一株产生高效胶原蛋白酶的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株产生高效胶原蛋白酶的菌株及其应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，是细胞外基质内的一种主要结构蛋白，广泛分布于哺乳动物的肌腱、骨骼、韧带、皮肤、血管等结缔组织中和水生动物的鱼皮、鱼鳞、鱼骨等组织中，主要以不溶性纤维状蛋白的形式存在。这些胶原蛋白在食品加工过程中往往作为下脚料处理，不仅造成生物资源的浪费，还对环境造成不良的影响。充分合理的利用这些食品加工过程中的废弃物，不仅能够推动畜产、水产加工业的发展，而且能够减少环境污染。

利用胶原蛋白原料生产胶原蛋白寡肽是食品加工过程中产生的胶原蛋白下脚料高值化利用的重要途径。胶原蛋白寡肽是胶原蛋白的酶解产物，具有抗菌、抗氧化和血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性等多种生物学功能，在食品、化妆品、生物医学等领域都具有很好的应用潜力。但是胶原蛋白具有由三股左手螺旋α肽链相互缠绕折叠形成的右手螺旋超分子结构，稳定性高，难以被降解。目前工业生产中常用于胶原蛋白寡肽制备的工具酶包括植物性蛋白酶(菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶)，细菌性蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶)，动物蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原蛋白酶)。但是这些商品化的酶制剂往往对胶原蛋白的特异性较差，得到的寡肽分子量范围分布广且分子量较高，并且产品的得率较低。因此筛选获得新的特异性的高效胶原蛋白酶尤为重要。成熟的微生物发酵工艺和产物提取纯化工艺使得微生物来源的胶原蛋白酶尤为引人关注。

目前，人们已经从枯草杆菌、蜡状芽孢杆菌、放线菌、假交替单胞菌等微生物中获得了胶原蛋白酶，但大多数菌株产酶活力较低或需要特殊的诱导条件，生产高效胶原蛋白酶的菌株还很缺乏。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一株产生高效胶原蛋白酶的菌株及其应用。该菌株属于假交替单胞菌科的一个新种，产生的胶原蛋白酶可用于胶原蛋白的降解，提高畜产、水产加工中胶原蛋白下脚料的附加值。

本发明的技术方案如下：

一株假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988，该菌株2020年10月9日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M2020574，地址：中国，武汉，武汉大学。

所述菌株自山东青岛沿岸潮间带(N36.22°,E120.41°)的刺松藻样品分离得到。

根据本发明优选的，所述假交替单胞菌科新菌Flocculibactercollagenilyticus SM1988的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述假交替单胞菌科新菌Flocculibactercollagenilyticus SM1988的生长温度范围为10～40℃，最适生长温度为25～30℃；生长的NaCl浓度范围为0.5～6％(w/v)，最适生长的NaCl浓度为2.5～3.0％(w/v)；生长的pH范围为6～10，最适生长的pH值为7.0～8.0。

本发明提供所述假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticusSM1988在降解胶原蛋白中的应用。

本发明还提供一种利用所述的假交替单胞菌科新菌Flocculibactercollagenilyticus SM1988降解胶原蛋白的方法，包括步骤如下：

将假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988接种至TYS液体培养基中进行发酵培养，在摇床转速150～200rpm，培养温度23～27℃下培养4～7d，得到发酵液；再将发酵液经离心得到的上清液即为胶原蛋白酶液；然后向胶原蛋白中加入胶原蛋白酶液，在37～55℃的条件下反应2～3h，经离心后去除沉淀，得到的上清液即为胶原蛋白酶解液。

根据本发明优选的，所述的TYS液体培养基组分如下：蛋白胨5份，酵母粉1份，海盐30份，水1000份，pH 7.0～7.4，均为重量份。

根据本发明优选的，所述的发酵培养条件为：摇床转速180rpm，培养温度25℃，培养时间5～6d。

根据本发明优选的，所述的离心转速为6000～8000r/min，离心时间为8～12min。

根据本发明优选的，所述的胶原蛋白为牛骨胶原蛋白或鳕鱼皮胶原蛋白。

根据本发明优选的，所述的胶原蛋白酶液的加入量为60～1600U/g的酶料比(E/S)。

有益效果：

本发明提供的假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988是假交替单胞菌科的一个新种，具有胶原蛋白降解能力，所产出的胶原蛋白酶能够用于降解胶原蛋白，生产胶原蛋白寡肽。特别是对牛骨和鱼皮等胶原蛋白原料具有很强的降解能力，可以对牛骨、鱼皮等肉类加工和渔业加工的副产品做进一步的酶解处理，采用鳕鱼皮作为原料，制备的胶原蛋白寡肽分子量小于3000Da的肽段达到了95％以上，分子量小且均一度高，易于被人体吸收利用，有效的提高了胶原蛋白副产品的附加值，具有很好的经济效益。

