)中，耐光性也优异。因此，与使用了以往的BODIPY(注册商标)化合物等具有二吡咯甲川硼配合物结构的荧光标记生物物质的情况相比，能够长时间、以高分辨率进行生物体观察等。并且，本发明的荧光标记生物物质在溶解于生理盐水及磷酸缓冲液等水系介质中的溶液形态下的耐光性优异，因此在溶液形态下的保存性也优异。
＜含有荧光标记生物物质的试剂＞
在含有本发明的荧光标记生物物质的试剂中，本发明的荧光标记生物物质并没有特别限制，能够根据使用目的等适当选择其形态，例如溶解于生理盐水及磷酸缓冲液等水系介质中的溶液形态以及微粒子状粉末及冻结干燥粉末等固体形态等。
例如，在使用本发明的荧光标记生物物质作为下述生物体荧光成像试剂的情况下，也能够用作含有上述任一种形态的荧光标记生物物质的试剂。
＜荧光标记生物物质的用途＞
从本发明的由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物获得的本发明的荧光标记生物物质能够稳定地检测从通过光照射激励的荧光性化合物发出的荧光。而且，具备作为生物体荧光成像试剂的充分的亲水性。因此，本发明的荧光标记生物物质适合作为例如生物体荧光成像试剂。
使用本发明的荧光标记生物物质作为荧光色素染色的细胞，通过高度抑制褪色，能够长时间维持荧光强度。因此，本发明的荧光标记生物物质能够优选用于要求优异的耐光性的生物体荧光成像，例如基于时移测定的显微镜观察等长期的生物物质的观察、使用了共焦激光显微镜等高分辨率显微镜或STED显微镜(受激发射抑制显微镜)等超分辨率显微镜的生物物质的观察等。
使用了本发明的荧光标记生物物质的生物体荧光成像包括以下(i)～(iii)的工序。
(i)准备作为目标的生物物质(以下，称为“目标生物物质”。)和能够与目标生物物质键合的生物物质与本发明的荧光性化合物键合而成的本发明的荧光标记生物物质的工序
(ii)使目标生物物质与本发明的荧光标记生物物质键合的工序
(iii)对本发明的荧光标记生物物质生物体与目标生物物质键合而成的物质照射本发明的荧光标记生物体所吸收的波长区域的光，检测本发明的荧光标记生物体发出的荧光的工序
在上述生物体荧光成像中，作为能够与目标生物物质键合的生物物质，可举出上述本发明的荧光标记生物物质中的生物物质。能够根据目标生物物质(受检体)适当选择，且能够选择能够与受检体特异性地键合的生物物质。
作为上述目标生物物质，可举出蛋白质、所谓的疾病标记。作为疾病标记，并没有特别限制，例如可举出α-甲胎蛋白(AFP)、PIVKA-II、BCA225、碱性甲胎蛋白(BFP)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA125、CA130、CA602、CA54/61(CA546)、癌胚抗原(CEA)、DUPAN-2、弹性蛋白酶1、免疫抑制酸性蛋白(IAP)、NCC-ST-439、γ-精蛋白(γ-Sm)、前列腺特异抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、神经特异烯醇酶(NSE)、Iba1、淀粉样蛋白β、Tau、鳞状细胞癌相关抗原(SCC抗原)、唾液酸LeX-i抗原(SLX)、SPan-1、组织多肽抗原(TPA)、唾液酸Tn抗原(STN)、CYFRA(cytokeratin：细胞角蛋白)胃蛋白酶原(PG)、C-反应性蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A蛋白(SAA)、肌红蛋白、肌酸激酶(CK)、肌钙蛋白T、心室肌肌球蛋白轻链I等。
作为上述目标生物物质中的细菌，可举出作为细胞微生物学性检查的对象的细菌，并没有特别限制，例如可举出大肠杆菌、沙门氏菌、呼吸道病菌、对公众卫生产生问题的菌等。
作为上述目标生物物质中的病毒抗原，并没有特别限制，例如可举出丙型、乙型肝炎病毒的抗原等肝炎病毒抗原、HIV病毒的p24蛋白抗原、CMV(巨细胞病毒)的pp65蛋白抗原、HPV(乳头瘤病毒)的E6及E7蛋白等。
在上述(i)中，目标生物物质并没有特别限制，能够按照常规方法制备。
并且，本发明的荧光标记生物物质也没有特别限制，能够使能够与目标生物物质键合的生物物质与本发明的荧光性化合物按照常规方法键合而制备。作为键的形态及形成键的反应，能够举出在上述本发明的荧光标记生物物质中记载的相互作用而键合的形态及反应。
在上述(ii)中，本发明的荧光标记生物物质与目标生物物质可以直接键合，也可以经由与本发明的荧光标记生物物质及目标生物物质不同的其他生物物质键合。使用了本发明的荧光标记生物物质的生物体荧光成像并没有特别限定，例如能够举出荧光细胞染色。荧光细胞染色包括作为一抗使用荧光标记抗体的直接法和使作为荧光标记抗体的二抗与一抗进行反应而使用的间接法。本发明的荧光标记生物物质也能够用作直接法及间接法的任一者中的荧光标记抗体，优选用作间接法中的荧光标记抗体。
本发明的荧光标记生物物质与目标生物物质之间的键合并没有特别限制，能够按照常规方法进行。
在上述(iii)中，关于用于激励本发明的荧光标记生物体的波长，只要是能够激励本发明的荧光标记生物体的发光波长(激励波长)，则并没有特别限定。通常，优选为300～1000nm，更优选为400～800nm。
作为在本发明中使用的荧光激励光源，只要是发射能够激励本发明的荧光标记生物体的发光波长(激励波长)的光源，则并没有特别限定，能够使用各种激光光源。例如，可举出He-Ne激光器、CO
关于上述(i)～(iii)中的其他事项，并没有特别限制，能够适当选择通常使用的手法、试剂、装置等的条件。
使用了本发明的荧光标记生物物质的生物体荧光成像通过高度抑制本发明的荧光标记生物体与目标生物物质键合而成的物质的褪色，能够长期维持荧光强度而观察生物物质，并且即使在使用了高分辨率显微镜、超分辨率显微镜的情况下，也能够进行维持荧光强度的观察。
并且，本发明的荧光标记生物物质除上述以外，即使在染色细胞的长期保存等中，也能够适当调整保存条件而优选使用。
-取代基组T-
在本发明中，作为优选的取代基，可举出选自下述取代基组T中的取代基。
并且，在本说明书中，在仅记载为取代基的情况下，参考该取代基组T，在仅记载有各个基团例如烷基的情况下，优选适用该取代基组T的对应的基团。
而且，在本说明书中，在将烷基与环状(环)烷基区分记载的情况下，烷基以包含直链烷基及支链烷基的含义使用。另一方面，在未将烷基与环状烷基区分记载的情况及没有特别说明的情况下，烷基以包含直链烷基、支链烷基及环烷基的含义使用。这对于含有能够采用环状结构的基团(烷基、烯基、炔基等)的基团(烷氧基、烷硫基、烯氧基等)、含有能够采用环状结构的基团的化合物也相同。在基团能够形成环状骨架的情况下，形成环状骨架的基团的原子数的下限与关于能够采用该结构的基团在下述中具体地记载的原子数的下限无关，为3以上，优选为5以上。
