具有MAGE-B2特异性的T细胞受体及其用途

本申请要求于2018年4月19日提交的美国临时专利申请No.62/660,083的权益，其通过引用整体并入本文。

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技术领域

本发明总体上涉及医学和免疫学领域。更特别地，其涉及特异性识别黑素瘤相关抗原B2(MAGE-B2)的T细胞受体。

背景技术

基于T细胞的治疗已经显示出作为用于治疗许多癌症的方法的显著前景；遗憾的是，这种方法也受到针对常见癌症的免疫原性抗原靶标的缺乏和对非癌组织的潜在毒性的阻碍。这些基于T细胞的治疗可包括过继性细胞治疗(adoptive cell therapy，ACT)和/或诱导抗肿瘤T细胞应答的疫苗接种方法。癌症疫苗接种方法可包括使用肽、蛋白质、DNA或RNA疫苗对特异性抗原的递送，或者使用树突细胞(dendritic cell，DC)疫苗对抗癌应答的诱导。

ACT通常涉及将自体活化的肿瘤特异性T细胞输注到患者中，例如以治疗癌症。ACT已经在黑素瘤患者中引起治疗性临床应答。一般而言，为了产生有效的抗肿瘤T细胞应答，通常需要以下三个步骤：使抗原特异性T细胞致敏并活化，使活化的T细胞迁移至肿瘤部位，以及通过抗原特异性T细胞来识别并杀伤肿瘤。

靶抗原的选择对于诱导有效的抗原特异性T细胞是重要的。虽然已经鉴定了黑素瘤和少数其他实体瘤恶性肿瘤的数种肿瘤相关抗原，但是对于胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌和头颈癌的免疫原性靶标很少。缺乏在其表达模式上为免疫原性和肿瘤特异性二者(这是有效治疗癌症并避免实质性脱靶副作用所必需的特征)的靶抗原。因此，存在对于针对这些恶性肿瘤的另外的靶抗原的新的基于T细胞治疗的未得到满足的医学需求。

发明内容

本公开内容的某些实施方案提供了能够结合来源于黑素瘤相关抗原B2(MAGE-B2)的抗原肽的T细胞受体(T cell receptor，TCR)。在一个实施方案中，TCR包含与SEQ ID NO：3的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRα多肽，以及与SEQ ID NO：5的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRβ多肽。在另一个实施方案中，提供了包含以下的TCR：与CDR1(SEQ ID NO：7)、CDR2(SEQ ID NO：9)和CDR3(SEQ ID NO：11)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRα多肽，以及包含与CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：15)和CDR3(SEQ ID NO：17)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的TCRβ多肽。在一些特定方面中，TCR包含具有SEQ ID NO：3的序列的TCRα多肽，以及具有SEQ ID NO：5的序列的TCRβ多肽。

在另一个实施方案中，TCR包含与SEQ ID NO：19的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRα多肽，以及与SEQ ID NO：22的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRβ多肽。在另一个实施方案中，提供了包含以下的TCR：与CDR1(SEQ ID NO：23)、CDR2(SEQ ID NO：25)和CDR3(SEQ ID NO：27)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRα多肽，以及包含与CDR1(SEQ ID NO：29)、CDR2(SEQID NO：31)和CDR3(SEQ ID NO：33)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的TCRβ多肽。在一些特定方面中，TCR包含具有SEQ ID NO：19的序列的TCRα多肽，以及具有SEQ ID NO：22的序列的TCRβ多肽。

在一些方面中，抗原肽是HLA-A2限制性的。在一些方面中，抗原肽是HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204或HLA-A*0205限制性的。在一些特定方面中，抗原肽是HLA-A*0201限制性的。

在一些方面中，TCR是缺乏跨膜结构域的可溶性TCR。在某些方面中，TCR还包含可检测标记和/或治疗剂。

在另一个实施方案中，提供了多价TCR复合体，其包含多个根据所述实施方案的TCR(例如，能够结合来源于MAGE-B2的抗原肽的TCR)。在一些方面中，多价TCR包含2、3、4或更多个TCR。在某些方面中，多价TCR存在于脂双层中或附着于颗粒。在某些方面中，TCR通过接头分子缀合。

另一个实施方案提供了包含以下的多肽：与SEQ ID NO：3的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRα多肽和/或与SEQID NO：5的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRβ多肽。另一个实施方案提供了包含以下的多肽：与CDR1(SEQ ID NO：7)、CDR2(SEQ ID NO：9)和CDR3(SEQ ID NO：11)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRα多肽以及包含与CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ IDNO：15)和CDR3(SEQ ID NO：17)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的TCRβ多肽。在一些特定方面中，多肽包含SEQ ID NO：3的TCRα多肽以及SEQ ID NO：5的TCR β多肽。在一些方面中，多肽包含SEQ ID NO：3的TCRα多肽。在某些方面中，多肽包含SEQ ID NO：5的TCRβ多肽。本文中还提供了编码所述实施方案的多肽的多核苷酸。

另一个实施方案提供了包含以下的多肽：与SEQ ID NO：19的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRα多肽和/或与SEQID NO：22的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRβ多肽。另一个实施方案提供了包含以下的多肽：与CDR1(SEQ ID NO：23)、CDR2(SEQ ID NO：25)和CDR3(SEQ ID NO：27)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的TCRα多肽以及包含与CDR1(SEQ ID NO：29)、CDR2(SEQ ID NO：31)和CDR3(SEQ ID NO：33)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的TCRβ多肽。在一些特定方面中，多肽包含SEQID NO：19的TCRα多肽以及SEQ ID NO：22的TCRβ多肽。在一些方面中，多肽包含SEQ ID NO：19的TCRα多肽。在某些方面中，多肽包含SEQ ID NO：22的TCRβ多肽。本文中还提供了编码所述实施方案的多肽的多核苷酸。

在另一个实施方案中，提供了包含所述实施方案的TCR(例如，能够结合来源于MAGE-B2的抗原肽的TCR)的表达载体。在一些方面中，表达载体是病毒载体。在某些方面中，病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在另外的方面中，TCR包含接头结构域。在一些方面中，接头结构域位于TCRα多肽与TCRβ多肽之间。在某些方面中，接头结构域包含一个或更多个切割位点。在一些方面中，所述一个或更多个切割位点是弗林蛋白酶(Furin)切割位点和/或P2A切割位点。在一些方面中，所述一个或更多个切割位点被间隔区隔开。在一些特定方面中，间隔区是SGSG或GSG。在一些方面中，TCRα多肽与TCRβ多肽通过IRES序列连接。

本文中还提供了改造成表达所述实施方案的TCR(例如，能够结合来源于MAGE-B2的抗原肽的TCR)的宿主细胞。

在一些方面中，细胞是免疫细胞。在某些方面中，细胞是从脐带或血液分离的。在一些方面中，免疫细胞是T细胞或外周血淋巴细胞。在一些特定方面中，T细胞是CD8

本文中还提供了用于改造MAGE-B2特异性免疫细胞的方法，其包括使所述免疫细胞与所述实施方案的表达载体接触。在一些方面中，免疫细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞或NKT细胞。在一些方面中，接触进一步限定为转染或转导。在某些方面中，将外周血淋巴细胞用OKT3和IL-2刺激。在另外的方面中，所述方法还包括对免疫细胞进行分选以分离经TCR改造的T细胞、通过连续稀释进行T细胞克隆、以及通过快速扩增方案扩增T细胞克隆。

在另一个实施方案中，提供了治疗有效量的根据所述实施方案的MAGE-B2特异性TCR表达细胞用于治疗癌症的用途。本文中还提供了包含有效量的根据所述实施方案的MAGE-B2特异性细胞的组合物，其用于在对象中治疗癌症。在一些特定方面中，MAGE-B2特异性TCR表达细胞是T细胞。

在另一个实施方案中，提供了在对象中治疗癌症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的所述实施方案的MAGE-B2特异性细胞(例如，表达能够结合来源于MAGE-B2的抗原肽的TCR)。在一些方面中，MAGE-B2特异性细胞是T细胞。

在某些方面中，对象被鉴定为具有HLA-A2等位基因，例如HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204或HLA-A*0205等位基因。在某些方面中，对象被鉴定为具有HLA-A*0201等位基因。在另外的方面中，所述方法还包括在施用治疗有效量的MAGE-B2特异性T细胞之前对对象进行淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)的步骤。在一些方面中，治疗有效量的MAGE-B2特异性T细胞来源于具有抗肿瘤活性的自体肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocyte，TIL)的样品。在一些方面中，MAGE-B2特异性细胞静脉内、腹膜内或瘤内施用于对象。在一些特定方面中，对象是人。在一些方面中，所述方法还包括向对象施用至少一种另外的治疗剂的步骤。在某些方面中，所述至少一种另外的治疗剂选自化学治疗、放射治疗和免疫治疗。在一些方面中，所述至少一种另外的治疗剂是免疫治疗。在一些方面中，免疫治疗是免疫检查点抑制剂。在某些方面中，免疫检查点抑制剂抑制选自以下的免疫检查点蛋白或其配体：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR或腺苷A2a受体(A2a receptor，A2aR)。在一些方面中，免疫检查点抑制剂抑制PD-1或CTLA-4。

