用抗体构建体预负载的冷冻保存的NK细胞

发明领域：

本发明提供了冷冻保存状态下的分离的人NK细胞，其在冷冻之前已用抗体构建体预负载，所述抗体构建体至少包括与免疫效应细胞的细胞表面上的受体抗原结合的第一结合结构域，尤其是在NK细胞上表达的受体抗原，以及与靶细胞的细胞表面上的细胞表面抗原结合的第二结合结构域。

背景技术：

自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的强有力的细胞毒性免疫效应细胞。它们能够识别并破坏肿瘤细胞以及已被病毒或细菌感染的细胞。NK细胞可以诱导对抗恶性细胞的抗原非依赖性免疫应答。而且，除了NK细胞之外，存在其他免疫效应细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等，它们能够杀伤肿瘤细胞或被病毒或细菌感染的细胞。一般来说，这种被理解为先天免疫。

越来越多的科学报道和临床研究已示出使用基于NK细胞的免疫疗法时的有前景的和强有力的抗肿瘤效果。目前，正在研究各种方法，其目的是增强NK细胞的数目和功能。所述方法之一是利用双特异性抗体构建体或多特异性抗体构建体，其目的是通过将内源性NK细胞与相应的靶细胞交联来增强内源性NK细胞的特异性。为了利用这样的协同作用，过继细胞疗法与基于抗体的疗法相组合的使用已经被组合用于各种适应症。用于过继转移的NK细胞的各种来源正在评估中并且包括已经历短期或长期激活或扩增的同种异体的单倍相合NK细胞、在限定条件下也扩增/激活的脐带NK细胞、NK细胞系或干细胞来源的/分化的NK细胞。所有来源理论上也可以用于生成CAR-NK细胞，其源自用慢病毒或逆转录病毒进行的新型基因修饰以产生稳定的抗原特异性NK细胞。第一实例包括目前在NHL患者中测试的CD19-CAR-NK细胞方法。

然而，当将抗体构建体与前面提及的用于过继转移的NK细胞来源的任何一种组合时，总是需要在使用点，即将疗法应用于相应患者的医院，制备细胞，以及随后，向所述患者共给药所需剂量的相应抗体构建体。除了这可能是大部分医院的物流问题的事实之外，进一步值得注意的是，用于给药的细胞的制备所需的所有工作包必须按照严格控制的方案进行以便排除增加这样的风险的任何可避免的问题。

因此，需要手段和方法以简化这样的疗法以允许适用于更大的患者组，尤其是在非专业化医院或医疗中心中。

图示出：

图1：在MM.1S(A)或DK-MG(B)靶细胞上的4h钙黄绿素释放细胞毒性测定，在指示的E:T比率下作为效应细胞的NK细胞在一次冷冻/解冻循环之前用10μg/mL的指示的抗体预负载以及被洗涤(w/)或未被洗涤(w/o)。作为对照，相同的NK细胞未被预负载，但是被洗涤并经受一次冷冻/解冻循环，并且将指示的抗体添加至细胞毒性测定中(新鲜的；实心灰色菱形)。

图2：在ELISA中分析的不同抗-CD16抗体与包被的CD16抗原变体的结合。用在图片A的图例中所示出的重组抗原变体包被96-孔ELISA板。在(A)-(D)中示出的不同的抗体在指示的浓度范围被系列稀释并在板上孵育。用抗-His-HRP在(A)-(C)中或蛋白质L-HRP检测结合的抗体。在450nm(Ext(450nm))处测量TMB底物反应。在Graphpad Prism中使用四参数逻辑(4PL)曲线模型log(激动剂)对应答-可变斜率将结合曲线进行拟合。

图3：不同的抗-CD16 scFv抗体或对照scFv或mAb与在EGFR跨膜结构域(TM)或GPI-锚定的情况下CHO细胞上表达的重组CD16抗原变体或对照EGFR抗原的反应性。

图4：在表3中总结了在实验中用作重组抗原的人和猕猴属CD16A以及人CD16B变体的细胞外结构域的序列比对。猕猴属CD16A ECD序列中的变异以灰色突出显示。CLUSTAL O(1.2.4)多序列比对工具用于比对。

图5：通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分离之后的不同的抗-CD16抗体与CD16抗原变体的结合。2μg的重组抗原蛋白被上样到每个泳道上，通过SDS-PAGE分离，在PVDF膜上留下印迹，并且与指示的一抗和二抗一起孵育。来自用DAB底物比色显影的信号示出对CD16A和CD16B抗原变体的不同的识别。

图6：在ELISA中，不同的抗CD16 scFv抗体与mAb 3G8对CD16A的结合竞争。将用CD16A (48R，158V)-mFc.67抗原包被的板与1nM的mAb3G8和在指示的浓度范围内系列稀释的不同的抗-CD16 scFv的混合物一起孵育。用山羊抗-小鼠IgG(H+L)-HRPO检测CD16A结合的3G8。在450nm(Ext(450nm))处测量TMB底物反应。在Graphpad Prism中使用四参数逻辑(4PL)曲线模型log(激动剂)对应答-可变斜率将结合曲线进行拟合。

图7：在存在或不存在10mg/mL多克隆人IgG的情况下，在37℃下，在原代人NK细胞上滴定包含来自克隆CD16-1的人Fv结构域的scFv_CD16-1(A)、包含来自克隆CD16-2的人抗-CD16Fv结构域的scFv_CD16-2(B)以及包含来自mAb 3G8的鼠Fv结构域的scFv_3G8(C)。

图8：在COLO 205(A)或KARPAS-299(B)靶细胞上的4h钙黄绿素释放细胞毒性测定，在指示的E:T比率下作为效应细胞的NK细胞用10μg/mL的指示的抗体预负载并在-80℃下冷冻。作为对照，相同的NK细胞的等分试样未被预负载(w/o抗体)，但也经受一次冷冻/解冻循环，并且将指示的抗体(EpCAM/NKG2D scFv-IgAb_75或CD30/CD16A TandAb)以10μg/mL的浓度新鲜地添加至细胞毒性测定中。绘制了两次重复裂解值的平均值和SD。实验编号：RBL1464。

定义

术语“抗体构建体”是指其中结构和/或功能是基于抗体(例如，全长或整个免疫球蛋白分子)的结构和/或功能和/或从抗体或其片段的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)结构域中提取的的分子。因此，抗体构建体能够与其特异性靶标或抗原结合。此外，在本发明上下文中所定义的抗体构建体的结合结构域包括允许靶向结合的抗体的最低结构要求。这种最低要求可以例如通过以下来定义：至少存在三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2以及CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2以及CDR3)，优选地存在所有六个CDR。定义抗体的最小结构要求的替代方法是在特异性靶标的结构内的抗体的表位的定义，分别地是组成表位区(表位簇)的靶蛋白的蛋白质结构域或通过参考与已定义的抗体的表位竞争的特异性抗体。在本发明上下文中所定义的构建体所基于的抗体包括例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体和人抗体。

在本发明上下文中所定义的抗体构建体的结合结构域可以例如包括上述提及的CDR的组。优选地，那些CDR包含在抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)的框架中；然而，它不一定要包括两者。Fd片段，例如，具有两个VH区并且通常保留完整的抗原-结合结构域的一些抗原-结合功能。抗体片段、抗体变体或结合结构域的型式(format)的额外的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab')

同样，在“结合结构域”或“结合的结构域(domain which binds)”的定义内是全长抗体的片段，诸如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab')

如本文所用，术语“单链Fv”、“单链抗体”或“scFv”是指包括来自重链和轻链两者的可变区但缺乏恒定区的单多肽链抗体片段。通常，单链抗体进一步包括在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使它能够形成允许抗原结合的期望的结构。单链抗体由Plueckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.1 13,Rosenburg and Mooreeds.Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)中详细讨论。生成单链抗体的各种方法是已知的，包括在美国专利号4,694,778和5,260,203；国际专利申请公开号WO 88/01649；Bird(1988)Science 242:423-442；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Ward等人(1989)Nature 334:54454；Skerra等人(1988)Science 242:1038-1041中描述的那些。在特定的实施方式中，单链抗体也可以是双特异性、多特异性、人和/或人源化和/或合成的。

此外，术语“抗体构建体”的定义包括单价、双价和多价(polyvalent)/多价(multivalent)构建体以及，因此，双特异性构建体，仅与两个抗原结构特异性结合，以及多特异性(polyspecific)/多特异性(multispecific)构建体，其通过不同的结合结构域与多于两个抗原结构特异性结合，例如三个、四个或更多个。而且，术语“抗体构建体”的定义包括仅由一条多肽链组成的分子以及由多于一条多肽链组成的分子，这些链可以是同一的(同源二聚体、同源三聚体或同源低聚体)或不同的(异源二聚体、异源三聚体或异源低聚体)。以上鉴定的抗体及其变体或衍生物的实例尤其描述于Harlow和Lane,Antibodies alaboratory manual,CSHL Press(1988)和Using Antibodies:alaboratory manual,CSHLPress(1999)、Kontermann和Dubel,Antibody Engineering,Springer,2nd ed.2010和Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press2009中。