在下述取代基组T的说明中，例如，如烷基和环烷基那样，为了明确直链或支链结构的基团和环状结构的基团，有时将它们分开记载。
作为取代基组T中所含有的基团，包括下述基团。
可举出烷基(优选为碳原子数1～30，更优选为碳原子数1～20，进一步优选为碳原子数1～12，进一步优选为碳原子数1～8，进一步优选为碳原子数1～6，尤其优选为碳原子数1～3)、烯基(优选为碳原子数2～30，更优选为碳原子数2～20，进一步优选为碳原子数2～12，进一步优选为碳原子数2～6，进一步优选为碳原子数2～4)、炔基(优选为碳原子数2～30，更优选为碳原子数2～20，进一步优选为碳原子数2～12，进一步优选为碳原子数2～6，进一步优选为碳原子数2～4)、环烷基(优选为碳原子数3～20)、环烯基(优选为碳原子数5～20)及芳基(可以是单环的基团，也可以是稠环的基团(优选为2～6环的稠环的基团)。在其为稠环的基团的情况下，由5～7元环等构成。芳基优选为碳原子数6～40，更优选为碳原子数6～30，进一步优选为碳原子数6～26，尤其优选为碳原子数6～10)、杂环基(作为环构成原子具有至少一个氮原子、氧原子、硫原子、磷原子、硅原子或硒原子，可以是单环的基团，也可以是稠环的基团(优选为2～6环的稠环的基团)。在其为单环的基团的情况下，该环元数优选为5～7元，更优选为5元或6元。杂环基的碳原子数优选为2～40，更优选为2～20。杂环基包含芳香族杂环基(杂芳基)及脂肪族杂环基(脂肪族杂环基)。)、烷氧基(优选为碳原子数1～20，更优选为碳原子数1～12)、烯氧基(优选为碳原子数2～20，更优选为碳原子数2～12)、炔氧基(优选为碳原子数2～20，更优选为碳原子数2～12)、环烷氧基(优选为碳原子数3～20)、芳氧基(优选为碳原子数6～40，更优选为碳原子数6～26，进一步优选为碳原子数6～14)、杂环氧基(优选为碳原子数2～20)、
烷氧基羰基(优选为碳原子数2～20)、环烷氧基羰基(优选为碳原子数4～20)、芳氧基羰基(优选为碳原子数6～20)、氨基(优选为碳原子数0～20，包含未取代氨基(-NH
酰氨基(优选为碳原子数1～20)、磺酰胺基(优选为碳原子数0～20，优选为烷基、环烷基或者芳基的磺酰胺基。)、烷硫基(优选为碳原子数1～20，更优选为碳原子数1～12)、环烷硫基(优选为碳原子数3～20)、芳硫基(优选为碳原子数6～40，更优选为碳原子数6～26，进一步优选为碳原子数6～14)、杂环硫基(优选为碳原子数2～20)、烷基、环烷基或者芳基磺酰基(优选为碳原子数1～20)、
甲硅烷基(优选为碳原子数1～30，更优选为碳原子数1～20，优选为烷基、芳基、烷氧基或者芳氧基取代的甲硅烷基。)、甲硅烷氧基(优选为碳原子数1～20，优选为由烷基、芳基、烷氧基或者芳氧基取代的甲硅烷氧基。)、羟基、氰基、硝基、卤原子(例如氟原子、氯原子、溴原子或碘原子)、氧原子(具体而言，将构成环的＞CH
并且，可举出羧基、膦酰基、磺基、鎓基、氨基酸残基、或具有聚氨基酸残基作为取代基的上述烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、环烷氧基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基羰基、环烷氧基羰基、芳氧基羰基、氨基、氨磺酰基、酰基、酰氧基、氨基甲酰基、酰氨基、磺酰胺基、烷硫基、环烷硫基、芳硫基、杂环硫基、烷基、环烷基或者芳基磺酰基。
选自取代基组T中的取代基更优选为烷基、烯基、环烷基、芳基、杂环基、烷氧基、环烷氧基、芳氧基、烷氧基羰基、环烷氧基羰基、氨基、酰氨基、氰基或卤原子，尤其优选为烷基、烯基、芳基、杂环基、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、酰氨基或氰基。
关于选自取代基组T中的取代基，只要没有特别说明，也包括组合多个上述基团而得的基团。例如，在化合物或取代基等包含烷基、烯基等时，它们可以被取代或未被取代。并且，在包含芳基、杂环基等时，它们可以是单环或稠环，可以被取代或未被取代。
实施例
以下，基于实施例，对本发明进一步详细地进行说明，但本发明并不限定于此。
在实施例及比较例中使用的化合物(1)～(24)、比较化合物(1)～(2)示于以下。另外，化合物(14)的结构式中的[]表示为重复结构。
[化学式47]
[化学式48]
比较化合物(1)为国际公开第2013/035303号的[0052]段中记载的化合物A。
比较化合物(2)为BODIPY(注册商标)496/512(Invitrogen Japan K.K.制、产品名)。
以下，对在各实施例中使用的化合物(1)～(24)及标记抗体(1)～(12)的合成方法进行详细说明，但起始物质、色素中间体及合成途径并不限定于这些。
在没有特别记载的情况下，硅胶柱色谱法中的载体使用了SNAP KP-SilCartridge(Biotage公司)、高闪柱W001、W002、W003、W004或W005〔YAMAZEN CORPORATION〕。NH二氧化硅使用了SNAP KP-NH Cartridge(Biotage公司)。洗脱液中的混合比为容量比。例如，“氯仿:甲醇＝90:10→50:50”是指将“氯仿:甲醇＝90:10”的洗脱液变更为“氯仿:甲醇＝50:50”的洗脱液。
分离薄层硅胶色谱法使用了PLC玻璃板硅胶F
代表性地为以下条件。
柱：Waters Corporation制BEHC 18 1.7μm，2.1x30mm
溶剂：A液：0.1％甲酸-水
B液：0.1％甲酸-乙腈
梯度循环：0.00min(A液/B液＝95/5)、2.00min(A液/B液＝5/95)、3.00min(A液/B液＝5/95)、3.01min(A液/B液＝100/0)、3.80min(A液/B液＝100/0)
流速：0.5ml/分钟
柱温度：室温
检测波长：254nm
另外，在本发明中，室温(r.t.)是指25℃。
并且，保持时间(RT)使用SQD(Waters Corporation)进行测定，并以分钟(min)表示。
各合成例中的记载具体如下。
RT(min)：保持时间(分钟)
MS谱图使用ACQUITY SQD LC/MS System〔Waters Corporation、离子化法：ESI(ElectroSpray Ionization、电喷雾离子化)〕或LCMS-2010EV〔同时进行(ShimadzuCorporation、离子化法：ESI及APCI(Atmospheric Pressure ChemicalIonization、大气压化学离子化)的离子化法〕进行了测定。
在没有特别记载的情况下，MS是指MS(ESI m/z)：[M+H]
