优化3-植酸酶及其在食品或饲料生产中的用途

技术领域

本发明涉及优化3-植酸酶，其是生物有效的植酸酶突变体，围绕3-植酸酶(SEQ IDNO:1)具有至少95％的序列同一性，包含SEQ ID NO:2的序列和一个或多个突变。本发明进一步涉及这样的优化3-植酸酶在食品或饲料产品的生产中的用途。

背景技术

植酸酶是从有机磷酸盐化合物(如植酸盐和植酸)中分别去除磷酸盐的酶。本领域已知多种类型的植酸酶，其中一些已经用作动物饲料产品的添加剂，以提高天然存在于动物饲料如玉米、小麦和大豆中的植酸盐的代谢和利用。植酸酶的分类首先取决于磷酸盐从植酸盐分子切割的起始位置。3-植酸酶(E.C.3.1.3.8，也称为：1-植酸酶；肌醇-六磷酸盐3-磷酸水解酶；植酸盐1-磷酸酶或植酸盐3-磷酸酶)从植酸盐分子的第3位的磷酸盐切割开始。6-植酸酶从第6位的磷酸盐切割开始。根据植酸酶的类型，发生其他位置的进一步磷酸盐切割。3-植酸酶例如能够从植酸盐中切割所有的磷酸盐基团。

向食物或饲料中添加植酸酶使得能够更好地代谢食物或饲料中的天然植酸盐内容物，因为磷酸盐是人类或动物饮食中的重要要素，但也导致粪便中残留磷的减少。粪便中的高磷含量通常导致其作为肥料的使用受到严重限制，因为许多国家对此设置严格限制。

为了克服食物或饲料的不充分天然植酸盐代谢和昂贵人工磷富集(其也已知尤其是提高肥料中的剩余磷含量)的这些缺点，已经在食物或饲料产品中引入植酸酶以在胃和消化道中提高植酸盐代谢。

目前可商购的这样的植酸酶的例子来自大肠杆菌、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)、布丘氏菌属种(Buttiauxella species)和黑曲霉(Asperigillus niger)。

这些植酸酶产品各自至少在特异性活性、剂量要求、反应时间和抑制性中间体化合物积累方面存在限制。第一类产品含有真菌3-植酸酶，其需要高酶给料以达到期望效果。目前可获得的商业饲料产品试图通过使用细菌来源的6-植酸酶来克服这一影响。然而，这些6-植酸酶的一个严重缺点是中间化合物肌醇四磷酸盐的积累，其严重限制了有效的植酸盐代谢。另外、植酸盐及其中间体，特别是肌醇四磷酸盐，与二价离子如Ca

影响植酸酶功能及其在人或动物消化道内的体内植酸酶活性的因素有多种。例如在猪中，饲料植酸酶主要在胃和小肠的上半部分中具有活性，而添加的植酸酶活性在回肠中未恢复。例如在家禽中，饲料植酸酶活性主要见于消化道的上半部分中，包括嗉囊、前胃和胗。例如对于具有胃的鱼，植酸酶活性主要在胃中。很多因素可以影响食物或饲料植酸酶在胃肠道中的效率，它们可分为三大类：(i)植酸酶相关的，(ii)饮食相关的，和(iii)受试者相关的。植酸酶相关因素包括植酸酶的类型(例如3-或6-植酸酶；细菌或真菌来源)，最适pH，和植酸酶对内源蛋白酶的抗性。饮食相关因素主要与饮食植酸盐含量、食物或饲料成分组成、食物或饲料加工，以及总P、Ca和Na含量相关。受试者相关因素包括受试者的物种、性别和年龄(Yueming Dersjant-Li等,J.Sci.Food Agric.,2015Mar 30；95(5):878–896)。

食品和饲料通常分别在高温下生产，例如以减少污染，因此食品和/或饲料生产中使用的植酸酶必须是热稳定性的。

因此，需要在宽pH范围内工作，因此在胃和肠上段中具有活性，同时在高温下稳定的植酸酶。

本发明填补了这一空白，并提供了3-植酸酶突变体，例如细菌3-植酸酶突变体，其包含导致预料不到的和令人惊讶的温度和pH稳定性的突变，其中3-植酸酶在磷酸盐切割中具有活性且高效。

