脐带间充质干细胞活性物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞活性物及其制备方法和应用。

背景技术

目前的治疗骨性关节炎方法包括手术和药物干预，但患者正常的软骨功能仍难以恢复。近年来医学上利用骨髓间充质干细胞作为骨关节炎的修复细胞。不过获取骨髓干细胞，须穿刺抽取骨髓，然后进行分离纯化提取。但是骨髓干细胞含量低、致瘤性高，在临床上应用风险大。

脐带间充质干细胞具有强大的增殖和分化潜力，致瘤性低，已成为极具吸引力的替代治疗研究热点。脐带间充质干细胞可迅速扩增、不易衰老等特点。脐带间充质干细胞能分泌多种活性因子，如：转化生长因子β1、角质细胞生长素等。

发明内容

针对上述技术问题，本发明要解决的技术问题在于提供一种脐带间充质干细胞活性物及其制备方法。

具体技术方案为：

脐带间充质干细胞复合活性物，包括脐带间充质干细胞活性物、透明质酸、白蛋白和生理盐水。

其中所述的白蛋白的质量分数为5％～10％。

所述的透明质酸的质量分数为3％～5％。透明质酸的分子量为500000～800000。在脐带间充质干细胞活性物中添加透明质酸可以为脐带间充质干细胞提供合适的基质环境，维持脐带间充质干细胞的存活率，且利于脐带间充质干细胞在治疗关节疾病的过程中，分化为软骨组织。

其中所述的脐带间充质干细胞活性物的提取方法，包括以下步骤：

(1)分离干细胞：从人或哺乳动物的体组织中分离得到出脐带间充质干细胞；

(2)干细胞的扩增，用干细胞培养方法扩增培养，具体包括a-MEM培养基，加入10％的胎牛血清，5％CO

(3)干细胞活性物的获取：在干细胞分裂最旺盛的时期，弃去正常培养基，用PBS缓冲液(磷酸缓冲液，pH＝7.4左右)清洗1～3次，然后加入PBS或生理盐水，细胞培养箱中培养4～24小时，收集上清液，即可得到富含干细胞活性物的溶液；

(4)浓缩、贮存：所得液体离心，除去散落细胞，浓缩，按1×10

其中所述的脐带间充质干细胞为第三代～第五代的干细胞。所述的第三代～第五代的脐带间充质干细胞经胰酶酶解后，以生理盐水清洗。第三代～第五代的干细胞能够保持干细胞固有的分化潜能，不会出细胞凋亡或衰退的现象，其状态最佳，在适当的条件下，可以迅速增长并分化。

胰酶酶解的具体步骤为：取第三代～第五代脐带间充质干细胞干细胞，用PBS清洗两遍后，加入2～3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；等到80％脐带间充质干细胞皱缩变圆时，加入5～8mL含10％FBS的DMEM培养基终止酶解，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞全部脱落。

其中，生理盐水清洗的具体步骤为：把经胰酶酶解的脐带间充质干细胞悬液转移至50mL离心管中，500～800g离心3～5min。离心结束后移走上清液，向细胞沉淀中加入20～40mL的生理盐水重悬细胞，500～800g离心3～5min，弃上清液。清洗的次数为2次。

该脐带间充质干细胞复合活性物的制备方法，包括：将白蛋白、透明质酸与生理盐水混合后，重悬脐带间充质干细胞活性物，获得脐带间充质干细胞复合活性物制剂。脐带间充质干细胞活性物的存活率维持在99％以上，细胞大小均匀、形态均为梭型。0℃～4℃保存72h后，细胞仍保持着良好的形态，没有出现体积变大等异常现象，存活率仍保持在95％以上，且经表面抗原检测，脐带间充质干细胞仍保持干细胞的特点，没有发生分化，具有良好的活性。

该脐带间充质干细胞复合活性物用于制备治疗关节疾病的药物。

本发明提供的脐带间充质干细胞活性物，脐带间充质干细胞活性物在透明质酸和白蛋白及生理盐水的保护下，能够维持良好的存活率和活性，且不会启动分化。且本发明提供的脐带间充质干细胞活性物的制备方法，能够避免损伤脐带间充质干细胞活性物，提高了脐带间充质干细胞的存活率。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