微波反应装置使用了Initiator Sixty(Biotage公司)。
另外，关于各实施例中的荧光性化合物及比较化合物以及标记抗体，只要没有特别记载，在制作后不立即使用的情况下，使用了在遮光条件下保存的物质。并且，关于市售品的比较化合物及参考标记抗体，也使用了购入后直至使用为止在遮光条件下保存的物质。
〔化合物的合成〕
以下示出的用于各化合物的合成的缩写为下述化合物。
CPME：环戊基甲基醚
DDQ：2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌
DCC：二环己基碳二亚胺
HATU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
NBS：N-溴代琥珀酰亚胺
NHS：N-羟基琥珀酰亚胺
GABA：γ-氨基丁酸
PdCl
RuPhos：2-二环己基膦基-2’，6’-二异丙氧基联苯
TFA：三氟乙酸
DIPEA：二异丙基乙胺
DCM：二氯甲烷
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
PBS：磷酸缓冲生理盐水
THF：四氢呋喃
Anti-IgG：抗小鼠IgG抗体
Ac：乙酰基
Boc或BOC：叔丁氧基羰基
Bu：丁基
Me：甲基
Et：乙基
PEG：聚乙二醇
iPr：异丙基
TMS：三甲基甲硅烷基
[合成例1]
基于下述方案，合成了化合物(1)。
1)化合物(1-C)的合成
将下述化合物(1-A)、化合物(1-B)及化合物(1-C)分别按照Chem.Eur.J.2016,22,93-96中记载的方法、Org.Process Res.Dev.2015,19,1774-1783中记载的方法进行了合成。
[化学式49]
2)化合物(1)的合成
[化学式50]
2-1)化合物(1-D)的合成
向化合物(1-C)112mg的CPME溶液11ml中添加水0.02ml、2-(羟甲基)苯基硼酸76mg〔Wako Pure Chemical Industries,Ltd.〕、PdCl
MS(ESI m/z)：441(M+H)
RT(min)：1.83
2-2)化合物(1)的合成
向化合物(1-D)4.5mg的乙腈溶液2ml中添加氯磺酸3μL〔Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.〕，在室温下搅拌了5分钟。然后，直接利用分离薄层硅胶色谱法(甲醇:氯仿＝20:80)提纯反应液，获得了化合物(1)1mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：521(M+H)
RT(min)：1.19
[合成例2]
基于下述方案，合成了化合物(2)。
[化学式51]
在化合物(1)的合成法中，将2-(羟甲基)苯基硼酸变更为4-氟-2-(羟甲基)苯基硼酸[Combi-Blocks Inc.]，除此以外，以与化合物(1)的合成法相同的方式获得了化合物(2)1mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：557(M+H)
RT(min)：1.28
[合成例3]
基于下述方案，合成了化合物(3)。
[化学式52]
在化合物(1)的合成法中，将2-(羟甲基)苯基硼酸变更为5-氟-2-(羟甲基)苯基硼酸〔Luminescent Technologies Corp.〕，除此以外，以与化合物(1)的合成法相同的方式获得了化合物(3)1mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：557(M+H)
RT(min)：1.28
[合成例4]
基于下述方案，合成了化合物(4)和标记抗体(1)。
1)化合物(4)的合成
[化学式53]
将对甲酰基苯甲酸甲酯5g、吡咯36g放入300ml三颈烧瓶中，进行了氮气置换。利用冰浴使内温调节为10℃，一边搅拌一边滴加了三氟乙酸0.115ml。然后返回室温，搅拌了2小时。通过硅胶柱色谱法(洗脱液：乙酸乙酯/己烷＝0/100→50/50的梯度)提纯反应液，然后向提纯物加入己烷60ml和异丙醇3ml，并进行了搅拌。滤出沉淀物，利用己烷进行清洗之后使其干燥，由此获得了化合物(4-A)4.7g。
向500ml三颈烧瓶中加入化合物(4-A)4.7g、四氢呋喃80ml，在氮气下一边搅拌一边在丙酮-干冰浴中冷却至-60℃以下。滴加将N-溴代琥珀酰亚胺6.3g溶解于四氢呋喃60ml中而得的溶液，使其反应45分钟之后，接着滴加将2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌4.19g溶解于60ml的四氢呋喃中而得的溶液，使其反应了70分钟。然后，将四氢呋喃利用旋转蒸发器蒸馏而浓缩，获得了粗产物。将其溶解于二氯甲烷中，利用将乙酸乙酯/己烷＝0/100～40/60作为洗脱液的硅胶柱色谱法进行提纯，获得了化合物(4-B)4.0g。
向500ml三颈烧瓶中加入化合物(4-B)4.0g、二氯甲烷100ml，在氮气下一边搅拌一边利用涂满盐的冰浴冷却至0℃。加入N,N-二异丙基乙胺5.6ml，10分钟后加入三氟化硼二乙醚配合物6.3ml，在0℃下使其反应了30分钟。然后，滴加碳酸氢钠饱和水溶液100ml，进行了搅拌。提取有机层，利用旋转蒸发器进行了浓缩。溶解于最少量的二氯甲烷中，利用将乙酸乙酯/己烷＝0/100～100/0作为洗脱液的硅胶柱色谱法进行了提纯。将提纯物溶解于最小量的二氯甲烷中，加入甲醇，利用旋转蒸发器将二氯甲烷减压蒸馏去除，过滤了沉淀物。进行甲醇清洗，使滤物干燥，由此获得了化合物(4-C)3.0g。
向500ml三颈烧瓶中加入化合物(4-C)1.73g、CPME239ml、水0.4ml、氟化铯3.26g、邻(羟甲基)苯基硼酸1.82g，一边搅拌一边进行了除气及氮气置换。然后，加入PdCl
向300ml三颈烧瓶中加入了化合物(4-D)0.50g、甲苯9ml、吡啶0.2ml。在氮气下一边搅拌一边滴加乙酸酐0.2ml之后，在外温140℃下搅拌了4小时。使反应液返回到室温，加入乙酸0.1ml、蒸馏水9ml，搅拌30分钟之后，利用分液操作提取了有机层。利用将乙酸乙酯/己烷＝0/100→50/50作为洗脱液的硅胶柱色谱法进行提纯，获得了化合物(4-E)0.32g。
向100ml三颈烧瓶中加入化合物(4-E)50mg、二氯甲烷8ml，进行了氮气置换。一边搅拌一边添加氯磺酸0.013ml，使其在室温下进行反应。然后，加入碳酸钾0.111g、甲醇0.8ml、蒸馏水4ml，使其在室温下进行反应。将反应溶剂减压蒸馏去除，利用将乙腈/水＝0/100→25/75作为洗脱液的反相柱色谱法(Biotage SNAPColumn Ultra C18)进行提纯，获得了化合物(4-F)30mg。