发明内容

本发明涉及生物有效的植酸酶突变体，例如围绕SEQ ID NO:1具有至少96.25％的序列同一性的3-植酸酶突变体，其中所述突变体包含SEQ ID NO:2的序列和选自D149N、S189D、K190N、K191N、R210Q、L211E、L211M、K25E、K25A、G26N、G26S、N193H、N193K、N193S、N193R、D1E、P3T、G26K、K29A、T30S、T30A、T30K、D36N、Q45N、Q45R、V58E、S75C、Q76R、P107S、A112G、D120K、T129K、Q136R、Q144L、D149N、K187E、D189N、G192R、S195R、S195Y、S195T、S195N、N204I、N204T、N204S、S214A、N216D、A230T、M237L、N243K、N248K、R255H、G257S、F264Y、A275P、D276G、K295Y、K295M、Q332D、A352S、V383M、R393H、A395T及其组合的突变。

本发明的生物有效的植酸酶突变体包含例如突变D149N、S189D、K190N和K191N、或R210Q和L211M、或K25E或K25A、和G26N或G26S、和N193S或N193R；或D149N、S189D、K190N、K191N、R210Q、L211M、K25E或K25A、和G26N或G26S、和N193S或N193R。

本发明的生物有效的植酸酶突变体包含例如第25、26、193、210和/或211位的突变。

显示出有利的热稳定性的本发明的进一步有利的植酸酶突变体包含突变D149N、S189D、K190N和K191N，其中特别有利的植酸酶突变体进一步包含突变K25E或K25A；N193H、N193S、N193R或N193K和L211M或L211E。显示出有利的热稳定性的其他有利植酸酶突变体包含突变D149N、S189D、K190N、K191N、K25E或K25A、G26S或G26N、N193H、N193S、N193R或N193K、R210Q和L211M。显示出有利的热稳定性和特别好的磷酸盐释放的根据本发明的特别合适的植酸酶突变体包含突变D149N、S189D、K190N、K191N、K25E、G26S或G26N、N193S、N193R或N193K、R210Q和L211M。

本发明的生物有效的植酸酶突变体例如在高达90℃的温度下具有活性，并且例如在3-5.5的pH下具有活性。

本发明的生物有效的植酸酶突变体用于例如食品或饲料产品的生产，例如用于人和/或动物的食品或饲料产品。

本文引用或提到的所有文件(“本文引用的文件”)，和本文引用的文件中引用或提到的所有文件，以及本文提及的任何产品或本文通过引用并入的任何文件中的任何制造商说明、描述、产品规格和产品说明书，均通过引用并入本文，并可用于本发明的实践。更具体地，所有提到的文件均通过引用并入到了如同每份单独的文件均被具体且单独地指明通过引用并入的程度。

附图说明

以下附图更详细地示出了本发明，然而，本发明不限于这些附图。

图1：SEQ ID NO:2的3-植酸酶突变体关于其在应用设置中的催化性能及其作为热稳定性的衡量的IC50值的改善；*野生型SEQ ID NO:2，·SEQ ID:NO:47、SEQ ID:NO:4、SEQID:NO:6、SEQ ID:NO:7、SEQ ID:NO:8、SEQ ID:NO:10、SEQ ID:NO:14、SEQ ID:NO:19、SEQID:NO:20、SEQ ID:NO:21、SEQ ID:NO:26、SEQ ID:NO:28、SEQ ID:NO:29、SEQ ID:NO:30、SEQID:NO:31、SEQ ID:NO:34、SEQ ID:NO:1、SEQ ID:NO:37、SEQ ID:NO:38、SEQ ID:NO:39、SEQID:NO:40、SEQ ID:NO:41、SEQ ID:NO:45、和SEQ ID:NO:46的3-植酸酶突变体。

图2：在pH 2-5.5下，野生型SEQ ID NO:2和SEQ ID:NO:19、SEQ ID:NO:20、SEQ ID:NO:21、SEQ ID:NO:28、SEQ ID:NO:30、SEQ ID:NO:34、SEQ ID:NO:1的3-植酸酶突变体的pH特性。