(1)分离干细胞：从人或哺乳动物的体组织中分离得到出脐带间充质干细胞；体组织分装至50mL离心管中，每管20mL。每管中加入等体积的0.5％I型胶原酶，终浓度为0.25％，充分混匀，封口后转移至恒温空气摇床中，37℃、100R消化1h。然后每管加入4mL的FBS终止消化，混匀、离心，1500rpm/min离心5min。弃去上两层液体，每管加入40mL PBS重悬，重悬细胞；然后再1500rpm/min离心5min，弃去上清液体，获得脐带间充质干细胞。

(2)干细胞的扩增，用干细胞培养方法扩增培养，a-MEM培养基，加入10％的胎牛血清，以1×10

所述的第三代～第五代的脐带间充质干细胞经胰酶酶解后，以生理盐水清洗。

胰酶酶解的具体步骤为：取第三代～第五代脐带间充质干细胞干细胞，用PBS清洗两遍后，加入2～3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；等到80％脐带间充质干细胞皱缩变圆时，加入5～8mL含10％FBS的DMEM培养基终止酶解，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞全部脱落。

生理盐水清洗的具体步骤为：把经胰酶酶解的脐带间充质干细胞悬液转移至50mL离心管中，500～800g离心3～5min。离心结束后移走上清液，向细胞沉淀中加入20～40mL的生理盐水重悬细胞，500～800g离心3～5min，弃上清液。清洗的次数为2次。

(3)干细胞活性物的获取：在干细胞分裂最旺盛的时期，弃去正常培养基，用PBS缓冲液(磷酸缓冲液，pH＝7.4左右)清洗1～3次，然后加入PBS或生理盐水，细胞培养箱中培养4～24小时，收集上清液，即可得到富含干细胞活性物的溶液；

(4)浓缩、贮存：所得液体离心，除去散落细胞，浓缩，按1×106个细胞/毫升的浓度进行浓缩，-20℃长期保存，以备使用。

(5)将白蛋白、透明质酸与生理盐水混合后，重悬脐带间充质干细胞活性物，获得脐带间充质干细胞复合活性物制剂。

各实施例中白蛋白、透明质酸、脐带间充质干细胞的量为：

实施例1：白蛋白质量分数5％，透明质酸质量分数4％，脐带间充质干细胞个数1×10

实施例2：白蛋白质量分数10％，透明质酸质量分数5％，脐带间充质干细胞个数1×10

实施例3：白蛋白质量分数10％，透明质酸质量分数3％，脐带间充质干细胞个数1×10

把白蛋白和小分子量透明质酸加入到生理盐水中，获得制剂的基质，用基质重悬骨髓干细胞。各实施例中白蛋白、透明质酸、骨髓干细胞的量为：

对比例：白蛋白质量分数10％，透明质酸质量分数4％，骨髓干细胞个数5×10

对实施例和对比例制得的干细胞复合物进行质量鉴定。鉴定方法为：

复合物制成后，3h内对新鲜制得的复合物进行检测，检测内容包括：干细胞形态、存活率、制剂中细菌等的含量。其中，细胞形态检测、细胞活力检测采用台盼蓝拒染法。

检测结果实施例1到实施例3提供的复合物内，干细胞大小均匀，存活率高，在台盼蓝拒染法检测下，细胞均拒染(死细胞被染成蓝色，活细胞拒染)；说明了脐带间充质干细胞没有出现死亡，活力好。而对比例制备的干细胞制剂中，干细胞的存活率略低，有的甚至出现了异常形态。

制剂制成后，装入注射器中，4℃保存72h后再次检测干细胞形态、存活率、表面抗原，制剂中细菌等的含量。其中，细胞形态检测、细胞活力检测采用台盼蓝拒染法，表面抗原检测采用流式细胞仪分析。结果表明，在制备72h后，实施例1到3制备的脐带间充质干细胞制剂中干细胞形态小且均一，存活率(p＜0.05显著高于对比例。

以上仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。