向50ml茄形烧瓶中加入化合物(4-F)30mg、四氢呋喃(含有稳定剂)1ml，在氮气下一边搅拌一边加入三甲基硅烷醇钾23mg，在室温下使其反应了1.5小时。然后，加入蒸馏水2ml，利用将乙腈/水＝0/100→25/75作为洗脱液的反相柱色谱法(Biotage SNAPColumnUltra C18)进行提纯，获得了化合物(4)5mg。
MS(ESI m/z)：565(M-K+2H)
RT(min)：1.07
2)标记抗体(1)的合成
[化学式54]
向化合物(4)6mg的DMF溶液1ml中添加N-羟基琥珀酰亚胺3mg〔FUJIFILM WakoPure Chemical Corporation〕、二环己基碳二亚胺12mg〔FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation〕，在室温下搅拌了14小时。接着，直接利用反相二氧化硅柱色谱法〔SNAP12column Ultra C18、Biotage公司制〕(乙腈:水＝0:100→20:80)提纯反应液，回收馏分后使其冻结干燥，由此获得了化合物(4-NHS)3mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：662(M+H)
向抗小鼠IgG抗体〔主体(host)：山羊、2.4mg/ml、目录号：115-005-003、JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.制〕400μL中加入0.2M碳酸氢钠水溶液10μL、化合物(4-NHS)的浓度20mM的DMSO溶液3.2μL，搅拌后在室温下静置了1小时。接着，将反应液直接加入Sephadex G-25柱〔目录号：17085101、GE Healthcare制〕，利用PBS〔pH＝7.4、FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation〕提纯，由此获得了标记抗体(1)。
[合成例5]
基于下述方案，合成了化合物(5)和标记抗体(2)。
[化学式55]
向化合物(4-NHS)3mg的DMSO溶液43μL中加入二异丙基乙胺2μL〔FUJIFILM WakoPure Chemical Corporation〕、γ-氨基丁酸1mg〔FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation〕，在室温下搅拌了3.5小时。接着，直接利用反相二氧化硅柱色谱法〔SNAP12column Ultra C18、Biotage公司制〕(乙腈:水＝0:100→20:80)提纯反应液，回收馏分后使其冻结干燥，由此获得了化合物(5)2mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：650(M-2X+3H)
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(5)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(5-NHS)1mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：747(M-X+2H)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(5-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(2)。
[合成例6]
基于下述方案，合成了化合物(6)和标记抗体(3)。
[化学式56]
在从化合物(4-E)合成化合物(4)的方法中，将氯磺酸0.013ml变更为0.026ml，将反相柱色谱法的洗脱液中的乙腈/水＝25/75变更为10/90，除此以外，以相同的方式获得了化合物(6)0.3mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：645(M-2K+3H)
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(6)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(6-NHS)0.1mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：780(M-2K+3H)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(6-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(3)。
[合成例7]
基于下述方案，合成了化合物(7)和标记抗体(4)。
1)化合物(7)的合成
[化学式57]
将1L三颈烧瓶进行氮气置换，加入化合物(7-A)25g、DMAP17.55g、THF(超脱水、含有稳定剂)125ml、叔丁醇125ml，在室温下一边搅拌一边滴加了二碳酸二叔丁酯41.3g。搅拌4小时后，放置一晩，然后升温至70℃，加热并搅拌了1小时。返回到室温，通过减压浓缩将溶剂蒸馏去除，加入乙醇188ml、咪唑15.4g，搅拌了3小时。然后，将溶剂减压蒸馏去除，加入己烷200ml、乙酸乙酯265ml，在室温下搅拌了20分钟。滤出沉淀物，利用乙酸乙酯/己烷＝1/2的混合液240ml进行洗涤，获得了粗产物50g。将其溶解于二氯甲烷50ml中，加入己烷95ml，利用将乙酸乙酯/己烷＝0/100→5/95→15/85作为洗脱液的硅胶柱色谱法进行提纯，获得了化合物(7-B)18.2g。
将1L三颈烧瓶进行氮气置换，加入化合物(7-B)18.23g、THF(超脱水、含有稳定剂)414ml，一边搅拌一边使用干冰-丙酮浴冷却至-60℃以下。缓慢滴加正丁基锂36ml，使其反应30分钟，缓慢滴加DMF(超脱水)9ml并搅拌10分钟之后，升温至0～10℃并搅拌了2小时。滴加饱和的氯化铵水溶液200ml，搅拌30分钟之后，滴加了30％盐酸水10ml。将混合液转移至1L分液漏斗中，加入少量的乙酸乙酯和25％氯化钠水溶液，进行分液操作之后，加入硫酸镁并使其干燥，进行了自然过滤。将滤液的溶剂减压蒸馏去除，获得了粗产物19.11g。加入二氯甲烷30ml、己烷30ml制备溶液，利用将乙酸乙酯/己烷＝0/100→10/90→20/80作为洗脱液的硅胶柱色谱法进行提纯，获得了化合物(7-C)12.25g。
