一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法

技术领域

本发明涉及花生转基因技术领域，具体而言，涉及一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法。

背景技术

花生是世界范围内广泛种植的油料和经济作物，富含油脂和蛋白质。在目前的生产工作中，花生品种的选育主要是通过常规的育种手段进行，但传统方法育成品种的遗传基础狭窄，并且野生花生资源的优良性状由于杂交不亲和等因素利用困难。基因工程技术能够将外源基因引入植物中，人为地选择目的性状基因，实现品种的快速改良。农杆菌转化法是目前植物基因工程研究中最常用的方法，具有费用低、导入基因拷贝数低等优点。

花生属于双子叶植物，是农杆菌的天然宿主之一，但其具有豆科植物共同的外源基因导入难度大的特点，使得花生遗传转化的研究受到一定的限制。虽然近年来花生的遗传转化取得了一定进展，但目前所构建的花生遗传转化体系依旧存在转化周期长、转化效率低等问题。因此提供一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法，对进一步开展花生的转基因育种工作具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法，以解决上述现有技术存在的问题，缩短花生遗传转化所需时间，提高转化效率。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法，包括以下步骤：

1)以花生半粒种子为外植体，使用含乙酰丁香酮的农杆菌侵染液体侵染；

2)侵染后的半粒种子在含有二硫苏糖醇的共培养基上暗培养3天；所述共培养基为添加乙酰丁香酮的MS基本培养基；

3)转入丛生芽筛选培养基中培养1周；所述的丛生芽筛选培养基为添加赤霉素、6-苄基嘌呤、头孢噻肟、棒酸羧噻吩青霉素和选择标记抗生素的MS基本培养基；

4)转入生根培养基中培养至根系长度＞5cm，提取叶片DNA进行PCR检测；所述生根培养基为添加头孢噻肟、棒酸羧噻吩青霉素、萘乙酸和乙哚丁酸的MS基本培养基；

所述的共培养基、丛生芽筛选培养基和生根培养基中均添加天冬酰胺和谷氨酰胺。

优选的，步骤1)中乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L。

优选的，步骤1)中选择OD

优选的，步骤2)中二硫苏糖醇的浓度为1.0mmol/L。

优选的，步骤2)中所述的共培养基配方为：MS基本培养基+100μmol/L乙酰丁香酮，PH为5.8。

优选的，步骤2)中所述的选择标记抗生素为卡那霉素。

优选的，步骤3)中所述的丛生芽筛选培养基的配方为MS基本培养基+20μmol/L 6-苄基嘌呤+1μmol/L赤霉素+300mg/L头孢噻肟+300mg/L棒酸羧噻吩青霉素+50mg/mL卡那霉素，PH为5.8。

优选的，步骤4)中所述的生根培养基配方为：MS基本培养基+300mg/L头孢噻肟+300mg/L棒酸羧噻吩青霉素+1mg/L萘乙酸+0.2mg/L乙哚丁酸，PH为5.8。

优选的，所述的共培养基、丛生芽筛选培养基和生根培养基中均添加200mg/L天冬酰胺和200mg/L谷氨酰胺。

本发明公开了以下技术效果：

本发明建立了一套农杆菌介导花生半粒种子遗传转化技术的优化体系，以花生半粒种子为外植体，通过在侵染时加入AS、共培养时加入DTT以及在培养过程所使用的各个培养基中添加200mg/L天冬酰胺和200mg/L谷氨酰胺，使得遗传转化过程能够在5周之内完成，大大缩短了离体培养时间，提高了转化效率。本发明提供的花生快速遗传转化方法能够更快获得转基因植株，为进一步利用基因工程培育转基因花生品种奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为花生半粒种子遗传转化图；其中A为消毒后浸泡在无菌水中的花生种子；B为切取花生半粒种子为外植体转入共培养基中；C为培养3d后的半粒种子；D为将半粒种子转入含有卡那霉素的丛生芽筛选培养基中；E为筛选培养后，有抗性的外植体已经长出丛生芽，且芽在伸长；F为将含有抗性的苗转入生根培养基中，约1周后开始生根；