术语“价”表示在抗原结合蛋白中确定数目的抗原结合结构域的存在。天然IgG具有两个抗原结合结构域因此是二价的。如在本发明上下文中所定义的抗原结合蛋白是至少三价的。在本文中描述了四价、五价和六价抗原结合蛋白的实例。

如本文所用，术语“双特异性”是指其是“至少双特异性”的抗体构建体，即，其包括至少第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域与一种抗原或靶标(此处：NK细胞受体，例如CD16a)结合，并且第二结合结构域与另一种抗原或靶标(此处：靶细胞表面抗原)结合。因此，如在本发明上下文中所定义的抗体构建体包括对至少两种不同抗原或靶标的特异性。例如，第一结构域优选地与选自人、猕猴属物种和啮齿类物种中的一个或多个物种的NK细胞受体的细胞外表位结合。

在本发明上下文中所用的术语“NK细胞受体”定义了NK细胞表面上的蛋白质和蛋白质复合物。因此，术语定义了细胞表面分子，其是NK细胞的特征，但不必要排他性地在NK细胞的表面上表达，也可以在其他细胞诸如巨噬细胞或T细胞上表达。NK细胞受体的实例包括但不限于CD16a、CD16b、NKp46和NKG2D。

“CD16A”是指在NK细胞的细胞表面上表达的激活受体CD16A，也称为FcγRIIIA。CD16A是触发NK细胞的细胞毒性活性的激活受体。抗体对CD16A的亲和力与它们触发NK细胞激活的能力直接相关，因此对CD16A的较高的亲和力减少用于激活所需的抗体剂量。抗原结合蛋白的抗原结合位点与CD16A结合，而不与CD16B结合。例如，与CD16A结合，而不与CD16B结合的包括重(VH)和轻(VL)链可变结构域的抗原结合位点可以通过与CD16A的表位特异性结合的抗原结合位点提供，所述CD16A的表位包括在CD16B中不存在的C末端序列SFFPPGYQ(SEQ ID NO:172)的氨基酸残基和/或CD16A(SEQ ID NO:23))的残基G130和/或Y141。

“CD16B”是指在中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达的受体CD16B，也称为FcγRIIIB。该受体是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的并且被理解为不触发CD16B阳性免疫细胞的任何种类的细胞毒性活性。

“NKp46”指细胞毒性活性受体，其可以有助于提高激活的天然杀伤(NK)细胞介导肿瘤细胞裂解的效率。它也称为NCR1或CD335。

“NKG2D”是指参与与各种细胞胁迫诱导的配体结合时的免疫监视的激活和共刺激受体，所述配体展示在自体肿瘤细胞和病毒感染的细胞的表面。对激活的杀伤(NK)细胞提供刺激性和共刺激性先天免疫应答，导致细胞毒性活性。通过放大T细胞激活使T细胞受体(TCR)充当CD8(+)T细胞介导的适应性免疫应答中的共刺激受体。刺激表达配体的肿瘤细胞的穿孔蛋白介导的清除。它也被称为杀伤细胞凝集素样受体K1、KLRK1或CD314。

术语“靶细胞表面抗原”是指由细胞表达的并且存在于细胞表面的抗原结构，使得其对如本文所述的抗体构建体可接近。它可以是蛋白质，优选地蛋白质的细胞外部分，于MHC环境(包括HLA-A2、HLA-A11、HLA-A24、HLA-B44、HLA-C4)中的细胞表面上存在的肽或碳水化合物结构，优选地蛋白质的碳水化合物结构，诸如糖蛋白。它优选地是肿瘤相关的或肿瘤限制性抗原。

如在本发明上下文中所定义的术语“双特异性抗体构建体”也涵盖多特异性抗体构建体诸如三特异性抗体构建体，后者包括三个结合结构域，或具有多于三种(例如四种、五种……)特异性的构建体。双特异性或多特异性抗体构建体的实例例如在WO 2006/125668、WO 2015/158636、WO 2017/064221、PCT/EP2019/056516、PCT/IB2019/053040以及Ellwanger等人(MAbs.2019Jul；11(5):899-918)中提供。

假定如在本发明上下文中所定义的抗体构建体是(至少)双特异性的，它们不会天然存在并且它们与天然存在的产物明显不同。因此，“双特异性”抗体构建体或免疫球蛋白是具有有不同特异性的至少两个不同的结合侧边(binding side)的人工杂交抗体或免疫球蛋白。可以通过各种方法，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接来产生双特异性抗体构建体。参见，例如，Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)。

本发明的抗体构建体的至少两个结合结构域以及可变结构域(VH/VL)可以或不可以包括肽接头(间隔肽)。根据本发明，术语“肽接头”包括通过其将本文定义的抗体构建体的一个(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列和另一个(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列相互连接的氨基酸序列。肽接头也可以用于将第三结构域与本文定义的抗体构建体的其他结构域融合。这样的肽接头的本质技术特征是它不包括任何聚合活性。

如在本发明上下文中所定义的抗体构建体优选地是“在体外生成的抗体构建体”。这个术语是指根据上文定义的抗体构建体，其中所有或部分的可变区(例如，至少一个CDR)是在非免疫细胞选择中生成的，例如，体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其中可以测试候选序列与抗原结合的能力的任何其他方法。因此这个术语优选地排除仅由动物的免疫细胞中的基因组重排生成的序列。“重组抗体”是通过使用重组DNA技术或基因工程制造的抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)或单克隆抗体构建体是指获自基本上同质的抗体的群的抗体，即，构成所述群的各个抗体是同一的，除了可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)可以少量存在之外。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对抗原上的单个抗原侧边或决定簇，相比之下常规(多克隆)抗体制剂其通常包括针对不同决定簇(或表位)的不同抗体。除了它们的特异性，单克隆抗体是有利的，因为它们是通过杂交瘤培养合成的，因此不受其他免疫球蛋白的污染。修饰词“单克隆”指示该抗体的特性因获自基本上同质的抗体的群，而不能被理解为根据需要通过任何特定方法产生的抗体。

对于单克隆抗体的制备，可以使用提供由连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。例如，待使用的单克隆抗体可以通过由Koehler等人,Nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制造，或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制造。产生人单克隆抗体的进一步技术的实例包括三体瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)以及EBV-杂交瘤技术(Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。

随后可以使用标准方法，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离激元共振(BIACORE

除了展示文库的使用之外，相关抗原可以被用于免疫非人动物，例如，啮齿动物(诸如小鼠、仓鼠、兔子或大鼠)。在一种实施方式中，非人动物包括至少一部分的人免疫球蛋白基因。例如，可以用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段工程化在小鼠抗体生产中缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以生产并选择源自具有期望的特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如，XENOMOUSE

单克隆抗体也可以获得自非人类动物中，以及然后使用本领域已知的重组DNA技术修饰，例如，人源化、去免疫化、渲染嵌合(rendered chimeric)等。修饰的抗体构建体的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟”抗体(参见，例如，Hawkins等人J.Mol.Biol.254,889-896(1992)和Lowman等人,Biochemistry 30,10832-10837(1991))以及具有一种或多种改变的效应物功能的抗体突变体(参见，例如，美国专利5,648,260,Kontermann和Dubel(2010),在上述引文中和Little(2009),在上述引文中)。

在免疫学中，亲和力成熟是通过这个过程B细胞在免疫应答的过程期间产生具有对抗原的增加的亲和力的抗体的过程。随着对相同抗原的重复暴露，宿主会产生连续更大的亲和力的抗体。与天然原型一样，体外亲和力成熟是基于突变和选择的原则。体外亲和力成熟已经被成功地用于优化抗体、抗体构建体和抗体片段。使用辐射、化学诱变剂或易于出错的PCR引入在CDR内的随机突变。另外，通过链改组(链替换)可以增加遗传多样性。使用展示方法如噬菌体展示的两或三轮突变和选择通常导致具有在低纳米摩尔范围内的亲和力的抗体片段。

抗体构建体的氨基酸置换的变异的优选类型涉及置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步的开发的一种或多种得到的变体相对于生成它们的亲本抗体将具有改善的生物学特性。生成这样的置换变体的便捷的方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，使若干个高变区侧边(例如6-7个侧边)突变以在每一个侧边生成所有可能的氨基酸置换。由此生成的抗体变体以单价的方式从丝状噬菌体颗粒展示为与包装在每个颗粒内的M13基因III产物的融合。然后对噬菌体展示的变体进行生物学活性(例如结合亲和力)筛选，如本文所公开的。为了鉴定用于修饰的候选高变区侧边，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合贡献显著的高变区残基。替代地或额外地，这可能有益于分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定结合结构域与，例如，人靶细胞表面抗原之间的接触点。根据本文所阐述的技术，这样的接触残基和相邻残基是置换的候选物。一旦这样的变体生成，如本文所述将变体的组(panel)经受筛选，并且在一个或多个相关测定中可以选择具有优越特性的抗体用于进一步开发。