附图简述

以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参照这些附图中的一个或更多个结合本文中提出的一些具体实施方案的详细描述可更好地理解本发明。

图1：在肺癌细胞系和永生化正常人小气上皮细胞(HSAEC1-KT和HSAEC2-KT)中MAGE-B2表达的Western印迹检测。

图2：MAGE-B2 HLA-A2限制性肽特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)的产生。包含具有HLA-A2限制性MAGE-B2表位(GVYDGEEHSV)的四聚体的T细胞群的检测(左)。对CD8

图3A至3D：MAGE-B2 CTL克隆的杀伤能力检测。(图3A)用MAGE-B2肽脉冲的T2细胞的肽滴定测定。(图3B)通过

图4：经MAGE-B2 T细胞受体改造的T细胞(TCR-T)的产生。用逆转录病毒感染活化的同种异体PBMC(左)，并且在感染之后出现CD8

图5A至B：MAGE-B2 TCR-T杀伤能力测定。(图5A)肽滴定测定。用不同浓度的MAGE-B2肽脉冲的T2细胞。(图5B)通过标准

图6：使用胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining，ICS)进行的MAGE-B2 TCR-T功能检测。

图7：来自与健康供体PBMC共培养体系的树突细胞-T细胞(dendritic cell-Tcell，DC-T)的MAGE-B2特异性T细胞产物的代表性产生。使用MB2-231肽脉冲的DC进行2次刺激之后，在一个48孔板的3个孔中观察到小的CD8

图8A至8E：MAGE-B2特异性T细胞的功能亲合力。(图8A)以20∶1的效应物与靶标(E∶T)比进行的3种MAGE-B2 CTL细胞系裂解用多种浓度的MB2-231肽脉冲的T2细胞。(图8B)以多种E∶T比进行的3种MAGE-B2 CTL细胞系裂解MAGE-B2表达肿瘤细胞系H2023(HLA-A2

图9A至9E：MAGE-B2 TCR-T的产生和功能亲合力。(图9A)用包含来自高功能CTL细胞系MB2-231C5的TCR-T基因的逆转录病毒感染之前、感染之后、以及四聚体引导的分选和扩增之后的TCR-T的四聚体检测。(图9B)以20∶1的效应物与靶标(E∶T)比进行的MB2-231C5TCR-T裂解用多种浓度的MB2-231肽脉冲的T2细胞。(图9C)MB2-231C5TCR-T裂解MAGE-B2表达肿瘤细胞系H2023(HLA-A2

图10A至10C：使用胞内细胞因子染色(ICS)测定进行的MB2-231C5 TCR-T的功能检测。将MB2-231 C5 TCR-T与以下以E∶T＝10∶1比共培养：用MB2-231肽/M26肽脉冲的T2，肿瘤细胞系H2023(MAGE-B2

发明详述

黑素瘤相关抗原B2(MAGE-B2)，也称为癌症/睾丸抗原3.2(UniProt No.O15479)(CT3.2)，由位于X染色体上的基因编码。如通过蛋白质和RNA水平测量的，MAGE-B2在睾丸中表达，但在其他正常组织中不表达。MAGE-B2在数种癌症中过表达，所述癌症包括肺癌、肝癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤和结直肠癌。一种HLA-A2(例如，HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204或HLA-A*0205)限制性肽(GVYDGEEHSV，SEQ ID NO：1)已经从卵巢癌细胞中洗脱并鉴定出(Barnea gt al.，2002)。该表位还从多形性胶质母细胞瘤细胞T98G和U-87的多肽组(peptidome)分析鉴定出(Shraibman et al.，2016)。

使用MAGE-B2肽表位，在本研究中从识别HLA匹配的同种异体肿瘤细胞系上的内源性呈递抗原的患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)产生抗原特异性CTL。已表明通过呈递该HLA-A2限制性MAGE-B2肽的抗原呈递细胞刺激的这些抗原特异性CTL针对肺癌细胞具有选择性的细胞毒性。

因此，在某些方面中，本公开内容提供了识别并特异性结合MAGE-B2HLA-A2限制性表位GVYDGEEHSV(SEQ ID NO：1)的TCR。本公开内容还提供了编码该TCR的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的表达载体，其可用于修饰初始T细胞并产生MAGE-B2特异性T细胞。本公开内容还提供了MAGE-B2特异性T细胞用于治疗，例如对其恶性细胞表达MAGE-B2抗原的癌症患者(例如HLA-A2阳性癌症患者)的过继性细胞治疗的用途。本文中提供的抗原特异性T细胞(例如CTL)可用于靶向实体癌症。

I.定义

除非上下文另有清楚地说明，否则本文中和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。因此，例如，对“细胞”的提及包括多个这样的细胞，并且对“肽”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或更多种肽及其等同物(例如，多肽)的提及。

除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则本文中和所附权利要求书中使用的术语“或/或者”意指“和/或”。

本文中和所附权利要求书中使用的术语“另一个/种”可意指至少第二个/种或更多个/种。

本文中使用的术语“约/大约”指示特定值或量度包括与用于获得量度、用于计算值的装置相关的固有变化，或者研究对象之间存在的天然变化。

对于溶液(例如，一种或更多种蛋白质、聚合物或小分子的制剂)的组分，本文中使用的术语“基本上不含”意指该制剂未配制成包含该组分，或这样的组分仅以痕量(例如，作为污染物)存在。在某些实施方案中，如果制剂包含小于0.05％(w/w)的该组分，则目的分子的制剂基本上不含该特定组分。在某些实施方案中，如果制剂包含小于0.01％(w/w)的该组分，则目的分子的制剂基本上不含该特定组分。在某些实施方案中，如果使用标准分析方法(例如，UV分光光度法、质谱、核磁共振波谱法等)在制剂中未检测到特定组分的量，则目的分子的制剂基本上不含该特定组分。

对于溶液或悬浮液(例如，一种或更多种细胞类型、蛋白质、聚合物或小分子的制剂)的组分，本文中使用的术语“富集”意指该制剂配制成包含高于正常浓度或多于正常数目的组分(例如，淋巴细胞的悬浮液对于效应T淋巴细胞可以是富集的)。

本文中使用的术语“治疗”及其变化形式等是指通过例如向对象施用治疗剂，或者通过对对象进行手术、临床或其他医学操作来在对象中改善、减轻或以其他方式缓解疾病或病症的症状的过程。

本文中使用的术语“对象”或“患者”在本文中可互换使用以指代个体，例如人或非人生物体，例如灵长类、哺乳动物或脊椎动物。

本文中使用的术语“治疗有效的”或“治疗有益的”等是指改善、缓和或以其他方式减轻疾病、障碍或病症的一种或更多种症状的治疗剂，或者手术、临床或其他医学操作，从而通过例如降低疾病、障碍或病症的迹象或症状的频率或严重程度来增强患有疾病、障碍或病症的对象的健康。因此，治疗有效的或治疗有益的癌症治疗可例如降低肿瘤的尺寸、降低肿瘤的生长速率、降低肿瘤扩散或转移的可能性。

本文中使用的术语“可药用”或“药理学上可接受的”是指当施用于哺乳动物或脊椎动物对象时不产生不良反应、变应性反应或其他不期望反应的治疗剂的药物制剂。这样的制剂应遵照FDA生物标准办公室(FDA Office ofBiological Standards)所要求的无菌性、致热原性(pyrogenicity)、纯度和任何其他相关标准的良好操作规范(goodmanufacturing practice，GMP)标准来配制。

本文中使用的术语“可药用载体”是指用于配制用于递送至哺乳动物或脊椎动物对象的治疗剂的任何和所有化学化合物或溶剂，例如如水性溶剂(例如水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外载剂(例如氯化钠、林格右旋糖(Ringer’s dextrose)等))、非水溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯(例如油酸乙酯))、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等张剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、流体和营养补充剂、及其任意组合，如本领域普通技术人员将已知的。

本文中使用的术语“单位剂量”、“剂量(dose)”或“剂量(dosage)”是指适合于施用于哺乳动物或脊椎动物对象的包含预定量药剂的治疗剂的制剂，所述预定量药剂在通过合适的途径并根据期望的治疗方案施用时预期在对象中是治疗有效的。待施用于对象的特定治疗剂的实际剂量可由健康护理提供者根据多种物理和生理参数凭经验确定，所述参数包括例如对象的体重、年龄、健康、和性别、所治疗疾病的类型、疾病进展的程度、先前或同时的治疗性干预、施用途径，以及特定治疗性物质的效力、稳定性和毒性。