图2为NPT II基因PCR检测；图中M为Marker：DL 2000；1为NPT II基因；2为空白对照(ddH

图3为二硫苏糖醇(DTT)对筛选效率的影响；

图4为转基因植株的PCR检测图；图中M为DL 2000；1为阳性对照；2为阴性对照；3为空白对照(ddH

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

实施例中所使用的材料和试剂如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例1

1材料和方法

1.1实验材料和仪器试剂

1.1.1供试植物材料

本研究中供试花生品种冀农花1号由河北农业大学花生实验室提供。

1.1.2实验试剂

(1)培养基

MS基本培养基，YEB培养基。培养基配方如表1所示。

表1培养基配方

(2)试验用激素、抗生素及抗氧化剂

6-苄基嘌呤(6-BA)，a-萘乙酸(NAA)，赤霉素(GA

表2激素、抗生素及抗氧化剂母液配制表

(3)酸碱指示剂，升汞(0.01％)，酒精(75％)等。

1.1.3实验仪器

本实施例中所使用的实验仪器如表3所示。

表3实验仪器信息

1.1.4质粒、菌株和载体

携带有植物表达载体质粒pBI121的根癌农杆菌EHA105为侵染菌株，植物表达载体CaMV35S启动子驱动的β-葡萄糖苷酶(β-glucuronidase，GUS)基因为标记基因，以卡那霉素(Kanamycin，Kan

1.2实验方法

1.2.1种子表面消毒

选择大小均匀、无病斑且成熟饱满的种子，反复冲洗后用纸吸干表面水分。种子浸于75％酒精中消毒1min，无菌水冲洗1次；0.1％氯化汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗5～6次。

1.2.2半粒种子外植体的制备

将冲洗后的种子浸泡于无菌水中，在黑暗条件下浸泡24h。之后，剥去种皮，使用无菌解剖刀沿着种子纵向切开，使每半粒种子均带有一半胚。再将半粒种子横向切割，保留含有胚的部分，去除没有胚的子叶部分。

1.2.3培养基及培养条件

(1)共培养基(CCM)：MS基本培养基+100μmol/L AS，PH为5.8；

(2)丛生芽筛选培养基(SIM)：MS基本培养基+20μmol/L 6-BA+1μmol/L GA

(3)生根培养基(RCM)：MS基本培养基+300mg/L Cef

(4)培养条件为：温度28℃，光照16h/d。

1.2.4质粒载体转化农杆菌

1.EHA105感受态制备

(1)从LB平板上挑取农杆菌单菌落，接种于含50μg/mL Str的LB液体培养基中，200rpm，28℃过夜培养；

(2)取2mL过夜培养液接种于含50μg/mL的Str的LB液体培养基中，相同条件下培养至OD

(3)取菌液转入无菌EP管中，冰浴30min，4℃条件下，5000rpm离心5min，去上清，加入预冷的10mL 0.1M NaCl，重悬，4℃条件下，5000rpm离心5min，去上清；

(4)再加入提前预冷的20mM CaCl

2.农杆菌转化子的检测

(1)取出-70℃保存的农杆菌感受态，冰上缓慢融化，加入2μg载体质粒DNA；

(2)混匀后冰浴45min，液氮速冻1min，迅速置于37℃水浴5min；

(3)加入500～800μL LB液体培养基，摇匀，28℃保温预培养3～5h；

(4)涂布在含有50μg/mL Str和50μg/mL卡那霉素的固体培养基，28℃培养2～3d，挑取单菌落鉴定。

菌液PCR检测的体系为20μL体系，包括菌液DNA 1.0μL，Mix 10.0μL，引物上(10μM)1.0μL，引物下(10μM)1.0μL，ddH

扩增反应参数：95℃预变性8min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸15min。

扩增产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，随后观察扩增产物大小。

1.2.5农杆菌侵染液的制备

从-70℃冰箱中取出含有目的基因的农杆菌EHA105菌株，冰上融化。用无菌移液器吸200μL的菌液加入含有100mg/mL Kan

1.2.6半粒种子的转化培养过程

将经过消毒的半粒种子浸入已制备好的侵染液(含100μmol/L AS)中25min，丢弃菌液，将侵染后的外植体放在无菌滤纸上吸干表面附着的菌液，转至不含抗生素的铺有滤纸的共培养基上暗培养3d。共培养后，将外植体转至含有Kan

1.2.6.1二硫苏糖醇(DTT)对抗性苗筛选率的影响

在共培养基中添加DTT，设置4个DTT的阶梯浓度(0、0.5、1.0和1.5mmol/L)，然后将半粒种子转至含有一定浓度的抗生素Kan

1.2.6.2添加L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的影响

为了探索L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺对遗传转化效率的影响，采取了不同的实验处理。实验选用浓度为1.0mmol/L的DTT加入到培养基中，从共培养基开始，将L-天冬酰胺和/或L-谷氨酰胺添加至3种不同的培养基类型(CCM，SIM，RCM)中，具体实验处理见表4，每处理64-72个外植体，3次重复。