附图说明

图1为假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988的原子力显微镜(AFM)图和透射电子显微镜(TEM)图；

图中：1、AFM，2、TEM。

图2为根据假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988以及其它细菌的16S rDNA序列构建的系统发育树图。

图3为假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988的极性脂双向层析图。

图4为假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988对牛骨胶原蛋白的酶解效果图；

图中：1、降解后，2、降解前。

图5为假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988对鳕鱼皮的酶解效果图；

图中：A、降解前，B、降解后。

图6为实施例6不同酶料比对牛骨胶原蛋白(A)和鳕鱼皮(B)的水解率折线图。

图7为实施例6牛骨胶原蛋白和鳕鱼皮水解物的分子量分布图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

一株假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988，2020年10月9日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M 2020574，地址：中国，武汉，武汉大学。

实施例中培养基的配制原料均为本领域常用原料；牛骨胶原蛋白、鳕鱼皮均可在市场购得。

实施例1菌株的筛选与分离

(1)样品采集

从青岛沿岸潮间带(N36.22°，E120.41°)石滩中采集刺松藻，放置在冰盒中带回实验室。

(2)富集驯化

用灭过菌的海水轻轻冲洗刺松藻体，用无菌剪刀将藻体剪碎放入至1/10TYS液体培养基中，在摇床中以25℃，180rpm的条件，震荡10min，得到富集的菌液。

(3)菌株的筛选和分离

将步骤(2)中富集的菌液按照10

上述培养基组分如下：

1/10TYS液体培养基：蛋白胨0.5份，酵母粉0.1份，海盐3份，水100份，pH 7.0～7.4，均为重量份。

筛选培养基：每升蒸馏水中含有蛋白胨5g，酵母粉1g，明胶1g，海盐30g，琼脂粉15g，pH 7.0～7.4。

实施例2菌株形态学的鉴定

将实施例1筛选和分离的菌株划线到TYS固体培养基平板上，然后将平板倒转，在温度为25℃的条件下培养24h，观察并记录平板上菌落的生长情况，菌落形态的原子力显微镜(AFM)图和透射电子显微镜(TEM)图，如图1所示。

由图1可知，该菌株在TYS培养基平板上，菌落呈白色(后期发黄)，圆形，边缘整齐，菌落湿黏(后期坚硬成块)表明光滑较湿润，不透明；革兰氏染色呈红色，表明为革兰氏阴性菌；原子力显微镜(AFM)图和透射电子显微镜(TEM)图中细胞呈棒状，长宽为0.8～1.5×0.3～0.5μm，单胞，极生鞭毛，可分泌大量的胞外聚合物。

实施例3菌株生理生化的鉴定

通过常规生理生化实验和API 20NE、ZYM试剂条对实施例1筛选和分离的菌株的生理生化特征进行鉴定。

鉴定分析结果见表1。

表1实施例1分离的菌株和假交替单胞菌科亲缘关系相近菌株的生理生化特征比较

表中：1为实施例1分离的菌株；2为菌种Pseudoalteromonas mariniglutinosaKMM 3635

由表1可知，实施例1筛选和分离的菌株SM1988生长温度范围为10～40℃，最适生长温度为25～30℃；生长的NaCl浓度范围为0.5～6％(w/v)，最适生长的NaCl浓度为2.5～3.0％；生长的pH范围为6～10，最适生长的pH值为7.0～8.0。SM1988菌株能够还原硝酸盐为亚硝酸盐，其氧化酶和触酶反应为阳性。该菌株能够水解酪蛋白、明胶、Tween 20、Tween40、Tween 60、Tween 80，不能水解琼脂、淀粉和七叶苷。

实施例4菌株的16S rDNA序列扩增与鉴定

使用Bio Teke细菌基因组提取试剂盒提取实施例1筛选和分离的菌株SM1988中的DNA，具体提取方法参照该试剂盒的说明书。

PCR引物采用通用引物：

27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，

1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTTC-3')，

PCR反应条件为：温度为95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸90s；30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

PCR产物由华大基因进行测序，测序结果如序列表SEQ ID NO.1所示，长度为1538bp。

将扩增出的16S rDNA序列在EZBioCloud数据库与所有标准菌株16S rDNA序列进行同源性分析，结果显示同源性较高的序列均属于假交替单胞菌科，选取交替单胞菌目内的相近科内的代表种，并以菌种Alcanivorax borkumensis Sk2

根据16S rDNA序列比对结果并结合该菌株的生物学特性，将该菌株鉴定为假交替单胞菌科新菌，命名为Flocculibacter collagenilyticus SM1988。

实施例5菌株的脂肪酸、细胞醌和极性脂成分分析

使用MIDI(Microbial Identification)公司的Sherolock全自动细菌鉴定系统对假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988进行脂肪酸成分分析，具体分析方法参照该全自动细菌鉴定系统的说明书，分析结果如表2所示。

通过薄层双向层析方法(TLC)分析实施例1筛选和分离的假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988极性脂组成，结果如图3所示。