图3：3-植酸酶突变体SEQ ID:NO:1、SEQ ID:NO:3、SEQ ID:NO:4、SEQ ID:NO:5、SEQID:NO:6、SEQ ID:NO:7、SEQ ID:NO:8、SEQ ID:NO:9、SEQ ID:NO:10、SEQ ID:NO:11、SEQ ID:NO:12、SEQ ID:NO:13、SEQ ID:NO:14、SEQ ID:NO:15、SEQ ID:NO:16、SEQ ID:NO:17、SEQID:NO:18、SEQ ID:NO:19、SEQ ID:NO:20、SEQ ID:NO:21、SEQ ID:NO:22、SEQ ID:NO:23、SEQID:NO:24、SEQ ID:NO:25、SEQ ID:NO:26、SEQ ID:NO:27、SEQ ID:NO:28、SEQ ID:NO:29、SEQID:NO:30、SEQ ID:NO:31、SEQ ID:NO:32、SEQ ID:NO:33、SEQ ID:NO:34、SEQ ID:NO:35、SEQID:NO:36、SEQ ID:NO:37、SEQ ID:NO:38、SEQ ID:NO:39、SEQ ID:NO:40、SEQ ID:NO:41、SEQID:NO:42、SEQ ID:NO:43、SEQ ID:NO:44、SEQ ID:NO:45、SEQ ID:NO:46、SEQ ID:NO:47与SEQ ID NO:2相比的生物效率指数。

具体实施方式

本发明涉及植酸酶突变体，例如与SEQ ID NO:1具有90％至97％、91％至96％、92％至95％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，至少96.25％或至少97％的序列同一性的3-植酸酶突变体，其包含或由SEQ ID NO:2的序列和一个或多个(例如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个)突变组成。

在本发明中，术语“植酸酶突变体”应被理解为指在自然界中本身不存在，但是与天然存在的植酸酶序列相比的至少一个氨基酸的遗传修饰的结果的任何序列。

植酸酶如本发明的3-植酸酶的突变选自：D149N、S189D、K190N、K191N、R210Q、L211E、L211M、K25E、K25A、G26N、G26S、N193H、N193K、N193S、N193R、D1E、P3T、G26K、K29A、T30S、T30A、T30K、D36N、Q45N、Q45R、V58E、S75C、Q76R、P107S、A112G、D120K、T129K、Q136R、Q144L、D149N、K187E、D189N、G192R、S195R、S195Y、S195T、S195N、N204I、N204T、N204S、S214A、N216D、A230T、M237L、N243K、N248K、R255H、G257S、F264Y、A275P、D276G、K295Y、K295M、Q332D、A352S、V383M、R393H、A395T及其组合。该组合包含一个或多个突变。

所得植酸酶突变体是生物有效的，即在不同条件下(其在本发明中是高温(例如高达90℃)和酸性至碱性pH(例如pH 2.5至5.5))，该植酸酶突变体始终具有活性。

在下文中，将更详细地描述本发明的要素。这些要素与特定实施方式一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建额外的实施方式。不同地描述的实施例和实施方式不应被解释为将本发明仅限制于明确描述的实施方式。该说明书应被理解为支持并包含将明确描述的实施方式与任何数量的公开要素相结合的实施方式。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应被视为被本申请的说明书公开。

在本说明书和权利要求书整体中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及诸如“包含”和“包含”的变化应被理解为暗示包含所述成员、整体或步骤或一组成员、整体或步骤，但不排除任何其他成员、整体或步骤或一组成员、整体或步骤。在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”和类似标识应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。本文中对数值的范围的记载仅旨在作为单独提及落入该范围内的每个单独数值的简化方法。除非本文中另有说明，否则每个个体数值均被引入本说明书，如同其在本说明书中单独记载。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可按任何合适的顺序执行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“如”、“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不构成对以其他方式要求保护的本发明的范围的限制。说明书中的任何语言均不应被解释为表示任何未要求保护的要素是对实施本发明必要的。