本发明的单克隆抗体和抗体构建体特别地包括“嵌合的”抗体(免疫球蛋白)，其中重和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，虽然一条或多条链的其余部分与源自其他物种或属于其他抗体类别或亚类的抗体，以及这样的抗体的片段中的相应序列同一或同源，只要它们表现出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括源自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、类人猿等)的可变结构域抗原结合序列以及人恒定区序列的“灵长类化(primitized)”抗体。用于制造嵌合抗体的各种方法已被描述。参见例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.81:6851,1985；Takeda等人,Nature 314:452,1985；Cabilly等人,美国专利号4,816,567；Boss等人,美国专利号4,816,397；Tanaguchi等人,EP 0171496；EP 0173494；以及GB 2177096。

抗体、抗体构建体、抗体片段或抗体变体也可以通过特异性删除人T细胞表位(称作“去免疫”的方法)，通过例如WO 98/52976或WO 00/34317中公开的方法来修饰。简言之，对于与MHC II类结合的多肽可以分析抗体的重和轻链可变结构域；这些多肽表示潜在的T细胞表位(如在WO 98/52976和WO 00/34317中所定义的)。对于潜在的T细胞表位的检测，可以应用称为“肽线程”的计算机建模方法，以及此外为了VH和VL序列中存在的基序可以搜索人MHC II类结合肽的数据库，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述的。这些基序与18种主要MHC II类DR同种异型中的任何一种结合，以及因此构成潜在的T细胞表位。所检测的潜在的T细胞表位可以通过在可变结构域中置换少量的氨基酸残基，或优选地，通过单个氨基酸残基置换来消除。典型地，进行保守置换。经常，但是不排他地，可以使用与人种系抗体序列中的位置共有的氨基酸。人种系序列例如公开于Tomlinson,等人(1992)J.Mol.Biol.227:776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today Vol.16(5):237-242；以及Tomlinson等人(1995)EMBO J.14:14:4628-4638。V BASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(编译由Tomlinson,LA.等人MRC Centre for Protein Engineering,剑桥，英国)。可以使用这些序列作为人序列的来源，例如，用于框架区和CDR。也可以使用共有人框架区，例如如在美国专利号6,300,064中所描述的。

“人源化”抗体、抗体构建体、其变体或片段(诸如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')

人源化抗体或其片段可以通过以下生成：用来自人Fv可变结构域的等效序列替代不直接参与抗原结合的Fv可变结构域的序列。用于生成人源化抗体或其片段的示例性方法通过Morrison(1985)Science 229:1202-1207；通过Oi等人(1986)BioTechniques 4:214；以及通过US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；以及US 6,407,213提供。这些方法包括分离、操纵和表达编码来自重或轻链中的至少一条的免疫球蛋白Fv可变结构域的所有或部分的核酸序列。这样的核酸可以获自产生针对预定的靶标的抗体的杂交瘤，如上文所述的，以及获自其他来源。然后，编码人源化抗体分子的重组DNA可以被克隆到适当的表达载体中。

也可以使用转基因动物来产生人源化抗体，诸如表达人重和轻链基因但不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重和轻链基因的小鼠。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例性CDR移植方法(美国专利号5,225,539)。特定的人抗体的全部CDR可以被至少一部分非人CDR替代，或者仅一些CDR可以被非人CDR替代。只需要替代人源化抗体与预定的抗原结合所需的CDR数目。

可以通过保守置换、共有序列置换、种系置换和/或回复突变的引入来优化人源化抗体。这样的改变的免疫球蛋白分子可以是通过本领域已知的若干种技术中的任何一种来制造，(例如，Teng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:7308-7312,1983；Kozbor等人,Immunology Today,4:7279,1983；Olsson等人,Meth.Enzymol.,92:3-16,1982，以及EP 239400)。

术语“人抗体”、“人抗体构建体”和“人结合结构域”包括具有抗体区(诸如基本上相当于本领域内已知的人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区或结构域)的抗体、抗体构建体和结合结构域，包括，例如，由Kabat等人(1991)(在上述引文中)描述的那些。如在本发明上下文中所定义的人抗体、抗体构建体或结合结构域可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或特定侧边诱变或由体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中，以及特别地在CDR3中。人抗体、抗体构建体或结合结构域可以具有至少一、二、三、四、五或更多个位置，其被不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替代。然而，如本文所用，人抗体、抗体构建体或结合结构域的定义，也设想了“全人抗体(fullyhuman antibodies)”，其包括仅非人工和/或基因改变的人抗体序列，如可以通过使用技术或系统诸如Xenomouse衍生的那些。优选地，“全人抗体”不包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基。

在一些实施方式中，本文所定义的抗体构建体是“分离的”或“基本上纯的”抗体构建体。当用于描述本文所公开的抗体构建体时，“分离的”或“基本上纯的”意指已经从其生产环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体构建体。优选地，抗体构建体与其生产环境中的所有其他组分无关或基本上无关。其生产环境的污染物组分(诸如由重组转染细胞产生的)是将典型地干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。抗体构建体可以例如构成在给定样品中的总蛋白质的按重量计至少约5％，或至少约50％。应当理解分离的蛋白质可以构成总蛋白质含量的按重量计5％至99.9％，取决于情况。可以通过使用诱导型启动子或高表达启动子以显著更高的浓度制造多肽，使得其以增加的浓度水平制造。定义包括在本领域已知的各种各样的生物体和/或宿主细胞中产生抗体构建体。在优选的实施方式中，抗体构建体将被纯化(1)至足以通过使用转杯(旋杯)序列分析仪获得N末端的至少15个残基或内氨基酸序列的程度，或(2)至同质性通过SDS-PAGE在非还原或还原的条件下使用考马斯蓝或，优选地，银染色。通常地，然而，分离的抗体构建体将由至少一个纯化步骤制备。

本发明有关的术语“结合结构域”的特征在于(特异性)与以下结合/与以下反应/识别以下的结构域：在靶分子(抗原)上的给定靶表位或给定靶侧边，例如分别为NK细胞受体抗原(例如CD16)和靶细胞表面抗原。第一结合结构域的结构和功能(识别例如CD16)，以及优选地还有第二结合结构域的结构和/或功能(识别靶细胞表面抗原)，是基于抗体(例如全长或整个免疫球蛋白分子)的结构和/或功能和/或从抗体或其片段的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)结构域中提取。优选地第一结合结构域的特征在于三种轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2以及CDR3)和/或三种重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2以及CDR3)的存在。第二结合结构域优选地也包括允许靶标结合的抗体的最低结构要求。更优选地，第二结合结构域至少包括三种轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2以及CDR3)和/或三种重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2以及CDR3)。可以设想，第一和/或第二结合结构域是通过噬菌体展示或文库筛选方法，而不是通过将CDR序列从预先存在的(单克隆)抗体移植到支架中来生产或可获得的。

根据本发明，结合结构域以一种或多种多肽的形式存在。这样的多肽可以包括蛋白质的部分和非蛋白质的部分(例如化学接头或化学交联剂诸如戊二醛)。蛋白质(包括其片段，优选地生物活性片段，和肽，通常具有少于30个氨基酸)包括通过共价肽键相互偶联的两个或更多个氨基酸(产生氨基酸的链)。

如本文所用，术语“多肽”描述了通常由多于30个氨基酸组成的分子的组。多肽可以进一步形成多聚体诸如二聚体、三聚体和更高级低聚物，即，由多于一种多肽分子组成。形成这样的二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此这样的多聚体的对应高序结构称为同源或异源二聚体，同源或异源三聚体等。异源多聚体的实例是抗体分子，以其天然存在形式其由两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链组成。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”也指天然修饰的肽/多肽/蛋白质，其中修饰受例如翻译后修饰影响，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。当在本文中提及时，“肽”、“多肽”或“蛋白质”也可以是化学修饰的，诸如聚乙二醇化的(pegylated)。这样的修饰是本领域内众所周知的并且在下文中描述。