在化合物(4-E)的合成方法中，将对甲酰基苯甲酸甲酯变更为化合物(7-C)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(7-H)。并且，在从化合物(4-E)合成化合物(4-F)的方法中，将化合物(4-E)变更为化合物(7-H)，由此合成了化合物(7)。
MS(ESI m/z)：623(M-K)
2)标记抗体(4)的合成
[化学式58]
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(7)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(7-NHS)28mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：722(M-K+2H)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(7-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(4)。
[合成例8]
基于下述方案，合成了化合物(8)和标记抗体(5)。
[化学式59]
在从化合物(7-F)合成化合物(7)的方法中，将邻(羟甲基)苯基硼酸变更为化合物(8-A)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(8)。
MS(ESI m/z)：659(M-K)
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(8)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(8-NHS)20mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：758(M-K+2H)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(8-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(5)。
[合成例9]
基于下述方案，合成了化合物(9)和标记抗体(6)。
[化学式60]
在从化合物(7-F)合成化合物(7)的方法中，将邻(羟甲基)苯基硼酸变更为化合物(9-A)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(9)。
MS(ESI m/z)：683(M-K)
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(9)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(9-NHS)3mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：782(M-K+2H)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(9-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(6)。
[合成例10]
基于下述方案，合成了化合物(10)和标记抗体(7)。
1)化合物(10)的合成
[化学式61]
在化合物(7-B)的合成法中，将化合物(7-A)变更为化合物(10-A)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(10-B)。
在从化合物(7-C)合成化合物(7)的方法中，将化合物(7-C)变更为化合物(10-B)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(10)。
MS(ESI m/z)：591(M-K)
2)标记抗体(7)的合成
[化学式62]
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(10)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(10-NHS)13mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：690(M-K+2H)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(10-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(7)。
[合成例11]
基于下述方案，合成了化合物(11)和标记抗体(8)。
[化学式63]
在化合物(9)的合成法中，将化合物(7-F)变更为化合物(10-E)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(11)。
MS(ESI m/z)：651(M-K)
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(11)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(11-NHS)3mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：750(M-K+2H)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(11-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(8)。
[合成例12]
基于下述方案，合成了化合物(12)和标记抗体(9)。
[化学式64]
在化合物(5)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(7-NHS)且将γ-氨基丁酸变更为α-磺基-β-丙氨酸，除此以外，以相同的方式获得了化合物(12)2mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：776(M-X+2H)
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(12)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(12-NHS)0.4mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：873(M-2X+3H)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(12-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(9)。