II.MAGE-B2 TCR方法和组合物

在某些实施方案中，本公开内容提供了包含序列GVYDGEEHSV(SEQ ID NO：1)的MAGE-B2肽表位。MAGE-B2肽表位可与T细胞群接触或用于刺激T细胞群以诱导识别或结合MAGE-B2肽表位的T细胞的增殖。MAGE-B2肽表位可施用于对象(例如人患者)以增强对象针对癌症的免疫应答。MAGE-B2肽表位可包括在主动免疫治疗(例如，癌症疫苗)或被动免疫治疗(例如，过继性细胞治疗)中。主动免疫治疗包括用纯化的肿瘤抗原或MAGE-B2肽表位(天然或经修饰的)对对象进行免疫接种。或者，可将用MAGE-B2肽表位脉冲(或用编码肿瘤抗原的基因转染)的抗原呈递细胞施用于对象。MAGE-B2肽表位可以是经修饰的或包含一个或更多个突变，例如如替换突变。过继性细胞治疗可涉及向对象施用细胞，其中所述细胞(例如，细胞毒性T细胞)已经在体外针对MAGE-B2肽表位致敏。

特别地，可在短时间段(例如6至8周)内离体活化并扩增T细胞用于过继性细胞治疗。可例如使用四聚体引导的分选和快速扩增方案(REP)从分离自外周血的T细胞(例如，CD4

在另一种方法中，抗原特异性细胞可通过使用本文中提供的MAGE-B2 TCR(例如，SEQ ID NO：2至5或18至22)来产生。在该方法中，将TCR序列插入到载体(例如，逆转录病毒或慢病毒载体)中，将所述载体引入到宿主细胞，例如T细胞(例如，CD4

下面提供了MAGE-B2肽表位和TCR序列。

·肽表位：GVYDGEEHSV(SEQ ID NO：1)

·α链(TRAV9-2*01F)：

·α链

·β链(TRBV15*02F)

·β链

·α链CDR1

·α链CDR2

·α链CDR3

·β链CDR1

·β链CDR2

·β链CDR3

下面提供了MAGE-B2-231 C5 TCR序列。信号肽加有下划线并且可变区以斜体示出。

·α链(TRAV10*01)：

·α链

·β链(TRBV11-3*04)

·β链

·α链CDR1

·α链CDR2

·α链CDR3

·β链CDR1

·β链CDR2

·β链CDR3

A.MAGE-B2肽

在一些方面中，本公开内容包含MAGE-B2肽表位。MAGE-B2肽表位可具有HLA-A2限制性MAGE-B2肽的氨基酸序列GVYDGEEHSV；SEQ ID NO：1。MAGE-B2肽表位可具有与SEQ IDNO：1的肽序列具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100百分比序列同一性的氨基酸序列。

MAGE-B2肽表位可包含以下或由以下组成：7至35个氨基酸，优选8至35个氨基酸残基，并且甚至更优选8至25个氨基酸，或者长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，或可从其中来源的任何范围。例如，在一些实施方案中，本公开内容的MAGE-B2肽表位可包含SEQ ID NO：1的MAGE-B2肽表位或由其组成。抗原肽可包含免疫反应性MAGE-B2肽表位，并且可包含另外的序列。另外的序列可来源于天然抗原并且可以是异源的，并且这样的序列可以(但不需要)是免疫原性的。在一些实施方案中，MAGE-B2肽表位可选择性地与HLA-A2，特别是HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204或HLA-A*0205结合。

如本领域技术人员将理解的，MHC分子可结合不同尺寸的肽，但通常不结合全长蛋白质。尽管MHC I类分子传统上被描述为与8至11个氨基酸长的肽结合，但是已显示，长度为15个氨基酸的肽可通过在结合位点的中间凸出(bulging)或延伸到MHC I类结合沟之外而与MHC I类分子结合。如技术人员将立刻理解的，天然存在的全长肿瘤抗原(例如MAGE-B2)将不可用于选择性结合II类MHC，使得该抗原被内吞并且产生T细胞增殖。一般而言，天然存在的全长肿瘤抗原蛋白质不展现这些特性并将因此不可用于这些免疫治疗目的。

在某些实施方案中，MAGE-B2肽表位是免疫原性或抗原性的。如以下实例中所示出的，本公开内容的MAGE-B2肽表位可促进T细胞的增殖。

MAGE-B2肽表位可以是重组肽、合成肽、纯化肽、固定化肽、可检测经标记肽、包封肽或经载体表达肽(例如，由在载体中的核酸编码的肽，所述载体包含与该核酸可操作地连接的异源启动子)。在一些实施方案中，可向对象(例如人患者)施用合成的MAGE-B2肽表位以在对象中诱导免疫应答。与重组表达肽相比，合成肽可展现出某些优点，例如细菌污染的风险降低。MAGE-B2肽还可包含在配制成用于施用于哺乳动物或人对象的药物组合物(例如如疫苗组合物)中。

1.细胞渗透肽

在一些实施方案中，免疫治疗可使用与细胞渗透剂(例如脂质体或细胞渗透肽(cell penetrating peptide，CPP))缔合的本公开内容的MAGE-B2肽表位。用肽脉冲的抗原呈递细胞(例如树突细胞)可用于增强抗肿瘤免疫。在一些实施方案中，免疫治疗可使用编码本公开内容的MAGE-B2肽表位的核酸，其中所述核酸例如在病毒载体或非病毒载体中递送。

可与肿瘤抗原特异性肽(例如，MAGE-B2肽)共价结合的细胞渗透肽包括例如HIVTat、疱疹病毒VP22、果蝇触角足(Drosophila Antennapedia)同源框基因产物、信号序列、融合序列或抗微生物肽I(protegrin I)。使肽与CPP共价结合可延长树突细胞对肽的呈递，由此增强抗肿瘤免疫。在一些实施方案中，本公开内容的MAGE-B2肽(例如包含在肽或多表位串内)可与CPP共价结合(例如通过肽键)以产生融合蛋白。在另一些实施方案中，MAGE-B2肽表位或编码该肽表位的核酸可被包封在脂质体(例如多层、囊泡状或多囊泡状脂质体)，胞外囊泡或外排体内或者与其缔合。

在一些实施方案中，通过使脂质(例如硬脂酸酯或豆蔻酸酯)与多肽附接来促进细胞摄取。已经显示，脂化(lipidation)增强了肽向细胞中的进入。脂质部分的附接是本公开内容提高细胞的多肽摄取的另一种方式。细胞摄取在以下进一步讨论。

本公开内容的MAGE-B2肽表位可包含在脂质体疫苗组合物中。例如，脂质体组合物可以是脂蛋白体组合物(proteoliposomal composition)或包含脂蛋白体组合物。

在一些实施方案中，MAGE-B2肽表位可与纳米粒缔合以形成纳米粒-多肽复合体。在一些实施方案中，纳米粒是脂质体或其他基于脂质的纳米粒，例如基于脂质的囊泡(例如，DOTAP∶胆固醇囊泡)。在另一些实施方案中，纳米粒是基于铁氧化物的超顺磁性纳米粒。在一些实施方案中，纳米粒是半导体纳米晶体或半导体量子点，其二者均可用于光学成像。在另一些实施方案中，纳米粒可以是在二氧化硅核芯之上包含金层的纳米壳。

2.生物功能等同物

本公开内容的MAGE-B2肽表位可被修饰以包含不改变其分别与HLA类蛋白(例如HLA-A2)结合区的相互作用的氨基酸替换、插入和/或缺失。作为一个非限制性实例，在本文中公开的MAGE-B2肽中的某些氨基酸可被替换为其他氨基酸而没有可观的HLA结合的损失，如通过与HLA-A2结合的可检测地未改变的肽所表明的。因此应想到，在序列和/或结构上被修饰但生物效用或活性未改变的本文中公开的MAGE-B2肽(或编码这样的肽的核酸)仍在本文中公开的组合物和方法的范围之内。

技术人员还充分理解的是，生物功能等同肽的定义所固有的是以下概念：存在对可在分子的限定部分中做出的改变的数目限制，同时仍然维持可接受水平的等同生物活性。因此，本文中将生物功能等同肽定义为其中某些(不是大部分或所有)氨基酸可被替换的那些肽。当然，根据本公开内容可容易地制造和使用具有不同替换的多种独特肽。

技术人员还意识到，在显示某些残基(例如在特定表位中的残基)对肽的生物或结构特性特别重要的情况下，这样的残基通常可不进行交换。这在本公开内容中可以是这样的情况，如本文中公开的MAGE-B2肽中的突变可导致物种特异性的丧失并且继而降低所得肽用于本公开内容的方法中的效用。因此，抗原性的(例如，特异性地结合HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204或HLA-A*0205)并且包含保守氨基酸替换的肽被理解为包含在本公开内容中。保守替换最不可能彻底地改变蛋白质的活性。“保守氨基酸替换”是指用化学上类似的氨基酸置换氨基酸，即，用其他非极性氨基酸置换非极性氨基酸；用其他极性氨基酸替换极性氨基酸；用其他酸性氨基酸替换酸性残基，等。

氨基酸替换(例如可用于修饰本文中公开的MAGE-B2肽的那些)通常基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。对氨基酸侧链取代基的尺寸、形状和类型的分析揭示，精氨酸、赖氨酸和组氨酸全部是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸全部具有类似的尺寸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸全部具有大致类似的形状。因此，基于这些考虑，本文中将精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸定义为生物功能等同物。在一些实施方案中，突变可增强TCR-pMHC相互作用和/或肽-MHC结合。