优选地与NK细胞受体抗原(例如CD16)结合的结合结构域和/或与靶细胞表面抗原结合的结合结构域是人结合结构域。包含至少一个人结合结构域的抗体和抗体构建体避免了与具有非人诸如啮齿动物(例如鼠类、大鼠、仓鼠或兔子)可变和/或恒定区的抗体和抗体构建体相关的一些问题。这样的源于啮齿动物的蛋白质的存在可以导致抗体或抗体构建体的快速清除或可以导致患者生成针对抗体或抗体构建体的免疫应答。为了避免源于啮齿动物的抗体或抗体构建体的使用，人或全人抗体/抗体构建体可以通过以下来生成：将人抗体功能引入到啮齿动物体内使得啮齿动物产生全人抗体。

在YAC中克隆和重构兆碱基大小的人基因座以及将它们引入到小鼠种系的能力提供了阐明非常大的功能组分或粗略映射的基因座以及生成人疾病的有用模型的强有力的方法。此外，使用这样的技术以将小鼠基因座用它们的人等效物置换可以对人基因产物在发育期间的表达和调控、它们与其他系统的交流以及它们参与疾病诱导和进展提供独特的洞见。

这样的策略的重要的实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入到其中内源性Ig基因已被灭活的小鼠中为研究抗体的程序化表达和组装的潜在机制以及它们在B细胞发育中的作用提供了机会。此外，这样的策略可以为生产全人单克隆抗体(mAb)提供了理想的来源—实现人疾病抗体疗法的希望的重要的里程碑。预期全人抗体或抗体构建体将最小化小鼠或源于小鼠的mAb固有的免疫原性和变态反应，以及因此提高给药的抗体/抗体构建体的疗效和安全性。预期全人抗体或抗体构建体的使用在需要反复的化合物给药的慢性病和复发的人疾病(诸如炎症、自身免疫和癌症)的治疗上提供了实质性优势。

实现这个目标的一种方法是预先用人Ig基因座的大片段工程化小鼠抗体产生不足的小鼠品系，以至于这样的小鼠在没有小鼠抗体的情况下产生大的人抗体库。大的人Ig片段将保留大量可变基因多样性以及抗体产生和表达的适当的调控。通过利用用于抗体多样化和选择的小鼠体制以及对人蛋白质缺乏免疫耐受，在这些小鼠品系中再生产的人抗体库应当出产对任何感兴趣的抗原(包括人抗原)的高亲和力抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地生产并选择具有期望的特异性的抗原特异性人mAb。这种一般的策略被证明与第一XenoMouse小鼠品系的生成有关(参见Green等人Nature Genetics 7:13-21(1994))。XenoMouse品系是用分别包含人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段的酵母人工染色体(YAC)工程化的，其包含核心可变和恒定区序列。包含YAC的人Ig被证明与小鼠系统在抗体的重排和表达两者上都是相容的，并且能够置换灭活的小鼠Ig基因。这个通过它们诱导B细胞发育、产生全人抗体的成年样人库以及生成抗原特异性的人mAb的能力来证明。这些结果也表明了包含大量数目的V基因、额外的调控元件和人Ig恒定区的更大部分的人Ig基因座的引入可以基本上概括以针对感染和免疫的人体液应答为特征的全库。Green等人的工作最近扩展到通过分别引入人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的种系构型YAC片段来引入大于约80％的人抗体库。参见Mendez等人NatureGenetics 15:146-156(1997)以及美国专利申请序列号08/759,620。

XenoMouse小鼠的产生进一步讨论和描述于美国专利申请序列号07/466,008、序列号07/610,515、序列号07/919,297、序列号07/922,649、序列号08/031,801、序列号08/112,848、序列号08/234,145、序列号08/376,279、序列号08/430,938、序列号08/464,584、序列号08/464,582、序列号08/463,191、序列号08/462,837、序列号08/486,853、序列号08/486,857、序列号08/486,859、序列号08/462,513、序列号08/724,752和序列号08/759,620；以及美国专利号6,162,963；6,150,584；6,1 14,598；6,075,181和5,939,598以及日本专利号3 068 180B2、3 068 506B2和3 068 507B2。还参见Mendez等人Nature Genetics 15:146-156(1997)和Green和Jakobovits J.Exp.Med.188:483-495(1998)、EP 0 463 151B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310以及WO 03/47336。

在替代的方法中，其他的，包括GenPharm International,Inc.已经利用了“微小基因座”方法。在微小基因座方法中，外源性Ig基因座是通过包含来自Ig基因座的块(piece)(单个基因)来模拟的。因此，一种或多种VH基因、一种或多种DH基因、一种或多种JH基因、mu恒定区以及第二恒定区(优选地γ恒定区)形成用于插入到动物中的构建体。这种方法描述于Surani等人的美国专利号5,545,807，以及Lonberg和Kay的各个美国专利号5,545,806；5,625,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；5,770,429；5,789,650；5,814,318；5,877,397；5,874,299；和6,255,458，Krimpenfort和Berns的美国专利号5,591,669和6,023.010；Berns等人的美国专利号5,612,205；5,721,367和5,789,215；以及Choi和Dunn的美国专利号5,643,763，以及GenPharm国际美国专利申请序列号07/574,748、序列号07/575,962、序列号07/810,279、序列号07/853,408、序列号07/904,068、序列号07/990,860、序列号08/053,131、序列号08/096,762、序列号08/155,301、序列号08/161,739、序列号08/165,699、序列号08/209,741。还参见EP 0 546073B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美国专利号5,981,175。进一步参见Taylor等人(1992)、Chen等人(1993)、Tuaillon等人(1993)、Choi等人(1993)、Lonberg等人(1994)、Taylor等人(1994)以及Tuaillon等人(1995)、Fishwild等人(1996)。

Kirin也已证明了从小鼠中生成人抗体，在小鼠中，通过微细胞融合引入了大块的染色体或整个染色体。参见欧洲专利申请号773 288和843 961。Xenerex Biosciences正在开发用于人抗体的潜在生成的技术。在这种技术中，用人淋巴细胞重构SCID小鼠，例如，B和/或T细胞。然后用抗原使小鼠免疫并且可以生成针对该抗原的免疫应答。参见美国专利号5,476,996；5,698,767；和5,958,765。

人抗-鼠抗体(HAMA)应答已导致制备嵌合或其他人源化抗体的行业。然而，预期某些人抗-嵌合抗体(HACA)应答将被观察到，特别是在抗体的慢性或多剂量利用中。因此，提供包括针对靶细胞表面抗原的人结合结构域和针对CD16的人结合结构域的抗体构建体将是合乎期望的，以便削弱HAMA或HACA应答的问题和/或影响。

根据本发明，术语“与……(特异性)结合”、“(特异性)识别”、“(特异性)涉及”以及“与……(特异性)反应”意指与在靶分子(抗原)(此处：分别为NK细胞受体(例如CD16a)和靶细胞表面抗原)上的给定靶表位或给定靶侧边相互作用或特异性相互作用的结构域。

术语“表位”是指结合结构域(诸如抗体或免疫球蛋白，或抗体或免疫球蛋白的衍生物、片段或变体)所特异性结合的抗原上的侧边。“表位”是抗原的以及因此术语表位有时在本文中也指“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此，结合结构域是“抗原相互作用侧边”。所述结合/相互作用也被理解为定义“特异性识别”。

“表位”可以通过连续的氨基酸或由蛋白质的三级折叠并列的非连续的氨基酸两者形成。“线性表位”是其中氨基酸一级序列包括所识别的表位的表位。线性表位典型地包括在单一序列中的至少3或至少4，以及更通常地，至少5或至少6或至少7，例如，约8至约10个氨基酸。

与线性表位相比，“构象表位”是其中包括表位的氨基酸的一级序列不是被识别的表位的唯一决定组分的表位(例如，其中氨基酸的一级序列不是必需被结合结构域识别的表位)。典型地，构象表位包括相对于线性表位的增加数目的氨基酸。关于构象表位的识别，结合结构域识别抗原、优选地肽或蛋白质或其片段的三维结构(在本发明上下文中，结合结构域中的一个的抗原结构包括在靶细胞表面抗原蛋白质之内)。例如，当蛋白质分子折叠以形成三维结构时，某些氨基酸和/或形成构象表位的多肽主链变为并列的以使抗体能够识别表位。测定表位的构象的方法包括但不限于，x射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)光谱和定点自旋标记和电子顺磁共振(EPR)光谱。

在结合结构域与表位或包括表位的区之间的相互作用意指结合结构域对在特定蛋白质或抗原(此处：分别为NK细胞受体(例如CD16a)和靶细胞表面抗原)上的表位/包括表位的区展现出相当可观的亲和力以及，通常不展现，与除NK细胞受体(例如CD16a)和靶细胞表面抗原以外的蛋白质或抗原的显著的反应性。“相当可观的亲和力”包括以约106M(KD)或更强的亲和力结合。优选地，当结合亲和力为约10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M，优选地约10-11至10-9M时，结合被认为是特异性的。结合结构域与靶标是否特异性反应或结合可以尤其通过以下来容易地测试：将所述结合结构域与靶蛋白质或抗原的反应与所述结合结构域与除了NK细胞受体(例如CD16a)和靶细胞表面抗原以外的蛋白质或抗原的反应比较。优选地，如在本发明上下文中所定义的结合结构域本质上或基本上不与除了NK细胞受体(例如CD16a)和靶细胞表面抗原之外的蛋白质或抗原结合(即，第一结合结构域不能够与除了NK细胞受体例如CD16a以外的蛋白质结合，以及第二结合结构域不能够与除了靶细胞表面抗原以外的蛋白质结合)。