[合成例13]
基于下述方案，合成了化合物(13)和标记抗体(10)。
[化学式65]
向化合物(15)3mg的DMSO溶液40μL中加入1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐5mg〔FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation〕、二异丙基乙胺2μL〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕、α-磺基-β-丙氨酸1mg〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕，在室温下搅拌了12小时。接着，直接利用反相二氧化硅柱色谱法〔SNAP12 column Ultra C18、Biotage公司制〕(乙腈:水＝0:100→20:80)提纯反应液，回收馏分后使其冻结干燥，由此获得了化合物(13)2mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：776(M-X+2H)
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(13)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(13-NHS)1mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：733(M-X+2H)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(13-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(10)。
[合成例14]
基于下述方案，合成了化合物(14)。
[化学式66]
在化合物(5)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(7-NHS)且将γ-氨基丁酸变更为(聚(乙二醇)2-氨基乙基醚)乙酸〔数均分子量＝1100、目录号：757861、Aldrich公司〕，除此以外，以相同的方式获得了化合物(14)4mg(红褐色油)。
MS(ESI m/z)：1959(M-X+2H)、1915(M-X+2H)、1871(M-X+2H)、1827(M-X+2H)、1783(M-X+2H)、1739(M-X+2H)
(从左起n＝28、27、26、25、24、23)
[合成例15]
基于下述方案，合成了化合物(15)。
[化学式67]
在从化合物(4-F)合成化合物(4)的方法中，将化合物(4-F)变更为化合物(15-A)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(15)。
MS(ESI m/z)：485(M+H)
[合成例16]
基于下述方案，合成了化合物(16)。
[化学式68]
向50ml茄形烧瓶加入化合物(15)8mg、牛磺酸6mg、DMF(超脱水)0.5ml，在氮气下进行了搅拌。向其中加入HATU14mg、DIPEA14μL，在室温下搅拌了一段时间。
MS(ESI m/z)：592(M-X+2H)
[合成例17]
基于下述方案，合成了化合物(17)及化合物(18)。
[化学式69]
在化合物(7-E)的合成方法中，将NBS及DDQ的当量变更为化合物(7-E)的合成中的一半，除此以外，以相同的方式合成了化合物(17-A)。
在从化合物(7-E)合成化合物(7)的方法中，将化合物(7-E)变更为化合物(17-A)，并将直至化合物(7)的合成为止使用的试剂的当量变更为一半，除此以外，以与化合物(7)的合成相同的方式合成了化合物(17)及化合物(18)。
MS(ESI m/z)：565(M-K)
[合成例18]
基于下述方案，合成了化合物(19)和标记抗体(11)。
[化学式70]
[化学式71]
在从化合物(7-F)合成化合物(7-G)的方法中，代替邻(羟甲基)苯基硼酸使用了1/2当量的化合物(9-A)和1/2当量的化合物(19-A)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(19-B)。
在从化合物(7-G)合成化合物(7)的方法中，代替化合物(7-G)使用了化合物(19-B)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(19)。
MS(ESI m/z)：671(M-K)
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(19)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(19-NHS)0.4mg(红褐色固体)。
MS(ESI m/z)：768(M-1)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(19-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(11)。
[合成例19]
基于下述方案，合成了化合物(20)。
[化学式72]
向100ml三颈烧瓶中加入化合物(4-C)0.5g、THF25ml、三乙基胺2ml、乙炔基苯甲醚0.137g、碘化铜7mg、二氯双(三苯基膦)钯(II)11mg，进行氮气置换之后，在外温75℃下使其反应了1小时。蒸馏去除反应后溶剂，利用将乙酸乙酯/己烷＝0/100→50/50作为洗脱液的硅胶柱色谱法进行提纯，获得了化合物(20-A)0.40g。
在化合物(15)的合成方法中，将化合物(15-A)替换为化合物(20-B)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(20-C)。
在从化合物(7-F)合成化合物(7-H)的方法中，将化合物(7-F)替换为化合物(20-A)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(20-D)。在从化合物(15-A)合成化合物(16)的方法中，将化合物(15-A)替换为化合物(20-D)，由此合成了化合物(20)。
MS(ESI m/z)：664(M-X)
[合成例20]