本公开内容还考虑了本文中公开的MAGE-B2肽的同种型(isoform)。同种型包含与本公开内容的肽相同数目和种类的氨基酸，但同种型具有不同的分子结构。本公开内容所考虑的同种型是与本文中所述的本公开内容的肽具有相同特性的那些。

可通过对现有氨基酸进行化学修饰或通过从头合成本文中公开的肽在蛋白质中并入非标准氨基酸。非标准氨基酸是指在化学结构上与由遗传密码所编码的二十种标准氨基酸不同的氨基酸。

在一些实施方案中，本公开内容考虑了本文中公开的MAGE-B2肽的化学衍生物。“化学衍生物”是指具有一个或更多个通过功能性侧基的反应而化学衍生化的残基并且保留生物活性和效用的肽。这样的衍生化肽包括，例如，其中游离氨基已被衍生化以形成特定盐或通过烷基化和/或酰化来衍生对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基、甲酰基或乙酰基等的那些。游离羧基可被衍生化以形成有机或无机盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼并且优选酰胺(伯胺或仲胺)。化学衍生物可包括包含二十种标准氨基酸中的一种或更多种天然存在氨基酸衍生物的那些肽。例如，可将4-羟脯氨酸替换为丝氨酸；以及可将鸟氨酸替换为赖氨酸。

应注意，所有氨基酸残基序列在本文中均用其左右取向为氨基末端至羧基末端的常规方向的式来表示。此外，应注意，在氨基酸残基序列的起点或末端的短划线表示与具有一个或更多个氨基酸残基的另外序列的肽键。本文中所述的氨基酸优选是“L”异构体形式。然而，“D”异构体形式中的残基可被替换为任何L-氨基酸残基，只要蛋白质保留本文中所述的期望功能特性即可。

优选的MAGE-B2肽或其类似物优选特异性地或优先地结合HLA-A2。确定特定肿瘤抗原特异性肽或经标记肽或者其类似物是否可结合或以何种程度可结合HLA-A2，并且可使用例如如以下的体外测定来进行评估：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、免疫染色、胶乳凝集(latex agglutination)、间接血凝测定(indirect hemagglutination assay，IHA)、补体结合(complement fixation)、间接免疫荧光测定(FA)、浊度法(nephelometry)、流式细胞术测定、化学发光测定、侧流免疫测定、u-捕获测定、质谱测定、基于颗粒的测定、抑制测定和/或亲合力测定。

B.经改造的MAGE-B2特异性细胞

在一些实施方案中，本公开内容提供了MAGE-B2特异性TCR。TCR可包含SEQ ID NO：6至12的α链CDR和/或SEQ ID NO：13至17的β链CDR。TCR可包含与SEQ ID NO：2至3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或相似性的α链和或与SEQ ID NO：4至5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或相似性的β链。本文中还提供了多肽以及编码本文中提供的MAGE-B2 TCR的α链和/或β链的多核苷酸。本文中还提供了改造成表达本文中提供的MAGE-B2特异性TCR的细胞，例如T细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、MSC或iPS细胞。这些非T细胞效应免疫细胞可表达TCR以及CD3分子或与TCR连接的其他信号传导结构域，其将在这些细胞中启动信号转导。

可使用本领域技术人员已知的许多公认的基因转移方法中的任一种来构建经改造的免疫细胞。在某些实施方案中，使用基于病毒载体的基因转移方法以引入编码MAGE-B2特异性TCR的核酸来构建经改造的细胞。基于病毒载体的基因转移方法可包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒或腺相关病毒载体。在某些实施方案中，使用基于非病毒载体的基因转移方法以引入编码MAGE-B2特异性TCR的核酸来构建经改造的细胞。用于TCR的载体可包含α链多肽和β链多肽，其可通过接头结构域或IRES序列连接。接头结构域可包含一个或更多个切割位点，例如弗林蛋白酶切割位点和/或P2A切割位点，其可被间隔区，例如SGSG或GSG隔开。在某些实施方案中，基于非病毒载体的基因转移方法包括选自以下的基因编辑方法：锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)核酸酶。在某些实施方案中，基于非病毒载体的基因编辑方法包括选自以下的转染或转化方法：脂质体转染、核转染、病毒微体、脂质体、聚阳离子或脂质∶核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒体和增强DNA摄取的试剂。

C.可溶性TCR和BiTE

另外，本公开内容提供了可用于直接治疗HLA-A2阳性癌症患者的可溶性TCR。可溶性双特异性T细胞接合分子(bispecific T cell-engaging molecule，BiTE)可通过将MAGE-B2 TCR与CD3特异性Fab片段连接来产生。这些双特异性分子可通过其MAGE-B2 TCR与肽/HLA复合体结合来结合肿瘤细胞表面，并且CD3特异性Fab片段将交联例如靶T细胞上的TCR。这将导致细胞活化和靶细胞的消除。因此，这些可溶性双特异性TCR构建体可直接用于治疗癌症患者。

最后，可溶性TCR可用作用于肿瘤细胞中的肽/MHC的诊断评价的探针，或者用于将治疗分子引导至肿瘤部位。该可溶性TCR分子也可用示踪剂(例如荧光探针或放射性探针)进行标记，并随后用于肿瘤细胞中肽/MHC的呈递的诊断评价。此外，该可溶性TCR分子可与治疗分子(例如毒素)连接，并随后将这些治疗分子引导至肿瘤部位以治疗癌症患者。

在一些实施方案中，本公开内容提供了可溶性TCR，例如本文中提供的MAGE-B2特异性TCR。可溶性TCR可用于研究特定TCR-pMHC相互作用，或者用作检测感染或用于检测自身免疫病标志物的诊断工具。可溶性TCR可应用于染色，例如用于针对在MHC背景下呈递的特定肽抗原的存在而对细胞进行染色。类似地，可溶性TCR可用于将治疗剂(例如细胞毒性化合物或免疫刺激化合物)递送至呈递特异性抗原的细胞。可溶性TCR还可用于抑制T细胞，例如，与自身免疫肽抗原反应的那些。在一些方面中，TCR与将邻近处细胞递送至肿瘤的另一个分子连接。在另一些方面中，TCR将毒素、细胞因子、共刺激配体或抑制剂配体递送至并且将分子、细胞或化合物引导至表达肽-MHC的靶细胞。

在一些方面中，本公开内容提供了可溶性T细胞受体(soluble T cell receptor，sTCR)，其包含：(i)TCRα链(例如SEQ ID NO：2或3)的全部或部分，除其跨膜结构域之外，以及(ii)TCRβ链(例如，SEQ ID NO：4或5)的全部或部分，除其跨膜结构域之外，其中(i)和(ii)各自包含TCR链的功能可变结构域和至少一部分的恒定结构域，并且通过天然TCR中不存在的恒定结构域残基之间的二硫键连接。

在一些方面中，可溶性TCR包含通过一对C端二聚肽(例如亮氨酸拉链)而分别二聚成TCRβ或δ链胞外结构域的TCRα或γ链胞外结构域。

本公开内容的可溶性TCR可以以基本上纯的形式或作为经纯化或经分离的制剂提供。例如，其可以以基本上不含其他蛋白质的形式提供。

本公开内容的多种可溶性TCR可以以多价复合体提供。因此，在一个方面中，本公开内容提供了多价TCR复合体，其包含多种如本文中所述的可溶性TCR。所述多种可溶性TCR中的每一种优选是相同的。

在其最简单的形式中，根据本公开内容的多价TCR复合体包含优选通过接头分子的两个或三个或四个或更多个T细胞受体分子彼此缔合(例如共价地或以其他方式连接)的多聚体。合适的接头分子包括但不限于多价附接分子，例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和extravidin，它们各自具有针对生物素的四个结合位点。因此，生物素化的TCR分子可形成到具有多个TCR结合位点的TCR的多聚体中。多聚体中TCR分子的数目将取决于与用于制造该多聚体的接头分子的量相关的TCR的量，并且还取决于是否存在任何其他生物素化的分子。优选的多聚体是二聚体、三聚体或四聚体TCR复合体。

用于本发明方法中的合适的结构包括膜结构，例如脂质体；以及固体结构，其优选颗粒，例如珠(例如胶乳珠)。可在外部包被有T细胞受体分子的其他结构也是合适的。优选地，所述结构包被有T细胞受体多聚体而不是包被有单独T细胞受体分子。

在脂质体的情况下，T细胞受体分子或其多聚体可与膜附接或以其他方式与膜缔合。针对于此的技术是本领域技术人员公知的。

标记或另外的部分(例如毒性或治疗部分)可包含在本公开内容的多价TCR复合体中。例如，标记或另外的部分可包含在混合的分子多聚体中。这样的多聚体分子的一个实例为四聚体，其包含三个TCR分子和一个过氧化物酶分子。这可通过以3∶1的摩尔比来混合TCR和酶以产生四聚体复合体并从任何不包含正确比的分子的复合体中分离所期望的复合体来实现。这些经混合的分子可包含任何分子组合，条件是位阻不会损害或不会显著地损害分子的所期望功能。由于不太可能发生位阻，链霉抗生物素蛋白分子上的结合位点的定位适合于经混合的四聚体。