例如食品或饲料产品的温度以及因此例如食品或饲料产品中包含的植酸酶突变体的温度随着储存温度(例如-18℃，4℃或室温)、受试者(例如人或动物)的温度(例如37℃)以及食品或饲料产品的制备温度(例如在具有例如高达90℃的温度的净化过程中)而显著变化。本发明的生物有效的植酸酶突变体在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、或75℃至90℃是稳定且具有活性的，或者在高达40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或90℃是稳定且具有活性的。

另外，通过人或动物的肠道的植酸酶暴露于不同pH范围，例如在人中，唾液的pH约为6.5-7.5，上胃的pH约为4.0-6.5，下胃的pH约为1.5-4.0，十二指肠的pH约为7.0-8.5，小肠和大肠的pH约为4.0-7.0。导致磷酸盐从植酸盐以高切割率切割的高效植酸酶突变体(例如3-植酸酶突变体)必须在宽pH范围内具有活性。本发明的生物有效的植酸酶突变体分别在pH 2.5至5.5、pH 3.0至5.0、pH 3.5至4.5、3.0至5.5或pH 5.0至5.5的范围内，和例如在任何前文公开的温度和温度范围内稳定且具有活性。

通过测量特定pH下以mmol/L植酸盐表示的磷酸盐释放来测定本发明的植酸酶和植酸酶突变体的活性。性能指数(Performance Index)提供了关于与参比(例如SEQ ID NO:2)相比在不同pH下植酸酶突变体的活性的信息，定义为[(在pH X下释放的磷酸盐[mM])

生物效率指数(Bio-efficiency Index)测定与参比(例如，SEQ ID NO:2)相比植酸酶突变体的性能和热稳定性之间的相关性，定义为IC50

根据本发明使用的术语“饲料”或“饲料产品”涉及本领域技术人员已知的适合于饲养任何种类动物的任何产品，例如哺乳动物和鸟，例如但不限于反刍动物、猪、鹿、家禽，但也包括鱼或通常称为海鲜的其他水产家畜。包括的是非反刍动物的饲料产品，例如家禽、嫩鸡、鸟、鸡、火鸡、鸭、鹅和家禽；反刍动物，例如奶牛(cow)、牛(cattle)、马和羊；猪(pig)、猪(swine)、小猪、生长猪和母猪；伴侣动物，包括但不限于：猫、狗、啮齿动物和兔；鱼，包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；和甲壳类动物，包括但不限于虾(shrimp)和对虾(prawn)。

根据本发明使用的术语“食品”或“食品产品”涉及本领域技术人员已知的适合人类消费的任何产品。

本发明的饲料或食品产品例如包含淀粉。含淀粉的饲料成分通常包括植物材料，例如谷物，例如玉米(corn，maize)、小麦、大麦、黑麦、水稻、高梁和小米中的一种或多种，和/或块茎，例如土豆、木薯和甘薯。植物材料可被磨碎，例如湿磨或干磨谷物，或蒸馏干的谷物固体。

本发明的饲料或食品产品例如包含富含蛋白质的饲料成分，例如大豆(优选豆粕)、油菜籽、棕榈仁、棉籽和向日葵。

此外，饲料或食品产品包含例如选自维生素、矿物质、有机酸、益生菌成分、油、脂肪、色素、生长因子和抗微生物剂的至少一种化合物。

任选地，饲料或食品产品包含3-植酸酶突变体之外的至少一种或多种酶，例如提高饲料的可消化性和/或降解3-植酸酶突变体产生的中间产物如肌醇-四磷酸盐的食品或饲料酶，例如另外的植酸酶如6-植酸酶、淀粉酶或蛋白酶、氨肽酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，卤过氧化物酶，转化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，氧化酶，果胶分解酶，肽谷氨酰胺酶，过氧化物酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。食品或饲料酶例如来源于微生物，例如细菌或真菌，或来源于植物或动物。