术语“本质上/基本上不结合”或“不能够结合”意指本发明的结合结构域不与除了NK细胞受体(例如CD16a)和靶细胞表面抗原以外的蛋白质或抗原结合，即没有示出与除了NK细胞受体(例如CD16a)和靶细胞表面抗原以外的蛋白质或抗原的多于30％的反应性，优选地不多于20％，更优选地不多于10％，特别优选地不多于9％、8％、7％、6％或5％，其中与NK细胞受体(例如CD16a)和靶细胞表面抗原的结合分别被设置为100％。

据信，特异性结合受结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特异性基序的影响。因此，结合是作为它们的一级、二级和/或三级结构的结果以及所述结构的二次修饰的结果来实现的。抗原-相互作用-侧边与其特异性抗原的特异性相互作用可以导致所述侧边与抗原的简单结合。而且，抗原-相互作用-侧边与其特异性抗原的特异性相互作用可以替代地或额外地导致信号的启动，例如因为抗原构象变化、抗原的寡聚化等的诱导。

术语“可变”是指在它们的序列中展现出可变性以及参与到决定特定抗体的特异性和结合亲和力的抗体或免疫球蛋白结构域的部分(即，“一个或多个可变结构域”)。可变重链(VH)和可变轻链(VL)的配对一起形成单个抗原-结合侧边。

可变性在抗体的整个可变结构域不是均匀分布的；它集中在重和轻链可变区中的每一个的子结构域中。这些子结构域被称作“高变区”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守(即，非高变)的部分被称为“框架”区(FRM和FR)，并为六个CDR在三维空间中提供支架来形成抗原结合表面。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包括四个FRM区(FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采用β-片构型，由三个高变区连接，其形成环连接，以及在一些情况下，形成β-片结构的部分。每条链中的高变区，通过FRM与来自其他链的高变区紧密地保持在一起，有助于抗原结合侧边的形成(参见Kabat等人,在上述引文中)。

术语“CDR”，及其复数形式“CDRs”是指互补决定区，其中三者(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)构成了轻链可变区的结合特性，以及三者(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)构成了重链可变区的结合特性。CDR包含负责抗体与抗原的特异性相互作用的大多数残基以及因此有助于抗体分子的功能活性：它们是抗原特异性的主要决定簇。

确切定义的CDR边界和长度经受不同的类别和编号系统。CDR可以因此通过以下被提及：Kabat、Chothia、接触或任何其他边界定义，包括本文所描述的编号系统。尽管边界不同，这些系统中的每一个都具有一定程度的重叠，在其中构成可变序列内的所谓的“高变区”。根据这些系统的CDR定义可以因此相对于邻近的框架区在长度和边界区域上有所不同。参见例如Kabat(an approach based on cross-species sequence variability)、Chothia(an approach based on crystallographic studies of antigen-antibodycomplexes)和/或MacCallum(Kabat等人,在上述引文中；Chothia等人,J.Mol.Biol,1987,196:901-917；以及MacCallum等人,J.Mol.Biol,1996,262:732)。用于表征抗原结合侧边的又一个标准是由Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的AbM定义。参见，例如，Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.In:Antibody Engineering Lab Manual(Ed.:Duebel,S.和Kontermann,R.,Springer-Verlag,海德堡(Heidelberg))。达到了两个残基鉴定技术定义重叠区，而不是同一区的程度，将它们组合以定义杂交体CDR。然而，根据所谓的Kabat系统的编号是优选的。

典型地，CDR形成的环结构，其可以被分类为典范结构(canonical structure)。术语“典范结构”是指通过抗原结合(CDR)环被采用的主链构象。来自比较结构研究，已发现六个抗原结合环中的五个仅具有可用构象的受限的库。每个典范结构可以通过多肽主链的扭转角来表征。抗体之间的对应的环可以，因此，具有非常相似的三维的结构，尽管在环的大部分中的高氨基酸序列可变性(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,1987,196:901；Chothia等人,Nature,1989,342:877；Martin和Thornton,J.Mol.Biol,1996,263:800)。此外，在采用的环结构与围绕着它的氨基酸序列之间存在关系。特定的典范类别的构象是通过环的长度以及环内和保守框架内(即，环的外部)的置于关键位置的氨基酸残基来确定的。特定的典范类别的分配(Assignment)可以因此基于这些关键氨基酸残基的存在来进行。

术语“典范结构”也可以包括关于抗体的线性序列的考虑，例如，如由Kabat编目的(Kabat等人,在上述引文中)。Kabat编号方案(系统)是用于以一致的方式对抗体可变结构域的氨基酸残基编号的广泛采用的标准，以及是在本发明中应用的如还在本文中别处提到的优选的方案。也可以使用额外的结构考虑以决定抗体的典范结构。例如，通过Kabat编号没有充分反映的这些差异可以通过Chothia等人的编号系统描述和/或通过其他技术揭示，例如，晶体学和二维或三维计算模型。因此，可以将给定的抗体序列置于允许尤其鉴定合适的底盘序列(chassis sequences)的典范类别中(例如，基于在文库中包括各种典范结构的要求)。如通过Chothia等人,在上述引文中所描述的抗体氨基酸序列的Kabat编号和结构考虑及其用于解释抗体结构的典范方面的含义在文献中被描述。免疫球蛋白的不同类别的亚单位结构和三维构型在本领域是众所周知的。关于抗体结构的综述，参见Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,eds.Harlow等人,1988。免疫信息学中的全局参考是IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的三维(3D)结构数据库(Ehrenmann等人,2010,Nucleic Acids Res.,38,D301-307)。IMGT/3D结构-DB结构的数据从蛋白质数据库(PDB)中提取并且根据IMGT的分类概念，使用内部工具注释。因此通过将这些序列与IMGT结构域参考目录比对，IMGT/3D结构-DB提供了在3D结构的氨基酸序列中表达的最接近的基因和等位基因。对于抗原受体的这个目录包含由恒定基因编码的结构域的氨基酸序列以及种系可变和连接基因的翻译。我们的氨基酸序列的CDR区优选地通过使用IMGT/3D结构数据库来确定。

轻链的CDR3以及，特别地，重链的CDR3可以构成在轻链和重链可变区内的抗原结合中的最重要的决定簇。在一些抗体构建体中，重链CDR3似乎构成抗原与抗体之间的主要接触区域。其中仅CDR3被改变的体外选择方案可以用于改变抗体的结合特性或决定哪些残基有助于抗原的结合。因此，CDR3典型地是抗体结合侧边内的分子多样性的最大来源。H3，例如，可以短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。

在经典的全长抗体或免疫球蛋白中，每条轻(L)链通过一个共价的二硫键与重(H)链连接，而两条H链通过取决于H链同种型的一个或多个二硫键相互连接。最接近于VH的CH结构域通常被指定为CH1。恒定(“C”)结构域并不直接参与抗原结合，但是展现出各种效应物功能，诸如抗体依赖性、细胞-介导的细胞毒性和补体激活。抗体的Fc区被包括在重链恒定结构域内并且例如能够与位于细胞表面的Fc受体相互作用。

组装和体细胞突变之后的抗体基因的序列是高度改变的，并且据估计这些改变的基因编码10

在本发明上下文中所定义的抗体构建体也可以包括额外的结构域，其例如是，有助于分子的分离或涉及分子的适应性药代动力学特征。有助于抗体构建体的分离的结构域可以选自肽动机(motive)或二次引入的部分，其可以在分离方法(例如分离柱)中捕获。这样的额外的结构域的非限制性实施方式包括称为Myc-标签、HAT-标签、HA-标签、TAP-标签、GST-标签、甲壳质结合结构域(CBD-标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP-标签)、Flag-标签、Strep-标签和其变体(例如Strepll-标签)和His-标签的肽动机。所有本文所公开的通过鉴定的CDR表征的抗体构建体可以包括His-标签结构域，其通常被称为在分子的氨基酸序列中重复的连续His残基，优选地五个，并且更优选地六个His残基(六组氨酸)。His-标签可以位于例如，抗体构建体的N端或C端，优选地，其位于C端。更优选地，通过肽键将六组氨酸标签(HHHHHH)(SEQ.ID NO：25)与根据本发明的抗体构建体的C端连接。额外地，PLGA-PEG-PLGA的缀合系统可以与聚组氨酸标签组合以用于缓释应用和改进的药代动力学特征。