基于下述方案，合成了化合物(21)。
[化学式73]
向100ml三颈烧瓶中加入化合物(4-C)0.5g、2-甲基-1H-吡咯0.126g、甲苯5ml，进行氮气置换之后，在外温130℃下使其反应了2.5小时。返回到室温，利用将乙酸乙酯/己烷＝0/100→50/50作为洗脱液的硅胶柱色谱法进行提纯，获得了化合物(21-A)0.30g。
在化合物(20)的合成方法中，将化合物(20-A)替换为化合物(21-A)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(21)。
MS(ESI m/z)：613(M-X)
[合成例21]
基于下述方案，合成了化合物(22)。
[化学式74]
在从化合物(7-F)合成化合物(19)的方法中，代替化合物(7-F)使用了化合物(10-E)，除此以外，以相同的方式合成了化合物(22)。
MS(ESI m/z)：639(M-K)
[合成例22]
基于下述方案，合成了化合物(23)。
[化学式75]
向2ml耐压试验管中加入化合物(7-F)29mg、N-BOC-乙醇胺〔FUJIFILM Wako PureChemical Corporation〕26mg、RuPhos〔Aldrich公司〕9mg、乙酸钯〔FUJIFILM Wako PureChemical Corporation〕2mg、碳酸铯〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕65mg、环戊基甲基醚〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕0.5ml，利用微波反应装置〔Biotage公司〕在120℃下加热并搅拌了20分钟。利用分离薄层硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷＝50/50)提纯反应溶液，利用乙酸乙酯提取后在减压下蒸馏去除溶剂，获得了化合物(23-A)0.3mg。
MS(ESI m/z)：707(M+K)
向5ml茄形烧瓶中加入化合物(23-A)0.3mg、三氟乙酸〔FUJIFILM Wako PureChemical Corporation〕0.02ml、乙腈〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕0.02ml，在室温下搅拌了5分钟。利用分离薄层硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝80/20)提纯反应溶液，利用乙酸乙酯提取后在减压下蒸馏去除溶剂，获得了化合物(23)(极少量无法称量)。
MS(ESI m/z)：451(M+K)
[合成例23]
基于下述方案，合成了化合物(24)和标记抗体(12)。
[化学式76]
向50ml茄形烧瓶中加入3-(1H-吡咯-2-基)丙烷-1-醇〔Enamine BB公司〕0.93g、乙酸酐〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕0.77ml、吡啶〔FUJIFILM Wako PureChemical Corporation〕0.72ml、二氯甲烷〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕7.4ml，在室温下搅拌了1小时。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷＝0/100→20/80)提纯反应溶液，在减压下蒸馏去除溶剂，获得了乳白色固体的化合物(24-A)0.63g。
MS(ESI m/z)：168(M+K)
向50ml茄形烧瓶中加入合物(24-A)264mg、化合物(10-B)148mg、三氟乙酸〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕0.005ml、二氯甲烷〔FUJIFILM Wako PureChemical Corporation〕0.63ml，在室温下搅拌了10分钟。接着，将反应液冷却至0℃，利用二氯甲烷〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕5.7ml稀释之后，加入2,3-二氯-5,6-二氰基对苯醌〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕229mg，在0℃下搅拌了15分钟。接着，加入三氟硼烷-二乙醚配合物〔FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation〕0.87ml和二异丙基乙胺〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕0.77ml，在室温下搅拌了10分钟。加入饱和碳酸氢钠水之后，利用二氯甲烷提取4次，在减压下蒸馏去除了溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷＝0/100→20/80)提纯残渣，在减压下蒸馏去除溶剂，获得了化合物(24-B)226mg。
MS(ESI m/z)：595(M-K)
向5ml耐压试验管中加入化合物(24-B)10mg、二氯甲烷〔FUJIFILM Wako PureChemical Corporation〕1.4ml，冷却至0℃之后，添加氯磺酸〔FUJIFILM Wako PureChemical Corporation〕0.006ml，在0℃下搅拌了15分钟。接着，加入碳酸钾〔FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation〕20mg、蒸馏水0.7ml，在减压下仅蒸馏去除了二氯甲烷。向反应液中加入甲醇〔FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation〕0.1ml，利用微波反应装置〔Biotage公司制〕在80℃下加热并搅拌了10分钟。利用反相硅胶柱色谱法〔SNAP12column Ultra C18、Biotage公司制〕(乙腈:水＝0:100)提纯反应液，并通过冻结干燥去除溶剂，获得了橙色固体的化合物(24)1mg。
MS(ESI m/z)：575(M-K)
在化合物(4-NHS)的合成法中，将化合物(4)变更为化合物(24)，除此以外，以相同的方式获得了化合物(24-NHS)10mg(橙色固体)。
MS(ESI m/z)：672(M-K)
在标记抗体(1)的合成法中，将化合物(4-NHS)变更为化合物(24-NHS)，除此以外，以相同的方式获得了标记抗体(12)。