使用反相高效液相色谱分析法，用十八烷基硅烷色谱柱(ODS 5mm，150×4.6mm)分析假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988呼吸醌组分。

表2假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988和亲缘关系相近菌株的脂肪酸含量比较

表中：1为菌种Flocculibacter collagenilyticus；2为菌种Pseudoalteromonasmariniglutinosa KMM 3635

由表2可知，假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988的主要脂肪酸为：C

实施例6

实施例1筛选和分离的假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticusSM1988在胶原蛋白降解中的应用，包括步骤如下：

将假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988接种至TYS液体培养基中进行培养，摇床转速180rpm，培养温度25℃，培养时间5d，发酵液经7000r/min，离心10min，得到的上清液即为胶原蛋白酶液；然后按照1600U/g的酶料比向牛骨胶原蛋白中加入胶原蛋白酶液，在55℃下反应2h；按照60U/g的酶料比向匀浆的鳕鱼皮中加入胶原蛋白酶液，在37℃下反应2h。两者反应完成后经7000r/min离心10min后去除沉淀，得到的上清液即为胶原蛋白酶解液。

本实施例的酶解效果如图4、图5所示，反应后，称量反应剩余的底物量，计算胶原蛋白底物的酶解率，结果如图6所示。

由图4～6可知，假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988产生的胶原蛋白酶能够高效地酶解牛骨胶原蛋白和鳕鱼皮，最高酶解率分别达到91.27％和91.97％。

本实施例中牛骨和鳕鱼皮胶原蛋白降解得到的胶原蛋白酶解液经冷冻干燥后，用流动相溶液(乙腈：蒸馏水：三氟乙酸＝45：55：0.1)配制成5.0mg/mL的胶原蛋白酶解液，待样品充分溶解后，用0.22μm的滤器过滤后，利用HPLC分析酶解液中胶原蛋白肽的分子量分布，结果如图7和表3所示。

表3牛骨胶原蛋白和鳕鱼皮酶解液中不同分子量肽段的相对丰度

由图7和表3可知，采用本发明提供的假交替单胞菌科新菌Flocculibactercollagenilyticus SM1988分泌的胶原蛋白酶来降解牛骨，所得的胶原蛋白酶解液中不同分子量的胶原蛋白肽分布比较均匀，其中分子量5000Da以下的胶原蛋白肽占总肽段40％以上；采用本发明提供的假交替单胞菌科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988来降解鳕鱼皮，所得的胶原蛋白酶解液中主要为分子量3000Da以下的低分子量胶原蛋白寡肽，占总肽段的95％以上。因此，可将假交替单胞菌科新菌Flocculibactercollagenilyticus SM1988分泌的胶原蛋白酶用于降解牛骨胶原蛋白制备含有不同分子量的胶原蛋白肽，用于降解鳕鱼皮制备低分子量胶原蛋白寡肽。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一株产生高效胶原蛋白酶的菌株及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1538

<212> DNA

<213> 假交替单胞科新菌Flocculibacter collagenilyticus SM1988

<400> 1

attgaagagt ttgatcatgg ctcagattga acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt 60

cgagcggtaa catttctagc ttgctagaag atgacgagcg gcggacgggt gagtaatgct 120

tgggtatatg ccttaaggtg ggggacaaca gttggaaacg actgctaata ccgcataatg 180

tctacggacc aaagtggggg accttcgggc ctcacgcctt aagattagcc caagtgggat 240

tagcttgttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcaacgatc cctagctggt ctgagaggat 300

gatcagccac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 360

tattggacaa tgggcgcaag cctgatccag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggccttcgg 420

gttgtaaagc actttcagcg aggaggaaag gttgtcagtt aatagctgtc agctgtgacg 480

ttactcgcag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg 540

cgagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gggcacgcag gcggttaatt aagtcagatg 600

tgaaagcccc gggctcaacc cgggaactgc atttgaaact ggttaactag agtacgagag 660

aggaaagtag aatttcaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctgaagg aataccgatg 720

gcgaaggcag ctttctggct cgatactgac gctcatgtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca 780

ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtct actagcagct cggttcgtca 840

agaactgttt tgcgcagcta acgcattaag tagaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt 900

taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 960

tgcaacgcga agaaccttac catcccttga catccagaga acttactaga gatagtttgg 1020

tgccttcggg aactctgaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgagatg 1080

ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ctatccttag ttgctagcag gtaatgctga 1140

gaactctaag gagactgccg gtgataaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc 1200

atggccctta cgggatgggc tacacacgtg ctacaatggt agatacaaag ggcagcaaga 1260

ccgcgaggtg gagcgaatcc cataaagtct atcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg 1320

actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tagatcagaa tgctacggtg aatacgttcc 1380

cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg ttgctccaga agtggttagc 1440

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ggtagcccta ggggaacctg gggctggatc acctcctt 1538