作为替代或补充，本公开内容的TCR(或其多价复合体)可与治疗剂缔合(例如与其共价地或以其他方式连接)，所述治疗剂可以是例如用于细胞杀伤中的毒性部分，或者免疫刺激剂(例如白介素或细胞因子)。与非多聚体的T细胞受体异二聚体相比，本公开内容的多价TCR复合体可具有针对TCR配体的增强的结合能力。因此，根据本公开内容的多价TCR复合体特别可用于在体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，并且还可用作用于产生具有这样的用途的另外的多价TCR复合体的中间体。因此，TCR或多价TCR复合体可以以可药用制剂提供以用于体内。

本公开内容还提供了用于将治疗剂递送至靶细胞的方法，所述方法包括使潜在的靶细胞与根据本公开内容的TCR或多价TCR复合体在使TCR或多价TCR复合体与靶细胞附接的条件下接触，所述TCR或多价TCR复合体对TCR配体具有特异性并且具有与之缔合的治疗剂。

特别地，可溶性TCR或多价TCR复合体可用于将治疗剂递送至呈递特定抗原的细胞的位置。这将可用于许多情况，并且特别是针对肿瘤。可递送治疗剂以使其在局部但不仅在其结合的细胞上发挥其作用。因此，一种特定策略设想了与对肿瘤抗原具有特异性的T细胞受体或多价TCR复合体连接的抗肿瘤分子。

许多治疗剂可用于该用途，例如放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化学治疗剂(例如顺铂)。为了确保在所期望的位置中进行毒性作用，毒素可在与链霉抗生物素蛋白连接的脂质体内部，使得化合物缓慢地释放。这将防止在体内转运期间的损伤作用，并确保毒素在TCR与相关抗原呈递细胞结合之后具有最大效果。

本公开内容的可溶性TCR可用于通过与特异性TCR配体结合并从而抑制T细胞活化来调节T细胞活化。涉及T细胞介导的炎症和/或组织损伤的自身免疫病(例如I型糖尿病)将适用于该方法。对于该用途，需要了解由相关pMHC呈递的特异性肽表位。

还设想了本公开内容的可溶性TCR和/或多价TCR复合体在制备用于治疗癌症或自身免疫病的组合物中的用途。

还提供了治疗癌症或自身免疫病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的本公开内容的可溶性TCR和/或多价TCR复合体。

如在抗癌和自身免疫治疗中常见的，本公开内容的可溶性TCR可与其他药剂组合用于治疗癌症和自身免疫病以及在类似患者组中发现的其他相关病症。

III.使用方法

在另一个方面中，本文中提供了用于在对象中治疗癌症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的通过本文中提供的任何方法产生的MAGE-B2TCR特异性细胞，例如T细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、MSC或iPS细胞的群。可将细胞过继性地转移至患有可从中培养TIL或可从体外产生肿瘤抗原特异性CTL的癌症的对象。

本文中提供了用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括向个体施用有效量的MAGE-B2特异性T细胞治疗。本文中还提供了具有经遗传改造的TCR转导的T细胞(使TCR与另一些生物反应性蛋白质(例如抗CD3)缀合)的过继性T细胞治疗。在另一些实施方案中，提供了用于治疗癌症的方法，其包括用经纯化的肿瘤抗原或免疫显性肿瘤抗原特异性肽对对象进行免疫接种。

本文中提供的MAGE-B2肽可用于开发癌症疫苗或免疫原。这些肽特异性疫苗或免疫原可用于直接对癌症患者进行免疫接种以在体内诱导抗肿瘤免疫应答，或用于在体外用肽或编码的多核苷酸加载的APC刺激来扩增抗原特异性T细胞。这些大量的T细胞可过继性地转移至患者以诱导肿瘤消退。

可用本发明治疗方法治疗的肿瘤包括表达MAGE-B2的任何恶性细胞类型，例如存在于实体瘤或血液肿瘤中的那些。一些示例性实体瘤可包括但不限于选自以下的器官的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳房。一些示例性血液肿瘤包括骨髓瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可使用本文中提供的方法治疗的癌症的另一些实例包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomachcancer)(包括胃肠癌和胃肠间质癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾腺癌、肾癌(kidney cancer)或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、多种类型的头颈癌以及黑素瘤。

癌症可具体地是以下组织学类型，尽管其不限于这些：肿瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌与胆管癌；小梁腺癌(trabecular adenocarcinoma)；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳房佩吉特病(paget’s disease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌w/鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；塞托利细胞癌(sertoli cell carcinoma)；莱迪希细胞瘤(leydig cell tumor)，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤(extra-mammary paraganglioma)，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；恶性雀斑样痣黑素瘤(lentigo malignant melanoma)；肢端雀斑样痣黑素瘤(acrallentiginous melanomas)；结节性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒管混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦纳瘤(brenner tumor)，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；成软骨细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(ewing’ssarcoma)；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病(Hodgkin’s disease)；霍奇金副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样真菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)；小淋巴细胞性(smalllymphocytic，SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥散性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小非分裂细胞NHL；巨大疾病NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；原巨核细胞白血病；髓样肉瘤；毛细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)；急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)；急性髓性白血病(acute myeloidleukemia，AML)以及慢性粒细胞白血病。

在某些实施方案中，所述方法还包括在施用治疗有效量的MAGE-B2TCR细胞群之前进行淋巴细胞耗竭的步骤。在某些实施方案中，淋巴细胞耗竭包含非清髓性淋巴细胞耗竭化学治疗。在某些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭化学治疗包含施用环磷酰胺和氟达拉滨。

在某些实施方案中，所述方法还包括将促进自体T细胞生长和活化的T细胞生长因子与自体T细胞同时或在自体T细胞随后施用于对象的步骤。在某些实施方案中，T细胞生长因子包含促进自体T细胞生长和活化的任何合适的生长因子。在某些实施方案中，T细胞生长因子选自白介素(IL)-2、IL-7、IL-15、和IL-12，及其组合(例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或IL-12和IL-2)。

在某些实施方案中，治疗有效量的通过本文中提供的任何方法产生的MAGE-B2TCR特异性细胞群经静脉内、瘤内或腹膜内施用于对象。细胞治疗的合适剂量可基于待治疗癌症的类型、疾病的严重程度和进程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的响应以及主治医师的判断来确定。

A.组合治疗

在某些实施方案中，本文中提供的方法还包括向对象施用至少一种另外的治疗剂的步骤。将任何潜在的毒性、可能的副作用和任何其他相关因素考虑在内，根据针对每种特定组合物或治疗的良好临床实践，将本文中公开的所有另外的治疗剂施用于对象。

在某些实施方案中，另外的治疗可以是免疫治疗、放射治疗、手术(例如，肿瘤的手术切除)、化学治疗、骨髓移植或前述的组合。另外的治疗可以是靶向治疗。在某些实施方案中，另外的治疗在主要治疗之前施用(即，作为辅助治疗)。在某些实施方案中，另外的治疗在主要治疗之后施用(即，作为新辅助治疗)。

在某些实施方案中，另外的治疗包含免疫治疗。在某些实施方案中，免疫治疗包含免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂抑制选自以下的免疫检查点蛋白：程序性细胞死亡途径1(programmed cell death pathway 1，PD-1/CD279)及其配体(PD-L1/CD274和PD-L2/CD273)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4/CD152)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte-activationgene 3，LAG-3/CD223)、B和T淋巴细胞弱化子(B and T lymphocyte attenuator，B and Tlymphocyte attenuator，BTLA)、具有Ig和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(T cell immunoglobulin domain andmucin domain 3，TIM-3/HAVcr2)、杀伤免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-likereceptor，KIR/CD158)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(V-domainimmunoglobulin suppressor of T cell activation，VISTA)以及腺苷A2a受体(A2aR)。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1结合拮抗剂。在某些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在某些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和CT-011。在某些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附素(例如，包含与免疫球蛋白恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的胞外部分或PD-1结合部分的免疫黏附素)。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4结合拮抗剂。在某些实施方案中，CTLA-4结合拮抗剂是抗CTLA-4抗体。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体选自伊匹单抗(ipilimumab)和替西木单抗(tremelimumab)。

在某些实施方案中，另外的治疗剂包含用放射治疗的治疗。在某些实施方案中，放射治疗选自γ射线(gamma ray)(γ射线)、X射线、微波、质子束辐照、紫外线辐照以及放射性同位素向肿瘤的直接递送。在某些实施方案中，放射治疗包含用X射线的治疗。在某些实施方案中，在三至四周的时间内以50至200伦琴的日剂量施用X射线。在某些实施方案中，以2000至6000伦琴的单剂量施用X射线。在某些实施方案中，放射治疗包含放射性同位素向肿瘤的直接递送。放射性同位素的剂量范围根据同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取程度而广泛变化，但是合适的治疗有效剂量的确定在本领域普通技术人员的水平内。