还设想了本文所述的抗体构建体的氨基酸序列修饰。例如，提高抗体构建体的结合亲和力和/或其他生物学特性可以是合乎期望的。抗体构建体的氨基酸序列变体是通过将合适的核苷酸变化引入到抗体构建体核酸，或通过肽合成而制备的。所有的下文所述的氨基酸序列修饰应当导致其仍然保留未修饰的亲本分子的期望的生物学活性(与NK细胞受体(例如CD16a)和靶细胞表面抗原结合)的抗体构建体。

术语“氨基酸”或“氨基酸残基”典型地是指具有本领域公认的定义的氨基酸，诸如选自由以下组成的组的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gin或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)：亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；以及缬氨酸(Val或V)，尽管可以按期望使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸。通常，可以将氨基酸分组为具有非极性侧链(例如，Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；负电荷的侧链(例如，Asp、Glu)；正电荷的侧链(例如，Arg、His、Lys)；或不带电荷的极性侧链(例如，Asn、Cys、Gin、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp以及Tyr)。

氨基酸修饰包括，例如，抗体构建体的氨基酸序列内的残基的删除和/或插入和/或置换。进行删除、插入和置换的任何组合以得到最终构建体，前提是最终构建体拥有期望的特征。氨基酸变化也可以改变抗体构建体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目和位置。

例如，可以在每个CDR中插入、置换或删除1、2、3、4、5或6个氨基酸(当然，这取决于它们的长度)，而可以在每个FR中插入、置换或删除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。优选地，插入到抗体构建体的氨基酸序列包括长度范围从为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基至包含数百个或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。对应的修饰也可以在本发明上下文中所定义的抗体构建体的第三结构域内进行。在本发明上下文中所定义的抗体构建体的插入变体包括与酶的抗体构建体的N端或C端的融合或与多肽的融合。

对置换诱变最感兴趣的位点包括(但不限于)重和/或轻链的CDR，特别地高变区，但也设想了FR在重和/或轻链中的改变。置换优选地是如本文所述的保守置换。优选地，在CDR中可以置换1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，而在框架区(FR)中，可以置换1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸，这取决于CDR或FR的长度。例如，如果CDR序列包含6个氨基酸，可以设想这些氨基酸中的一个、二个或三个被置换。类似地，如果CDR序列包含15个氨基酸，可以设想这些氨基酸中的一个、二个、三个、四个、五个或六个被置换。

用于鉴定用于诱变的优选的位置的抗体构建体的某些残基或区的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如通过Cunningham and Wells in Science,244:1081-1085(1989)所描述的。在此，抗体构建体内的残基或靶残基组是由中性或带负电荷的氨基酸(最优选地丙氨酸或聚丙氨酸)鉴定的(例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys以及glu)以及替换的，以影响氨基酸与表位的相互作用。

然后通过在置换的位点上或向置换的位点引入另外的或其他变体来将展示出对置换的功能灵敏度的那些氨基酸位置精炼。因此，虽然用于引入氨基酸序列变异的位点或区是预定的，但突变本身的性质并不是需要预定的。例如，为了分析或优化给定位点上突变的性能，可以在靶密码子或区进行丙氨酸扫描或随机诱变，并且筛选表达的抗体构建体变体用于期望的活性的最优组合。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点进行置换突变的技术是众所周知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。突变体的筛选是使用抗原结合活性(诸如NK细胞受体(例如CD16a)和靶细胞表面抗原结合)的测定来完成的。

通常，如果氨基酸在重和/或轻链中的一个或多个或全部的CDR中被置换，则优选的是，然后获得的“置换的”序列与“原始的”CDR序列是至少60％或65％，更优选地70％或75％，甚至更优选地80％或85％，以及特别优选地90％或95％同一的。这意指它取决于与“置换的”序列以何种程度同一的CDR的长度。例如，为了具有置换的至少一个氨基酸，具有5个氨基酸的CDR与其置换的序列是优选地80％同一的。因此，抗体构建体的CDR与它们的置换的序列可以具有不同程度的同一性，例如，CDRL1可以具有80％，而CDRL3可以具有90％。

优选的置换(或替代)是保守置换。然而，设想了任何置换(包括非保守置换或来自下文表3中列出的“示例性置换”中的一个或多个)，只要抗体构建体保持其通过第一结构域与NK细胞受体(例如CD16a)结合以及通过第二结构域与靶细胞表面抗原结合的能力，和/或它的CDR具有与然后置换的序列的同一性(与“原始的”CDR序列是至少60％或65％，更优选地70％或75％，甚至更优选地80％或85％，以及特别优选地90％或95％同一的)。

保守置换在“优选的置换”的标题下的表1中示出。如果这样的置换导致生物学活性的变化，然后更多的实质上的变化，则可以引入在表1中命名的“示例性置换”或如在下文中参考氨基酸类别进一步描述的，并且为了期望的特征对产物进行筛选。

表1：氨基酸置换

本发明的抗体构建体的生物学特性中的实质上的修饰通过选择对维持以下的影响显著不同的置换来完成：(a)置换的区域中的多肽主链的结构，例如，作为片状或螺旋构象，(b)在靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的本体。基于共同的侧链特性，将天然存在的残基分组为：(1)疏水的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水的：cys、ser、thr、asn、gin；(3)酸性的：asp、glu；(4)碱性的：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；以及(6)芳族：trp、tyr、phe。

非保守性置换将要求将这些类别中之一的成员与另一个类别交换。不涉及维持抗体构建体的适当的构象的任何半胱氨酸残基可以被置换，通常用丝氨酸，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可以向抗体添加一个或多个半胱氨酸键以提高其稳定性(特别是其中抗体是抗体片段，诸如Fv片段)。

对于氨基酸序列、序列同一性和/或相似性是通过使用本领域已知的标准技术测定的，包括但不限于，Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482的局部序列同一性算法、Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的序列同一性比对算法、Pearson和Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85:2444的相似性搜索方法、这些算法的计算机实现(GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,科学大道575号(575Science Drive)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(Wis.))、通过Devereux等人,1984,Nucl.Acid Res.12:387-395描述的the BestFit序列程序，优选地使用默认设置或通过检查。优选地，百分比同一性通过基于以下参数的FastDB计算：不匹配罚分为1；缺口罚分为1；缺口大小罚分为0.33；以及连接罚分为30，"Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,"Macromolecule Sequencingand Synthesis,Selected Methods and Applications,pp 127-149(1988),Alan R.Liss,Inc.。

有用的算法的实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的配对比对创建来自相关序列组的多个序列比对。它还可以绘制示出了用于创建比对的聚类关系的树。PILEUP使用Feng&Doolittle,1987,J.Mol.Evol.35:351-360的渐进的比对方法的简化；该方法与通过Higgins和Sharp,1989,CABIOS 5:151-153描述的方法类似。有用的PILEUP参数包括默认缺口权重为3.00，默认缺口长度权重为0.10，以及加权末端缺口。

有用的算法的其他实例是BLAST算法，描述于：Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402；以及Karin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5787。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其获得自Altschul等人,1996,Methods in Enzymology 266:460-480。WU-BLAST-2使用了若干个搜索参数，其大多数设置为默认值。可调整的参数设置为以下值：重叠间隔＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝ll。HSP S和HSP S2参数是动态值并且是由取决于特定序列的组成以及被搜索到感兴趣的序列的特定数据库的组成的程序本身建立的；然而，可以调整这些值以提高灵敏度。

额外的有用的算法是如由Altschul等人,1993,Nucl.Acids Res.25:3389-3402所报道的gapped BLAST。Gapped BLAST使用BLOSUM-62置换分；阈值T参数设置为9；触发无缺口扩展的两次命中方法，对k的缺口长度扣除10+k的分数；Xu设置为16，以及Xg在数据库搜索阶段设置为40，并在算法的输出阶段设置为67。缺口比对是由对应于约22位的分数触发的。

通常，单个变体CDR或VH/VL序列之间的氨基酸同源性、相似性或同一性是本文描绘的序列的至少60％，以及更典型地具有优选地增加至少65％或70％的同源性或同一性，更优选至少75％或80％，甚至更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及几乎100％。以类似的方式，关于本文鉴定的结合蛋白质的核酸序列的“百分比(％)核酸序列同一性”被定义为在候选序列中与抗体构建体的编码序列中的核苷酸残基同一的核苷酸残基的百分数。特定的方法利用设置为默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模型，其中重叠间隔和重叠分数分别设置为1和0.125。