表4不同氨基酸的处理组合

1.2.7转基因花生植株的PCR检测

采用CTAB法提取花生DNA，步骤如下：

(1)取0.1-0.2g花生叶片于2.0mL离心管中；

(2)加入100μL提前预热的2×CTAB提取液，用电动磨样机充分研磨6min；

(3)加入500μL的提取液，颠倒抽提1min，65℃水浴30min；

(4)加入700μL氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒抽提10-15min，11000rpm离心8min；

(5)取上清液于一新的2.0mL离心管中，加入1mL冰冷的无水乙醇，轻轻上下翻转，直到白色絮状物出现；

(6)11000rpm离心8min，以沉淀DNA；

(7)用75％乙醇清洗2次，每次离心5min，弃上清，过夜干燥；

(8)150μL ddH

(9)最后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量。

1.2.8扩增体系

卡那霉素抗性基因(NPTⅡ)的扩增引物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2)：

NPT ⅡF：5'-GACTGGGCACAACAGACAATC-3'；

NPT ⅡR：5'-CTCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3'；

扩增目的片段为750bp；

NPT Ⅱ基因PCR反应体系为20μL反应体系，包括模板DNA 1μL，Mix 10μL，引物上(10μM)1.0μL，引物下(10μM)1.0μL，ddH

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保温。

使用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.9实验数据的统计与分析

抗性筛选率(％)＝(抗性丛生芽数/接种总外植体数)×100％；

转化率(％)＝(PCR检测得到的阳性样本数/接种总外植体数)×100％；

全部数据采用Microsoft Excel 2010与统计分析软件SPSS Statistics 26进行分析。

2实验结果

2.1农杆菌介导的花生半粒种子的遗传转化

以筛选出芽诱导率最高的花生品种冀农花1号的半粒种子为外植体进行遗传转化研究，首先取制备好的半粒种子外植体转入共培养基中,各处理有64-72个外植体，培养3天后转入含有卡那霉素的丛生芽筛选培养基中筛选培养1周，待抗性外植体长出丛生芽后将含有抗性的苗转入生根培养基中，约1周后开始生根，如图1所示。

2.1.1农杆菌质粒的检测

如图2所示，用NPT II基因引物扩增出750bp的片段，说明pBI121质粒成功转进农杆菌EHA105，将转化成功的菌种于-70℃保存。

2.1.2二硫苏糖醇(DTT)对抗性筛选率的影响

如图3所示，共培养基中添加DTT浓度为1.0mmol/L时，抗性芽筛选率最高，为65.28％；共培养基中不添加DTT时，抗性芽筛选率为57.87％；其次，当DTT最高浓度为1.5mmol/L时，抗性筛选率为54.17％。因此，添加1.0mmol/L的DTT可以促进农杆菌介导花生半粒种子遗传转化效率。

2.1.3 L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的抗性芽比率分析

将花生半粒种子经过共培养后，转入含有卡那霉素的丛生芽筛选培养基中，培养1周后，在子叶和下胚轴的生长点诱导出多个芽。如表5所示，当在培养基中添加不同浓度处理的L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺时，抗性芽比率不同：当不添加L-谷氨酰胺时，抗性芽比率为65.28％；L-谷氨酰胺浓度最高为200mg/L，抗性芽比率为72.92％；L-谷氨酰胺为100mg/L，抗性芽比率最高为78.24％；L-谷氨酰胺为50mg/L，抗性芽比率最低为59.90％；由此得出，添加100mg/L L-谷氨酰胺相比不添加L-谷氨酰胺抗性芽比率增长了12.96％。当不添加L-天冬酰胺时，抗性芽比率为65.28％；L-天冬酰胺浓度最高为200mg/L，抗性芽比率为76.56％；L-天冬酰胺为50mg/L，抗性芽比率最高，为79.69％；L-天冬酰胺为150mg/L，抗性芽比率最低，为25.00％；由此看出，添加50mg/L L-天冬酰胺比不添加L-天冬酰胺抗性芽比率提高了14.41％。当添加相同组合浓度的氨基酸时，抗性芽比率为：50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，抗性芽比率最高为89.58％，与200mg/L L-天冬酰胺、200mg/L L-谷氨酰胺抗性芽比率相同；添加100mg/L L-天冬酰胺、100mg/L L-谷氨酰胺，抗性芽比率为70.83％；添加150mg/L L-天冬酰胺、150mg/L L-谷氨酰胺，抗性芽比率为66.67％；当添加不同组合浓度的氨基酸时，抗性芽比率为：100mg/L L-天冬酰胺、200mg/L L-谷氨酰胺，筛选率最低为12.50％，最高抗性芽比率比其增加了77.08％。