在某些实施方案中，另外的治疗剂包含施用用于治疗与主要治疗相关的副作用(例如，恶心、恶病质等)的药剂。在某些实施方案中，另外的治疗包含免疫治疗。在某些实施方案中，另外的治疗包含放射治疗。在一些实施方案中，放射治疗包含γ辐照。在某些实施方案中，另外的治疗包含手术。在某些实施方案中，另外的治疗包含放射治疗与手术的组合。在某些实施方案中，另外的治疗包含用一类选自以下的化学治疗剂的治疗：烷化剂、蒽环素、细胞骨架破坏剂、埃博霉素、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物和核苷酸前体类似物、肽抗生素、基于铂的化合物、类视黄醇、长春花生物碱，及其衍生物。

本文中考虑的另外的治疗可在施用本文中提供的组合物之前、之后或与其同时施用。在某些实施方案中，另外的治疗在本文中提供的组合物之前施用。在某些实施方案中，另外的治疗在本文中提供的组合物之后施用。在某些实施方案中，另外的治疗在施用本文中提供的组合物之前或之后以一个或更多个间隔施用。使得所治疗对象从组合治疗中受益的合适的另外的治疗之施用间隔的确定在本领域普通技术人员的水平内。

B.药物组合物

在另一个方面中，本文中提供了包含MAGE-B2 TCR特异性细胞和可药用载体的药物组合物和制剂。

如本文中所述的药物组合物和制剂可通过将具有所期望纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或更多种任选的可药用载体混合来制备(Remington′s PharmaceuticalSciences 22

IV.实施例

包含以下实施例以示出本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，在随后实施例中公开的技术代表本发明人发现在本发明的实践中工作良好的技术，并因此可被认为构成用于实施本发明的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可对所公开的特定实施方案作出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。

实施例1-MAGE-B2特异性T细胞的产生和表征

对MAGE-B2在肺癌细胞系和永生化正常人小气上皮细胞(HSAEC1-KT和HSAEC2-KT)中的表达进行分析(图1)。发现MAGE-B2蛋白在大多数肺癌细胞系中强表达并且观察到其在正常肺细胞系中几乎未表达。

为了产生MAGE-B2特异性CD8+CTL，用编码MAGE-B2 HLA-A2限制性表位的RNA脉冲树突细胞。接下来，用脉冲的树突细胞刺激T细胞，并且通过流式细胞术检测CD8

因此，将MAGE-B2 HLA-A2限制性表位用于产生MAGE-B2特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。初始T细胞来源于健康的HLA-A2供体，并且用用全长MAGE-B2 RNA脉冲的自体成熟树突细胞(mature dendritic cell，mDC)进行刺激。在两轮刺激之后，将具有HLA-A2限制性MAGE-B2表位(GVYDGEEHSV；SEQ ID NO：1)的四聚体用于检测识别该表位的T细胞群。然后对CD8

接下来测试MAGE-B2特异性T细胞的功能亲合力。在肽滴定测定中，用不同浓度的MAGE-B2肽(10pg/ml至10μg/ml)脉冲T2细胞(图3A)。将T2细胞用作靶细胞，并与分离的MAGE-B2 CTL克隆共培养(E∶T＝20∶1)。测量针对肺癌细胞系H2023(HLA-A*0201)和正常肺细胞系HSAEC2-KT(HLA-A*0201)的CTL克隆的细胞毒性活性(图3B)。将靶细胞与MAGE-B2CTL克隆以不同的E∶T比共培养。用标准

为了产生经MAGE-B2 TCR改造的T细胞(TCR-T)，将来自MAGE-B2CTL克隆的TCR克隆出并将其插入到逆转录病毒载体pMSGV1中。将包含弗林蛋白酶切割位点、SGSG接头和P2A切割位点的接头片段插入TCR-β链与TCR-α链之间，以保证两条链在MSCV启动子下同等地表达。通过将逆转录病毒载体和包膜载体RD114共转染到包装细胞系GP2-293中来产生重组逆转录病毒。在转染之后二至三天，将包含逆转录病毒的上清液用于感染同种异体PBMC，所述PBMC在50ng/mg OKT3和300U/ml IL-2刺激下活化2天。在第一次感染的一天之后再一次进行感染。在5天之后，通过流式细胞术检测到清晰的CD8

用作为靶细胞的用不同浓度MAGE-B2肽(10pg/ml至10μg/ml)脉冲的T2细胞进行肽滴定测定。将T2细胞与MAGE-B2 TCR-T细胞系共培养(E∶T＝20∶1)。用标准

最后，通过胞内细胞因子染色(ICS)对MAGE-B2 TCR-T细胞进行功能表征。将MAGE-B2 TCR-T细胞系与肺癌细胞系H2023、正常肺细胞系HSAEC2-KT、用MAGE-B2肽脉冲的T2以及用MART-1肽M26脉冲的T2共培养。通过ICS测定检测IFN-γ、TNF-α、IL-2以及抗原特异性应答标志物CD137和CD69。在共培养之后，与与正常肺细胞系HSAEC2-KT或用对照肽M26脉冲的T2共培养相比，当TCR-T细胞与肺癌细胞系H2023或用MAGE-B2肽脉冲的T2共培养时，MAGE-B2 TCR-T细胞系的IFN-γ、TNF-α、IL-2、CD137和CD69水平显著增强。

因此，MAGE-B2 TCR-T细胞可用于治疗患有晚期或复发性癌症的HLA-A2(例如，HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、或HLA-A*0205)阳性患者，例如通过使用同种异体PBMC产生和扩增经TCR基因修饰的CTL。在功能检测(例如，表型和细胞毒性)之后，将经TCR修饰的T细胞输注至患者。

实施例2-材料和方法

实施例3-MAGE-B2 HLA-A2限制性肽(MB2-231)特异性TCR-T产生的产生

使用经MAGE-B2肽(GVYDGEEHSV；SEQ ID NO：1)脉冲的树突细胞刺激来源于同一健康供体的PBMC来产生另外的MAGE-B2特异性T细胞产物(图7)。在2次刺激之后，在一个48孔板的3个孔中观察到小的CD8+/四聚体

以20∶1的效应物与靶标(E∶T)比通过用多种浓度的MAGE-B2肽(GVYDGEEHSV；SEQID NO：1)脉冲的T2细胞系的裂解示出了3种MAGE-B2特异性CTL细胞系的功能亲合力。用标准51Cr释放测定检测细胞毒性(图8A)。还评估了3种MAGE-B2特异性CTL细胞系针对肺癌细胞系H2023(HLA-A*0201

为了产生经MAGE-B2 TCR改造的T细胞(TCR-T)，将来自MAGE-B2CTL细胞系C5的TCR克隆出并将其插入到逆转录病毒载体pMSGV1中。将包含弗林蛋白酶切割位点、SGSG接头和P2A切割位点的接头片段插入TCR-β链与TCR-α链之间，以保证两条链在MSCV启动子下同等地表达。通过将逆转录病毒载体和包膜载体RD114共转染到包装细胞系Phoenix-GP中来产生重组逆转录病毒。在转染之后二至三天，将包含逆转录病毒的上清液用于感染同种异体HLA-A*0201+健康供体的PBMC，所述PBMC在50ng/mg OKT3和300U/ml IL-2刺激下活化2天。在5天之后，通过流式细胞术检测到清晰的CD8+四聚体+群(图9A)。使用四聚体引导的分选技术对CD8+四聚体+群进行分选并用REP进行扩增。最终产物的CD8和四聚体染色示于图9A中。以20∶1的效应物与靶标(E∶T)比，通过用多种浓度的MAGE-B2肽(GVYDGEEHSV；SEQ IDNO：1)脉冲的T2细胞系的裂解示出了MAGE-B2 TCR-T的功能亲合力。用标准51Cr释放测定检测细胞毒性(图9B)。还评估了MAGE-B2 TCR-T针对肺癌细胞系H2023(HLA-A*0201+，MAGE-B2+)和正常肺细胞系HSAEC2-KT(HLA-A*0201+，MAGE-B2-)的细胞毒性(图9C)。还评估了MAGE-B2TCR-T针对另一些肺癌细胞系H1299(HLA-A*0201-，MAGE-B2+)、H1299-A2(HLA-A*0201强制表达，MAGE-B2+)、H1395(HLA-A*0201+，MAGE-B2+)、H522(HLA-A*0201+，MAGE-B2-)、H1355(HLA-A*0201+，MAGE-B2-)、H1755(HLA-A*0201+，MAGE-B2+)和DFC-1032(HLA-A*0201+，MAGE-B2-)的细胞毒性(图9D、9E)。

最后，通过胞内细胞因子染色(ICS)对MAGE-B2 TCR-T细胞进行功能表征。将MAGE-B2 TCR-T细胞系与用MAGE-B2肽(GVYDGEEHSV；SEQ ID NO：1)脉冲的T2以及用MART-1肽M26脉冲的T2(作为对照)共培养(图10A)。还评估了MAGE-B2特异性TCR-T对肺癌细胞系H2023、正常肺细胞系HSAEC2-KT(作为对照)的应答(图10A)。此外，还将另一些肺癌细胞系H1395、H522、H1299、H1299-A2、DFC-1032、H1355和H1755用作评价MAGE-B2 TCR-T的功能和特异性的靶标(图10B、10C)。用ICS检测MAGE-B2 TCR-T细胞系的IFN-γ、TNF-α的细胞因子释放以及抗原特异性应答标志物CD137和CD69的上调。

***

根据本公开内容，本文中公开且要求保护的所有方法均可在没有过度实验的情况下做出和执行。虽然本发明的组合物和方法已根据一些优选实施方案进行描述，但是对于本领域技术人员来说将明显的是，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对本文中所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序作出改变。更具体地，将明显的是，在化学和生理两方面均相关的某些试剂可替代本文中所述的试剂而实现相同或类似的结果。对本领域技术人员而言明显的所有这样的类似的替换和修改被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

以下参考文献就其提供补充本文中阐述内容的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。

Barnea et al.，Eur J Immunol，32(1)：213-22，2002.