通常，在编码单独的变体CDR或VH/VL序列的核苷酸序列与本文描绘的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性是至少60％，以及更典型地具有优选地增加至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以及几乎100％的同源性或同一性。因此，“变体CDR”或“变体VH/VL区”是具有与在本发明上下文中所定义的亲本CDR/VH/VL的指定的同源性、相似性或同一性的区并且共享生物学功能，包括但不限于，至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的亲本CDR或VH/VL的特异性和/或活性。

在一种实施方式中，与根据本发明的抗体构建体的人种系的同一性百分数是≥70％或≥75％，更优选地≥80％或≥85％，甚至更优选地≥90％，以及最优选地≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％或甚至≥96％。与人抗体种系基因产物的同一性被认为是减少治疗性蛋白质针对治疗期间患者体内的药物引发免疫应答的风险的重要特征。Hwang&Foote("Immunogenicity of engineered antibodies"；Methods 36(2005)3-10)证明了药物抗体构建体的非人部分的减少导致诱导治疗期间患者体内的抗-药物抗体的风险的降低。通过比较详尽数目的临床评估的抗体药物和各自的免疫原性数据，趋势示出了抗体的V区的人源化使得蛋白质具有比携带未改变的非人V区的抗体(平均23.59％的患者)更少的免疫原性(平均5.1％的患者)。因此，与人序列的更高程度的同一性对于以抗体构建体的形式的基于V区的蛋白质治疗是合乎期望的。出于测定种系同一性的这个目的，可以使用Vector NTI软件和通过使同一的氨基酸残基除以VL的氨基酸残基总数(以百分比)来计算的氨基酸序列，将VL的V区与人种系V段和J段的氨基酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)比对。对于VH段也可以如此(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，除了VH CDR3由于它的高多样性和缺少现有的人种系VH CDR3比对伙伴而可以被排除之外。然后可以使用重组技术以提高与人抗体种系基因的序列同一性。

术语“骨髓瘤细胞”是源于通过肿瘤性转化的骨髓中的浆细胞的恶性(癌性)浆细胞。在骨髓瘤中，恶性浆细胞产生大量的缺少抵抗感染的能力的异常的抗体。这些异常的抗体是所谓的单克隆蛋白，或M-蛋白，其起骨髓瘤的肿瘤标志物作用。骨髓瘤细胞具有表型CD19

术语“EGFR”是指表皮生长因子受体(人的EGFR；ErbB-1；HER1，包括用激活、突变和涉及病理生理学过程描述的所有异构体或变体。EGFR抗原结合位点识别在EGFR的胞外结构域中的表位。在某些实施方式中，抗原结合位点与人和猕猴属EGFR特异性结合。表皮生长因子受体(EGFR)是受体酪氨酸激酶的HER家族的成员，并由四个成员组成：EGFR(ErbB1/HER1)、HER2/neu(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。通过配体结合的受体(例如，EGF、TGFa、HB-EGF、神经调节蛋白、β细胞素(betacellulin)、双调蛋白)的刺激通过酪氨酸磷酸化激活胞内结构域的固有的受体酪氨酸激酶，并且促进受体与HER家族成员的同源或异源二聚化。这些胞内磷酸-酪氨酸充当各种衔接体蛋白质或酶(包括SHC、GRB2、PLCg和PI(3)K/Akt)的对接位点，其同时启动影响细胞增殖、血管生成、凋亡抵抗、侵袭和转移的许多信号级联反应。

MFI定义为中位荧光强度。

本发明的具体实施方式：

因此，在第一方面，本发明提供了冷冻保存状态下的分离的人NK细胞，所述分离的人NK细胞在冷冻之前用抗体构建体预负载，所述抗体构建体至少包括与免疫效应细胞的细胞表面上的NK细胞受体抗原结合的第一结合结构域以及与靶细胞的细胞表面上的细胞表面抗原结合的第二结合结构域。

而且，在其他方面，本发明提供了从冷冻保存状态重构/制备用这样的抗体构建体预负载的这样的活的人NK细胞的方法。

当前，现有产物(同种异体)远远落后于个体化(自体)方法。虽然自体细胞转移是临床验证的，需要为每个单独的患者建立细胞产物的制造。尽管不同的策略正在追求优化，但个体化产物需要7至14天的细胞分离、扩增和制备。一个限制是对于一些患者，他们的免疫细胞的自体扩增不会出产足够数目的细胞。另外，因为免疫抑制和改变的表型，癌症患者的免疫效应细胞已被描述为是功能受损的。因此，患者间的可变性负面地影响个体化制造以及临床疗效两者。

与自体方法相比，同种异体现有产物提供了独特的优势：这样的产物可以立即应用到患者，即解冻后立即，这显著减少了供应链/物流的时间，以及增加了在集中式医院之外的可用性。大批量的同种异体免疫效应细胞可以在集中式生产地点制造，这不仅降低了制造成本，而且提高了免疫效应细胞产物的同质性，实现高质量的监管标准。这样的集中式设施也可以能够使合适的健康供体的选择使用最具功能性的效应细胞群用于制造工艺。

如上文已说明的，本发明在第一实施方式中提供了在冷冻保存状态下的分离的人NK细胞，所述分离的人NK细胞在冷冻之前用抗体构建体预负载，所述抗体构建体至少包括与免疫效应细胞的细胞表面上的NK细胞受体抗原结合的第一结合结构域以及与靶细胞的细胞表面上的细胞表面抗原结合的第二结合结构域，所述靶细胞可以源自上述来源中的任何一种。

在本发明上下文中使用的NK细胞是例如分离自具有不同表型特征的健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)(例如，适应性记忆NK100细胞)，分离自脐带或胎盘组织的、诱导多能干细胞衍生的(iPSC-衍生的)NK细胞(例如FT500或FT516)或NK细胞系。合适的NK细胞系的实例包括，但不限于细胞系NK-92细胞(

在本发明上下文中，术语“iPSC”定义了诱导多能干细胞，其可以利用定义了用小分子和细胞的扩增的治疗的基因工程原理用于创建分化的和特定的细胞类型(例如，NK细胞)。

在本发明的一些实施方式中，在用所述抗体构建体预负载细胞的步骤之前扩增和/或激活NK细胞是有必要的。用于这样的扩增的方案是本领域已知的，例如来自WO2017/042393、WO2015/132415、US20110014162、US20120308986A1、US9062287B2、US8026097B2、US9260696B2；US20170119865。

根据本发明，可以将NK细胞在与抗体构建体孵育之前培养。这样的细胞培养的步骤可以是必要的以扩增和/或激活相应的细胞。典型的扩增方案可以包括选择CD34

在本发明上下文中“冷冻保存状态下的细胞”是已通过冷却至零下的温度(摄氏度)保存的细胞。冷冻保存的细胞在冷冻保护剂的存在下可以保存或可以不保存。冷冻保护剂，诸如DMSO、丙三醇、乙二醇或丙二醇，是保护细胞免受与在零下的温度和/或冷冻储存有关的损害(例如，因为冰晶形成而引起的细胞膜损害)的物质。

术语“在冷冻之前预负载”涉及在冷却至零下的温度之前将细胞与鉴定的抗体构建体预孵育。

值得注意的是，所述的抗体构建体的第一结合结构域，免疫效应细胞的细胞表面上的NK细胞受体抗原与这个受体以一定方式结合，使得即使此细胞处在冷冻保存状态期间和之后允许维持细胞表面上的结合。如在所附的实施例1所证明的，具有对CD16(a或b)特异性的第一结合结构域的抗体构建体与不同于FcRγIII的IgG结合结构域的特异性表位结合。假设与这样的特异性表位的结合即使是在以下过程期间也允许维持结合：将根据本发明的一个方面的NK细胞冷却至零下的温度以及随后的用于给药至有此需要的受试者的细胞的重构。免疫效应细胞的细胞表面上的其他NK细胞受体抗原也存在相似的表位，例如NKp46或NKG2D。

根据本发明的一种实施方式，分离的人NK细胞已从来自健康供体的脐带组织或PBMC中分离。

同样，在一种实施方式中，根据本发明的一个方面的分离的人NK细胞被保存在冷冻溶液中。在本发明上下文中的冷冻溶液至少包括基础细胞培养基和冷冻保护剂。而且，冷冻溶液可以进一步包括等张溶液(诸如Plasma-lyte)和/或血清白蛋白。