表5不同氨基酸处理组合的抗性芽比率统计分析

对上述不同处理进行方差分析，结果表明，25种不同氨基酸组合的抗性苗筛选率处理间表现为差异极显著，如表6所示。

表6 25种氨基酸处理组合的抗性苗筛选率方差分析

2.1.4转基因植株的PCR检测

携有植物表达载体质粒pBI121的根癌农杆菌EHA105菌株通过农杆菌介导法对花生半粒种子进行遗传转化试验，通过有阳性对照与阴性对照的PCR检测扩增出750bp的NPTⅡ特异条带，未转化植株无扩增出条带，结果如图4所示。图中阳性对照模板为含pBI121的质粒，阴性对照模板为非转化再生植株的叶片DNA，空白对照为ddH

2.1.5 L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺对转化率的影响

将经过筛选的抗性芽转入生根培养基，当根系>5cm时，提取叶片DNA后进行PCR检测。如表7所示，当不添加L-谷氨酰胺时，转化率为46.29％；添加100mg/L L-谷氨酰胺，转化率最低为28.70％；添加150mg/L L-谷氨酰胺，转化率最高为61.98％；添加最高浓度200mg/L时，转化率为58.34％。因此，添加150mg/L L-谷氨酰胺比不添加氨基酸时，转化率增加了15.69％。当不添加L-天冬酰胺时，转化率为46.29％；添加浓度为200mg/L L-天冬酰胺时，转化率最高为67.19％；添加150mg/L L-天冬酰胺，转化率最低为20.83％；因此，添加200mg/L L-天冬酰胺时比不添加氨基酸时，转化效率增加了20.90％。当添加相同组合浓度的氨基酸时，转化率为：添加50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，转化率为67.71％；添加100mg/L L-天冬酰胺、100mg/L L-谷氨酰胺，转化率为56.25％；添加150mg/L L-天冬酰胺、150mg/L L-谷氨酰胺，转化率为64.58％；添加200mg/L L-天冬酰胺、200mg/L L-谷氨酰胺，转化率最高，为71.88％。当添加不同组合浓度的氨基酸时，添加100mg/L L-天冬酰胺、200mg/L L-谷氨酰胺，转化率最低，为11.98％。综上所述，添加200mg/L L-天冬酰胺、200mg/L L-谷氨酰胺转化率最高，相比不添加氨基酸增长了25.59％。

表7不同氨基酸处理组合的转化率统计分析

对上述不同的氨基酸处理进行方差分析，如表8所示，不同氨基酸组合的抗性苗转化率处理间表现为差异极显著。

表8 25种氨基酸处理组合的抗性苗转化率方差分析

综上所述，以花生半粒种子为外植体进行遗传转化，得到一套优化后的体系：将侵染后的半粒种子置于CCM+1.0mmol/L DTT+200mg/L L-天冬酰胺+200mg/L L-谷氨酰胺的共培养基上暗培养3d；随后转入丛生芽筛选培养基SIM+200mg/L L-天冬酰胺+200mg/L L-谷氨酰胺中进行抗性筛选；1周后将抗性芽转入生根培养基RCM+200mg/L L-天冬酰胺+200mg/L L-谷氨酰胺中进行生根培养；待主根长到>5cm时，提取幼嫩叶片DNA，进行转基因植株的PCR分子检测。本实施例通过抗性苗筛选实验，发现在培养基中添加天冬酰胺与谷氨酰胺，以花生半粒种子为外植体进行农杆菌介导的花生遗传转化，从浸种到提取DNA仅用5周，抗性苗筛选率达到90％，平均转化率达到72％，大大提高了抗性苗筛选率与转化率，同时缩短了转化时间。对进一步开展花生的遗传改良工作具有重要价值。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gactgggcac aacagacaat c 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcgtcaaga aggcgataga ag 22