Remington：The Science and Practice of Pharmacy，22nd Edition，Pharmaceutical Press，2012.

Shraibman et al.，Mol Cell Proteomics，15(9)：3058-70，2016.

序列表

<110> 德克萨斯大学系统董事会

<120> 具有MAGE-B2特异性的T细胞受体及其用途

<130> UTFC.P1372WO

<150> 62/660,083

<151> 2018-04-19

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成氨基酸

<400> 1

Gly Val Tyr Asp Gly Glu Glu His Ser Val

1 5 10

<210> 2

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 2

atgaactatt ctccaggctt agtatctctg atactcttac tgcttggaag aacccgtgga 60

aattcagtga cccagatgga agggccagtg actctctcag aagaggcctt cctgactata 120

aactgcacgt acacagccac aggataccct tcccttttct ggtatgtcca atatcctgga 180

gaaggtctac agctcctcct gaaagccacg aaggctgatg acaagggaag caacaaaggt 240

tttgaagcca cataccgtaa agaaaccact tctttccact tggagaaagg ctcagttcaa 300

gtgtcagact cagcggtgta cttctgtgct ctgaccaacg actacaagct cagctttgga 360

gccggaacca cagtaactgt aagagcaaat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag 420

ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa 480

acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac 540

atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt 600

gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca 660

gaaagttcct gtgatgtcaa gctggtcgag aaaagctttg aaacagatac gaacctaaac 720

tttcaaaacc tgtcagtgat tgggttccga atcctcctcc tgaaagtggc cgggtttaat 780

ctgctcatga cgctgcggct gtggtccagc tga 813

<210> 3

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成氨基酸

<400> 3

Ser Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Glu Gly Leu Gln Leu Leu

1 5 10 15

Leu Lys Ala Thr Lys Ala Asp Asp Lys Gly Ser Asn Lys Gly Phe Glu

20 25 30

Ala Thr Tyr Arg Lys Glu Thr Thr Ser Phe His Leu Glu Lys Gly Ser

35 40 45

Val Gln Val Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Leu Thr Asn Asp

50 55 60

Tyr Lys Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Arg Ala Asn

65 70 75 80

Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

85 90 95

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn

100 105 110

Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val

115 120 125

Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

130 135 140

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile

145 150 155 160

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val

165 170 175

Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln

180 185 190

Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly

195 200 205

Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

210 215 220

<210> 4

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 4

atgggtcctg ggcttctcca ctggatggcc ctttgtctcc ttggaacagg tcatggggat 60

gccatggtca tccagaaccc aagataccag gttacccagt ttggaaagcc agtgaccctg 120

agttgttctc agactttgaa ccataacgtc atgtactggt accagcagaa gtcaagtcag 180

gccccaaagc tgctgttcca ctactatgac aaagatttta acaatgaagc agacacccct 240

gataacttcc aatccaggag gccgaacact tctttctgct ttcttgacat ccgctcacca 300

ggcctggggg acgcagccat gtacctgtgt gccaccagca ggggcgggag gtacaatgag 360

cagttcttcg ggccagggac acggctcacc gtgctagagg acctgaaaaa cgtgttccca 420

cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa gcagagatct cccacaccca aaaggccaca 480

ctggtgtgcc tggccacagg cttcttccct gaccacgtgg agctgagctg gtgggtgaat 540

gggaaggagg tgcacagtgg ggtcagcacg gacccgcagc ccctcaagga gcagcccgcc 600

ctcaatgact ccagatactg cctgagcagc cgcctgaggg tctcggccac cttctggcag 660

aacccccgca accacttccg ctgtcaagtc cagttctacg ggctctcgga gaatgacgag 720

tggacccagg atagggccaa acccgtcacc cagatcgtca gcgccgaggc ctggggtaga 780

gcagactgtg gctttacctc ggtgtcctac cagcaagggg tcctgtctgc caccatcctc 840

tatgagatcc tgctagggaa ggccaccctg tatgctgtgc tggtcagcgc ccttgtgttg 900

atggccatgg tcaagagaaa ggatttctga 930

<210> 5

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成氨基酸

<400> 5

Met Gly Pro Gly Leu Leu His Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Thr

1 5 10 15

Gly His Gly Asp Ala Met Val Ile Gln Asn Pro Arg Tyr Gln Val Thr

20 25 30

Gln Phe Gly Lys Pro Val Thr Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His

35 40 45

Asn Val Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu

50 55 60

Leu Phe His Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro

65 70 75 80

Asp Asn Phe Gln Ser Arg Arg Pro Asn Thr Ser Phe Cys Phe Leu Asp

85 90 95

Ile Arg Ser Pro Gly Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr

100 105 110

Ser Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg

115 120 125

Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala

130 135 140

Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr

145 150 155 160

Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser

165 170 175

Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro

180 185 190

Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu

195 200 205

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn

210 215 220

His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu

225 230 235 240

Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu

245 250 255

Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln

260 265 270

Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala

275 280 285

Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val

290 295 300

Lys Arg Lys Asp Phe

305

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 6

gccacaggat acccttcc 18

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成氨基酸

<400> 7

Ala Thr Gly Tyr Pro Ser

1 5

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 8

gccacgaagg ctgatgacaa g 21

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成氨基酸

<400> 9

Ala Thr Lys Ala Asp Asp Lys

1 5

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 10

gctctgacca acgactacaa gctcagc 27

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成氨基酸

<400> 11

Ala Leu Thr Asn Asp Tyr Lys Leu Ser

1 5

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 12

ttgaaccata acgtc 15

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成氨基酸

<400> 13

Leu Asn His Asn Val

1 5

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 14

tactatgaca aagatttt 18

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成氨基酸

<400> 15

Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe

1 5

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 16

gccaccagca ggggcgggag gtacaatgag cagttc 36

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成氨基酸

<400> 17

Ala Thr Ser Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe

1 5 10

<210> 18

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α链（TRAV10*01）

<400> 18

atgaaaaagc atctgacgac cttcttggtg attttgtggc tttattttta tagggggaat 60

ggcaaaaacc aagtggagca gagtcctcag tccctgatca tcctggaggg aaagaactgc 120

actcttcaat gcaattatac agtgagcccc ttcagcaact taaggtggta taagcaagat 180

actgggagag gtcctgtttc cctgacaatc atgactttca gtgagaacac aaagtcgaac 240

ggaagatata cagcaactct ggatgcagac acaaagcaaa gctctctgca catcacagcc 300

tcccagctca gcgattcagc ctcctacatc tgtgtggtga tttcaggctt tcagaaactt 360

gtatttggaa ctggcacccg acttctggtc agtccaaata tccagaaccc tgaccctgcc 420

gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 480

gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 540

gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 600

tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 660

cccagcccag aaagttcctg tgatgtcaag ctggtcgaga aaagctttga aacagatacg 720

aacctaaact ttcaaaacct gtcagtgatt gggttccgaa tcctcctcct gaaagtggcc 780

gggtttaatc tgctcatgac gctgcggctg tggtccagct aa 822

<210> 19

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α链

<400> 19

Met Lys Lys His Leu Thr Thr Phe Leu Val Ile Leu Trp Leu Tyr Phe

1 5 10 15

Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Gln Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu

20 25 30

Ile Ile Leu Glu Gly Lys Asn Cys Thr Leu Gln Cys Asn Tyr Thr Val

35 40 45

Ser Pro Phe Ser Asn Leu Arg Trp Tyr Lys Gln Asp Thr Gly Arg Gly

50 55 60

Pro Val Ser Leu Thr Ile Met Thr Phe Ser Glu Asn Thr Lys Ser Asn

65 70 75 80

Gly Arg Tyr Thr Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Lys Gln Ser Ser Leu

85 90 95

His Ile Thr Ala Ser Gln Leu Ser Asp Ser Ala Ser Tyr Ile Cys Val

100 105 110

Val Ile Ser Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Leu Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu

130 135 140

Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe

145 150 155 160

Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile

165 170 175

Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn

180 185 190

Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala

195 200 205

Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu

210 215 220

Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr

225 230 235 240

Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu

245 250 255

Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser

260 265 270

Ser

<210> 20

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β链（TRBV11-3*04）

<400> 20

atgggtacca ggctcctctg ctgggtggcc ttctgtctcc tggtggaaga actcatagaa 60

gctggagtgg ttcagtctcc cagatataag attatagaga aaaaacagcc tgtggctttt 120

tggtgcaatc ctatttctgg ccacaatacc ctttactggt accggcagaa cttgggacag 180

ggcccggagc ttctgattcg atatgagaat gaggaagcag tagacgattc acagttgcct 240

aaggatcgat tttctgcaga gaggctcaaa ggagtagact ccactctcaa gatccagcct 300

gcagagcttg gggactcggc cgtgtatctc tgtgccagca gcttccctaa acagggatcc 360

tacaatgagc agttcttcgg gccagggaca cggctcaccg tgctagagga cctgaaaaac 420

gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 480

aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttcttccctg accacgtgga gctgagctgg 540

tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacgg acccgcagcc cctcaaggag 600

cagcccgccc tcaatgactc cagatactgc ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 660

ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720

aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780

tggggtagag cagactgtgg ctttacctcg gtgtcctacc agcaaggggt cctgtctgcc 840

accatcctct atgagatcct gctagggaag gccaccctgt atgctgtgct ggtcagcgcc 900

cttgtgttga tggccatggt caagagaaag gatttctaa 939

<210> 21

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β链

<400> 21

Met Gly Thr Arg Leu Leu Cys Trp Val Ala Phe Cys Leu Leu Val Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ile Glu Ala Gly Val Val Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Ile

20 25 30

Glu Lys Lys Gln Pro Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ile Ser Gly His

35 40 45

Asn Thr Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Asn Leu Gly Gln Gly Pro Glu Leu

50 55 60

Leu Ile Arg Tyr Glu Asn Glu Glu Ala Val Asp Asp Ser Gln Leu Pro

65 70 75 80

Lys Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Leu Lys Gly Val Asp Ser Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Gln Pro Ala Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala

100 105 110

Ser Ser Phe Pro Lys Gln Gly Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro

115 120 125

Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro

130 135 140

Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln

145 150 155 160

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val

165 170 175

Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser

180 185 190

Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg

195 200 205

Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn

210 215 220

Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu

225 230 235 240

Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val

245 250 255

Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser

260 265 270

Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu

275 280 285

Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met

290 295 300

Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe

305 310

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α链CDR1

<400> 22

gtgagcccct tcagcaac 18

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α链CDR1

<400> 23

Val Ser Pro Phe Ser Asn

1 5

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α链CDR2

<400> 24

atgactttca gtgagaacac a 21

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α链CDR2

<400> 25

Met Thr Phe Ser Glu Asn Thr

1 5

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α链CDR3

<400> 26

gtggtgattt caggctttca gaaacttgta 30

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α链CDR3

<400> 27

Val Val Ile Ser Gly Phe Gln Lys Leu Val

1 5 10

<210> 28

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β链CDR1

<400> 28

tctggccaca atacc 15

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β链CDR1

<400> 29

Ser Gly His Asn Thr

1 5

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β链CDR2

<400> 30

tatgagaatg aggaagca 18

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β链CDR2

<400> 31

Tyr Glu Asn Glu Glu Ala

1 5

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β链CDR3

<400> 32

gccagcagct tccctaaaca gggatcctac aatgagcagt tc 42

<210> 33

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β链CDR3

<400> 33

Ala Ser Ser Phe Pro Lys Gln Gly Ser Tyr Asn Glu Gln Phe

1 5 10

<210> 34

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α链信号肽

<400> 34

atgaactatt ctccaggctt agtatctctg atactcttac tgcttggaag aacccgt 57

<210> 35

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α链信号肽3

<400> 35

Met Asn Tyr Ser Pro Gly Leu Val Ser Leu Ile Leu Leu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Arg Thr Arg

<210> 36

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α链可变区2

<400> 36

ggaaattcag tgacccagat ggaagggcca gtgactctct cagaagaggc cttcctgact 60

ataaactgca cgtacacagc cacaggatac ccttcccttt tctggtatgt ccaatatcct 120

ggagaaggtc tacagctcct cctgaaagcc acgaaggctg atgacaaggg aagcaacaaa 180

ggttttgaag ccacataccg taaagaaacc acttctttcc acttggagaa aggctcagtt 240

caagtgtcag actcagcggt gtacttctgt gctctgacca acgactacaa gctcagcttt 300

ggagccggaa ccacagtaac tgtaagagca aatatc 336

<210> 37

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α链可变区3

<400> 37

Gly Asn Ser Val Thr Gln Met Glu Gly Pro Val Thr Leu Ser Glu Glu

1 5 10 15

Ala Phe Leu Thr Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Ala Thr Gly Tyr Pro Ser

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Glu Gly Leu Gln Leu Leu Leu

35 40 45

Lys Ala Thr Lys Ala Asp Asp Lys Gly Ser Asn Lys Gly Phe Glu Ala

50 55 60

Thr Tyr Arg Lys Glu Thr Thr Ser Phe His Leu Glu Lys Gly Ser Val

65 70 75 80

Gln Val Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Leu Thr Asn Asp Tyr

85 90 95

Lys Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Arg Ala Asn

100 105 110

<210> 38

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α链恒定区2

<400> 38

cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg agagactcta aatccagtga caagtctgtc 60

tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg 120

tatatcacag acaaaactgt gctagacatg aggtctatgg acttcaagag caacagtgct 180

gtggcctgga gcaacaaatc tgactttgca tgtgcaaacg ccttcaacaa cagcattatt 240

ccagaagaca ccttcttccc cagcccagaa agttcctgtg atgtcaagct ggtcgagaaa 300

agctttgaaa cagatacgaa cctaaacttt caaaacctgt cagtgattgg gttccgaatc 360

ctcctcctga aagtggccgg gtttaatctg ctcatgacgc tgcggctgtg gtccagctga 420

<210> 39

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α链恒定区3

<400> 39

Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

1 5 10 15

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn

20 25 30

Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val

35 40 45

Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

50 55 60

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile

65 70 75 80

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val

85 90 95

Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln

100 105 110

Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly

115 120 125

Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 40

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β链信号肽4

<400> 40

atgggtcctg ggcttctcca ctggatggcc ctttgtctcc ttggaacagg tcatggg 57

<210> 41

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β链信号肽5

<400> 41

Met Gly Pro Gly Leu Leu His Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Thr

1 5 10 15

Gly His Gly

<210> 42

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β链可变区4

<400> 42

gatgccatgg tcatccagaa cccaagatac caggttaccc agtttggaaa gccagtgacc 60

ctgagttgtt ctcagacttt gaaccataac gtcatgtact ggtaccagca gaagtcaagt 120

caggccccaa agctgctgtt ccactactat gacaaagatt ttaacaatga agcagacacc 180

cctgataact tccaatccag gaggccgaac acttctttct gctttcttga catccgctca 240

ccaggcctgg gggacgcagc catgtacctg tgtgccacca gcaggggcgg gaggtacaat 300

gagcagttct tcgggccagg gacacggctc accgtgctag ag 342

<210> 43

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β链可变区5

<400> 43

Asp Ala Met Val Ile Gln Asn Pro Arg Tyr Gln Val Thr Gln Phe Gly

1 5 10 15

Lys Pro Val Thr Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His Asn Val Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe His

35 40 45

Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro Asp Asn Phe

50 55 60

Gln Ser Arg Arg Pro Asn Thr Ser Phe Cys Phe Leu Asp Ile Arg Ser

65 70 75 80

Pro Gly Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr Ser Arg Gly

85 90 95

Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val

100 105 110

Leu Glu

<210> 44

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β链恒定区4

<400> 44

gacctgaaaa acgtgttccc acccgaggtc gctgtgtttg agccatcaga agcagagatc 60

tcccacaccc aaaaggccac actggtgtgc ctggccacag gcttcttccc tgaccacgtg 120

gagctgagct ggtgggtgaa tgggaaggag gtgcacagtg gggtcagcac ggacccgcag 180

cccctcaagg agcagcccgc cctcaatgac tccagatact gcctgagcag ccgcctgagg 240

gtctcggcca ccttctggca gaacccccgc aaccacttcc gctgtcaagt ccagttctac 300

gggctctcgg agaatgacga gtggacccag gatagggcca aacccgtcac ccagatcgtc 360

agcgccgagg cctggggtag agcagactgt ggctttacct cggtgtccta ccagcaaggg 420

gtcctgtctg ccaccatcct ctatgagatc ctgctaggga aggccaccct gtatgctgtg 480

ctggtcagcg cccttgtgtt gatggccatg gtcaagagaa aggatttctg a 531

<210> 45

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β链恒定区5

<400> 45

Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser

1 5 10 15

Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

20 25 30

Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

35 40 45

Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu

50 55 60

Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg

65 70 75 80

Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

85 90 95

Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg

100 105 110

Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

115 120 125

Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala

130 135 140

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

145 150 155 160

Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175