饲料或食品产品例如为颗粒、紧凑物(compactate)、挤出物或液体形式。

本发明的植酸酶突变体以例如食品或饲料产品的形式施用于受试者，或直接施用而没有食品或饲料产品，例如以片剂、粉末、液体、挤出物或颗粒(例如包衣颗粒)的形式，例如具有包含盐(例如至少60％w/w的盐，例如选自NaCI、KCI、Na

本发明的植酸酶突变体用于例如食品或饲料产品的生产，例如谷物、玉米、干草、糖蜜和稻草的压丸或挤出混合物，例如干燥或液体形式。

本文中使用的“液体形式”指例如包含缓冲剂、稳定剂和抗微生物剂，以及任选地，至少一种另外的酶的组合物，其中该酶是淀粉酶、纤维素酶、乳糖酶、脂肪酶、蛋白酶、过氧化氢酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、酰胺酶、环氧化物水解酶、酯酶、磷脂酶、转氨酶、胺氧化酶、纤维二糖水解酶、氨裂解酶或其任何组合。

本文中使用的“干燥形式”指例如包含一种或多种以下成分的组合物：载体、缓冲剂、稳定剂、结合剂、增塑剂、抗微生物剂。食品或饲料产品的干燥形式包括例如蔗糖、氯化钠、山梨醇、柠檬酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠、瓜尔胶和/或小麦粉。

本发明的植酸酶突变体的序列例如如下，其在实施例中部分测试：

SEQ ID NO:1

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTENNVKTIQEGTNRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAVLKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFSGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAEKAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGRIYLHGPEVLANIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTAKYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAYLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:2

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SEQ ID NO:3

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SEQ ID NO:4

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SEQ ID NO:5

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SEQ ID NO:6

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SEQ ID NO:7

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SEQ ID NO:8

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SEQ ID NO:9

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SEQ ID NO:10

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SEQ ID NO:11

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SEQ ID NO:12

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SEQ ID NO:13

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SEQ ID NO:14

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SEQ ID NO:15

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SEQ ID NO:16

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SEQ ID NO:17

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SEQ ID NO:18

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SEQ ID NO:19

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SEQ ID NO:20

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SEQ ID NO:21

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SEQ ID NO:22

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SEQ ID NO:23

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SEQ ID NO:24

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SEQ ID NO:25

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTESNVKAIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAVLKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGRIYLHGPEVLANIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTAKYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAYLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:26

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SEQ ID NO:27

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTESNVKTIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAVLKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAEKAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSISLHGPEVLAIIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAKLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:28

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SEQ ID NO:29

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SEQ ID NO:30

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SEQ ID NO:31

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTESNVKTIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAVLKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAEKAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGRIYLHGPEVLANIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTAKYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAYLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:32

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTENNVKTIQEGTNRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAVLKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAEKAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSISLHGPEVLAIIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAKLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:33

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTASNVKKIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAVLKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGHISLHGPEVLAIIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAKLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:34

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTESNVKTIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAELKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAEKAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGRIYLHGPEVLANIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTAKYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAYLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:35

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SEQ ID NO:36

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SEQ ID NO:37

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SEQ ID NO:38

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTESNVKTIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAELKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVGIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSIRLHGPEVLAIIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAKLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:39

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTASNVAKIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAVLKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSITLHGPEVLAIIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTKDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAMLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVRYTPHHHHHH

SEQ ID NO:40

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTASNVAKIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAVLKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVEEDNNGSISLHGPEVLAIIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTKDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAMLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:41

ETTSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTASNVAKIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAVLKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSITLHGPEVLANIAETIQMSYSNDNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTAKYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAMLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVRYTPHHHHHH

SEQ ID NO:42

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTESNVKTIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAELKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSIRLHGPEVLAIIAETIQMSYANNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAKLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:43

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTEGNVKAIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAELKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSIRLHGPEVLAIIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTKDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAKLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGDRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:44

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTESNVKTIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAELKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSIRLHGPEVLAIIAETIRMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAKLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:45

DTPSAAAPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTESNVKTIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAELKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSIRLHGPEVLAIIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAKLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:46

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTESNVKTIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAELKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSIRLHGPEVLAIIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQAAAAQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAKLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