另外，在实施例化合物中，虽然没有特别记载，磺基及羧基包含盐结构(例如，钾盐、钠盐或者DIPEA盐)。
＜实施例1＞化合物的水溶性及耐光性评价
关于在上述中合成的化合物及比较化合物，评价下述特性，将其结果示于表1中。
[水溶性的评价]
向1.5ml的微量离心管中加入含有在上述中合成的化合物的DMSO溶液(20mM inDMSO(二甲基亚砜)、评价样品溶液)5μL和pH7.4的磷酸缓冲生理盐水(以下，也称为“PBS溶液”。)495μL进行混合，通过Multi-shaker MS 300(产品名、AS ONE Corporation制)以2000rpm搅拌了30分钟。将混合液在遮光下静置60分钟之后，进一步进行了离心沉淀(12000rpm、5分钟)。对于利用0.20μm的过滤器过滤的滤液，使用UHPLC Nexera〔(ShimadzuCorporation、Shim-pack XR-ODSII〕测定化合物浓度(在化合物全部溶解的情况下，化合物浓度成为200μM。)，基于以下评价基准进行了评价。
在本试验中，对于水溶性，评价等级“B”以上为合格。
-水溶性的评价基准-
A：100μM以上
B：1μM以上且少于100μM
C：0.1μM以上且少于1μM
D：水溶性低，无法测定浓度
[耐光性的评价]
将在上述中合成的化合物以吸收波长峰的吸光度成为0.095～0.105的方式溶解在PBS溶液(pH7.4)中。使用旋转木马光照射机〔Ushio Inc.的氙气灯UXL-500D-O、HA-50滤光片、Y44滤光片、曝光强度22mW/cm
在本试验中，对于耐光性，评价等级“C”以上为合格。
-耐光性的评价基准-
A：100小时以上
B：50小时以上且少于100小时
C：25小时以上且少于50小时
D：2小时以上且少于25小时
E：少于2小时
F：由于低水溶性，无法评价
[表1]
从上述表1的结果可知，本发明的由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物的水溶性优异，并且耐光性也优异。
并且，从与比较化合物(1)的比较可知，本发明的荧光性化合物所具有的亲水性基团不仅提高化合物的亲水性，还有助于提高耐光性。
如此，本发明的荧光性化合物是实现了兼顾充分的亲水性和优异的耐光性的、作为生物体荧光成像的荧光色素优选的化合物。
＜实施例2＞标记抗体的水溶性及耐光性评价
对于在上述中合成的标记抗体，评价水溶性及耐光性这两特性，将其结果示于表2中。
对于水溶性及耐光性，在上述实施例1中的水溶性及耐光性的评价中，代替化合物使用了标记抗体，除此以外，以相同的方式进行了评价。其中，对于本实施例2中的耐光性，评价等级“D”以上为合格。
[表2]
＜表注＞
参考标记抗体(1)是Alexa Fluor(注册商标)568标记抗小鼠IgG抗体(Abcam KK.制、产品名)。另外，推测该标记抗体中的Alexa Fluor 568为具有下述化学结构的荧光色素。在下述结构式中，*表示与抗小鼠IgG抗体的键合部位。
[化学式77]
从上述表2的结果可知，由本发明的由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物获得的本发明的标记抗体的水溶性优异，并且耐光性也优异。
如此，本发明的荧光标记生物物质实现兼顾充分的亲水性和优异的耐光性，作为在长时间、高分辨率下的生物体观察等生物体荧光成像的标记生物物质优选。
＜实施例3＞标记抗体在染色细胞中的耐光性评价
使用在上述中合成的标记抗体及比较标记抗体，如下进行了细胞染色。对于所制备的染色细胞，评价下述特性，将其结果示于表3中。
[染色细胞样品的制作]
将NCI-H460细胞〔目录号：HTB-177TM、ATCC(美国标准生物品收藏中心，Amer icanType Culture Collection)〕播种到滑腔中，并在含有10％的胎牛血清和1％的Penicilline/Streptomycin的RPMI-1640培养基〔均为Thermo Fisher Scientific Inc.〕中，在培养箱中培养了3天。
接着，除去培养基，使用4％多聚甲醛溶液进行20分钟处理，固定化之后，利用PBS〔Thermo Fisher Scientific Inc.〕进行清洗，使用浓度0.5％的TritonX-100(聚乙二醇单对异辛基苯基醚)的PBS溶液进行10分钟处理之后，利用PBS进行了清洗。接着，加入浓度1％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液进行30分钟处理之后，作为一抗加入抗α-Tubulin抗体〔小鼠单克隆、目录号：017-25031、FUJIFILM Wako Pu re Chemical Corporation〕稀释液，以抗体终浓度0.5μg/ml在室温下静置了1小时。利用PBS进行清洗之后，作为二抗加入10μg/ml的各标记抗体水溶液，一边遮光一边在室温下静置1小时，再次利用PBS进行清洗，由此获得了各染色细胞样品。
另外，下述耐光性的评价中，使用了刚制作的染色细胞样品。
[染色细胞中的耐光性的评价]
将各染色细胞样品设置于共焦激光显微镜〔TCS SP5、Raica.Co.,Ltd.制〕上，将光源的He-Ne激光器(输出100％)设为波长543nm，将检测设为波长554～773nm，实施了各4小时的时移测定。获取染色部4处、非染色部4处的荧光强度的时间分布，将从染色部的平均信号强度减去非染色部的平均信号强度而得的值作为净荧光强度。将曝光前的荧光强度设为100％，求出降低20％(荧光强度达到80％)为止的曝光时间，基于以下评价基准进行了评价。
-耐光性的评价基准-
A：4小时以上
B：3小时以上且少于4小时
C：2小时以上且少于3小时
D：1小时以上且少于2小时
E：少于1小时
[表3]
从上述表3的结果可知，与使用参考标记抗体(1)制作的染色细胞相比，使用利用本发明的由式(1)或式(4)表示的荧光性化合物标记的抗体制作的染色细胞显示出优异的耐光性。
如此，使用了本发明的荧光性化合物的荧光标记生物物质能够改善以往的具有二吡咯甲川硼配合物结构的化合物的缺点即耐光性，能够大幅提高作为在生物物质的成像或生物物质的检测中使用的荧光色素的通用性。
对于本发明与其实施方式一同进行了说明，但本发明人认为，只要没有特别指定，在说明的任何细节中也不会对本发明进行限定，在不违反所附的技术方案所示的发明的精神和范围的情况下，应该作广泛的解释。
本申请主张基于2018年6月1日在日本申请的日本申请2018-106460及2019年2月15日在日本申请的日本申请2019-025958的优先权，在此参考这些并将其内容作为本说明书的记载的一部分而引用于本申请中。