SEQ ID NO:47

DTPSSGWTLEKVVEVSRHGVRPPTESNVKTIQEGTDRQWPTWLTQYGELTGHGYAAAELKGHYEGQYLRQHGLLCQACPAPGDVFVWASPLQRTRETAMALMDGVFPGCGVAIQGPEDEDNDPLFHAETAGVTLDQQQVKADLQNAMQNKSAAQIQAQWQPAIDRLKQAVCLPDKPCPAFSTPWEVKEDNNGSIRLHGPEVAAAEVLAIIAETIQMSYSNNNPLSEVAFGHAKTAAEVAALMPLLTANYDFTNDLPYVARRGASVLMNQIALALNTEHQADAPPDAKWLLYVAHDTNIAKLRTMLGFTWQMGDYPRGNIPPAGSLIFERWRNQQSGQRVVRIYFQAQSLDQIRGLAALDDSHPPLRSEFSMPDCQKTDIGTLCPYDAVMKRLNDAVDRTALLPVHYTPHHHHHH

以下通过实施例描述本发明。这些实施例仅用于说明目的，而不在任何方面限制本发明和权利要求的范围。

实施例1：3-植酸酶突变体的热稳定性

通过测量热处理前后在乙酸缓冲液中在pH 5.5下的体积活性(volumetricactivity)，对3-植酸酶突变体的热稳定性进行了表征。在不同温度(58-85℃)下进行15分钟的热处理，并通过使用根据实施例4的光度测定法测量不同时间点的磷酸盐释放来测定酶活性。使用热处理前后的该活性确定IC50值，其中IC50定义为温度，在该温度下酶在25分钟孵育后显示50％残留活性。SEQ ID NO:2的所有3-植酸酶突变体均显示出比野生型SEQID NO:2显著更高的热稳定性，如下所示：

实施例2：在热稳定性3-植酸酶突变体的应用测试中的磷酸盐释放，所述突变体包含突变D149N、S189D、K190N、K191N、R210Q和L211M

在接近应用的测试中测定了包含突变D149N、S189D、K190N、K191N、R210Q和L211M的SEQ ID NO:2的每个3-植酸酶突变体的磷酸盐释放，并与野生型SEQ ID NO:2进行了比较。因此，在毕赤酵母中表达了3-植酸酶突变体，并根据DIN EN ISO 30024:2009(https://www.iso.org/standard/45787.html)测定了体积活性，但有微小变化(形式缩小5倍)。在该应用测试中，酶与500单位/kg饲料一起施用。在此，使用25％干物质将15g的玉米和大豆的70/30混合物在41℃下在pH 3和5下孵育60分钟。之后，使用根据实施例4的钼酸铵测定法测量释放的磷酸盐。性能指数如下计算：[(在pH 3下释放的磷酸盐[mM])

实施例3：测定SEQ ID NO:2的热稳定性3-植酸酶突变体的pH特性

3-植酸酶突变体的改善性能主要是通过向更低pH移位的pH特性来建立的。因此，通过使用根据实施例4的光度测定法测量不同pH值下的活性来测定选定的SEQ ID NO:2的3-植酸酶突变体的pH特性。图中显示与野生型SEQ ID NO:2相比所有变体的最适pH的移位。

实施例4：3-植酸酶突变体的酶活性的测定

将5pL酶溶液(在100mmol/L醋酸钠缓冲液中，pH 5.5，0.05％(w/v)Triton X-100)与在100mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.5)中的95pL2,88mmol/L植酸钠(Sigma 68388，批号BCBM4006V)一起培养25分钟。通过加入100pL 10％(w/v)三氯乙酸停止反应。随后，将100pL停止的酶促反应与100pL钼酸盐试剂(1.2％(w/v)钼酸铵，4.4％(v/v)硫酸和27mg/mL(w/v)硫酸亚铁的水溶液)混合，该溶液在室温下孵育15分钟。测定在700nm处的吸光度，并使用无机磷酸盐标准品溶液(0-1.5mmol/L)计算释放的无机磷酸盐的量。一个单位的植酸酶活性被定义为在37℃下每分钟释放1μmol磷酸盐的酶的量。