冷冻保护剂的非限制性实例已在下文中提供。在本发明上下文中的冷冻保护剂的某些实施方式是DMSO和丙三醇。冷冻保护剂的浓度可以在1％至30％(v/v)的范围内，在某些实施方式中在5％至25％(v/v)的范围内，在其他的实施方式中在10％至25％(v/v)的范围内，还在一些实施方式中浓度为20％(v/v)。在本发明上下文中，术语“基础细胞培养基”涉及适合于哺乳动物细胞的细胞培养的液体细胞培养基。这样的“基础细胞培养基”的实例是本领域众所周知的。等张溶液的浓度可以在1％至60％(v/v)的范围内，在一些实施方式中在10％至50％(v/v)的范围内，在其他的实施方式中在20％至45％(v/v)的范围内，以及在一种实施方式中浓度为40％(v/v)。血清白蛋白可以是已从供体分离或重组生产的人或(胎)牛(优选地人)血清白蛋白。冷冻溶液中的白蛋白的浓度可以在1％至40％(v/v)的范围内，在一些实施方式中在5％至25％(v/v)的范围内，还在一些实施方式中在10％至20％(v/v)的范围内。冷冻溶液(冷冻液)的实例可以包括基础培养基、40％Plasma-lyte、人血清白蛋白(HSA)和10％二甲基亚砜(DMSO)。替代地，可以使用胎牛血清(FBS)或丙三醇分别替代HSA和/或DMSO。最常用的冷冻保存保护剂是DMSO。出于一些原因，可以通过替代化合物诸如丙三醇、乙二醇或丙二醇替换DSMO。

根据某些实施方式，本发明的一方面的NK细胞已被预负载在包括浓度为至少5nM的抗体构建体的溶液中。在某些实施方式中，浓度为至少10nM，而且，在某些实施方式中，浓度为至少25nM，还在某些实施方式中，浓度为至少50nM，在某些实施方式中，浓度为至少75nM、90nM、100nM、125nM或150nM。

根据本发明的一个方面的分离的人NK细胞的表面上的与抗体构建体的第一结合结构域结合的NK细胞受体抗原选自由以下组成的组：CD16a、CD16b、NKp46、NKG2D和CD16a+CD16b。

NK细胞受体的某些实施方式已在下文中被定义。因此，所列举的抗体构建体的第一结合结构域与CD16a、CD16b或CD16a和CD16b特异性结合。而且，第一结合结构域可以与NKp46或NKG2D特异性结合。

抗体构建体的第二结合结构域所结合的靶细胞的细胞表面上的细胞表面抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD123、CLL1、BCMA、FCRH5、EGFR、EGFRvIII、HER2、GD2。

这些位于靶细胞的表面上的细胞表面抗原与特定的疾病实体相关。CD30是霍奇金淋巴瘤中恶性细胞的细胞表面抗原特征。CD19、CD20、CD22、CD70、CD74和CD79b是非霍奇金淋巴瘤(弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、T细胞淋巴瘤(外周和皮肤二者，包括转化型蕈样肉芽肿病/塞扎里综合征TMF/SS和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL))中的恶性细胞的细胞表面抗原特征。CD52、CD33、CD123、CLL1是白血病(慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML))中的恶性细胞的细胞表面抗原特征。BCMA、FCRH5是多发性骨髓瘤中的恶性细胞的细胞表面抗原特征。EGFR、HER2、GD2是实体癌(三阴性乳腺癌(TNBC)、乳腺癌BC、结直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞癌(SCLC也被称为“小细胞肺癌”或“燕麦细胞癌”)、前列腺癌(PC)、胶质母细胞瘤(也被称为多形性胶质母细胞瘤(GBM))的细胞表面抗原特征。

在根据本发明的一个方面的人NK细胞的一种实施方式中，抗体构建体包括在第一结合结构域中的选自由以下组成的组的三种重链CDR和三种轻链CDR：

(a)如SEQ ID NO:29所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:30所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:31所示的CDR-H3、如SEQ ID NO:32所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:33所示的CDR-L2、如SEQ IDNO:34所示的CDR-L3；

(b)如SEQ ID NO:40所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:41所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:42所示的CDR-H3、如SEQ ID NO:43所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:44所示的CDR-L2、如SEQ IDNO:45所示的CDR-L3；

(c)如SEQ ID NO:51所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:52所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:53所示的CDR-H3、如SEQ ID NO:54所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:55所示的CDR-L2、如SEQ IDNO:56所示的CDR-L3；

(d)如SEQ ID NO:62所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:63所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:64所示的CDR-H3、如SEQ ID NO:65所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:66所示的CDR-L2、如SEQ IDNO:67所示的CDR-L3；

(e)如SEQ ID NO:73所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:74所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:75所示的CDR-H3、如SEQ ID NO:76所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:77所示的CDR-L2、如SEQ IDNO:78所示的CDR-L3；

(f)如SEQ ID NO:84所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:85所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:86所示的CDR-H3、如SEQ ID NO:87所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:88所示的CDR-L2、如SEQ IDNO:89所示的CDR-L3；以及

(g)如SEQ ID NO:95所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:96所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:97所示的CDR-H3、如SEQ ID NO:98所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:99所示的CDR-L2、如SEQ IDNO:100所示的CDR-L3。

同样，在根据本发明的一个方面的分离的人NK细胞的一种实施方式中，抗体构建体包括在第一结合结构域中的成对VH-链和VL-链，所述成对VH-链和VL-链具有如选自由以下组成的组的成对序列所示的序列：SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:46和SEQID NO:47、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91以及SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102。

在根据本发明的一个方面的分离的人NK细胞的实施方式中，抗体构建体包括在第二结合结构域中的选自由以下组成的组的三种重链CDR和三种轻链CDR：

(a)如SEQ ID NO:106所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:107所示的CDR-H2、如SEQ IDNO:108所示的CDR-H3、如SEQ ID NO:109所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:110所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:111所示的CDR-L3；

(b)如SEQ ID NO:106所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:107所示的CDR-H2、如SEQ IDNO:108所示的CDR-H3、如SEQ ID NO:109所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:110所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:111所示的CDR-L3；以及

(c)如SEQ ID NO:117所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:118所示的CDR-H2、如SEQ IDNO:119所示的CDR-H3、如SEQ ID NO:120所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:121所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:122所示的CDR-L3。

同样，在根据本发明的一个方面的分离的人NK细胞的一种实施方式中，抗体构建体包括在第二结合结构域中的成对VH-链和VL-链，所述成对VH-链和VL-链具有如选自由以下组成的组的成对序列所示的序列：SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124以及SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135。

在根据本发明的一个方面的分离的人NK细胞的一种实施方式中，抗体构建体包括如SEQ ID NO:161-171所示的蛋白质序列。

在替代的实施方式中，本发明提供了用于在冷冻保存状态下制备冷冻保存的预负载的人NK细胞的方法，该方法包括

(i)用抗体构建体孵育NK细胞，所述抗体构建体至少包括与免疫效应细胞的细胞表面上的NK细胞受体抗原结合的第一结合结构域以及与靶细胞的细胞表面上的细胞表面抗原结合的第二结合结构域；以及

(ii)冷冻所述NK细胞。

而且，本发明提供了这样的方法，其中所述NK细胞是从来自健康的供体的脐带组织、iPSC或PBMC分离的。

如上文所述，在根据本发明的一个方面的方法中列举的NK细胞已被预负载在包括浓度为至少5nM的抗体构建体的溶液中。在某些实施方式中，浓度是至少10nM，在一些实施方式中，浓度是至少25nM、至少50nM或至少75nM。在某些实施方式中，浓度是至少90nM、100nM、125nM或150nM。

在根据本发明的一个方面的方法的一种实施方式中，抗体构建体的第一结合结构域所结合的所述NK细胞受体抗原选自由以下组成的组：CD16a、CD16b、NKp46、NKG2D以及CD16a+CD16b。

同样，根据某些实施方式，抗体构建体的第二结合结构域所结合的靶细胞的细胞表面上的细胞表面抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD123、CLL1、BCMA、FCRH5、EGFR、HER2以及GD2。

与用于制备冷冻保存的预负载的人NK细胞的根据本发明的一个方面的方法一致，冷冻NK细胞的步骤是使用冷冻液/冷冻溶液来进行的。与本发明一致的冷冻液/冷冻溶液的某些组合物和化合物已在上文中描述。

在这种方法的某些实施方式中，NK细胞是从来自健康的供体的脐带组织、iPSC或PBMC分离的。

也可以设想在本发明的一个方面的这种方法，NK细胞已被预负载在包括浓度为至少5nM的抗体构建体的溶液中。

而且，与本发明一致，抗体构建体的第一结合结构域所结合的所述NK细胞受体抗原选自由以下组成的组：CD16a、CD16b、NKp46、NKG2D以及CD16a+CD16b。

也设想在本发明的一方面的这种方法中，抗体构建体的第二结合结构域所结合的靶细胞的细胞表面上的细胞表面抗原选自由以下组成的组：CD19、CD22、CD30、CD33、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD123、CLL1、BCMA、FCRH5、EGFR、HER2、GD2。

根据在本发明的一个方面的这种方法的一种实施方式，冷冻所述NK细胞的步骤是使用包含至少基础细胞培养基和冷冻保护剂的冷冻液来进行的。

在本发明的方法的一个方面中，该方法中使用的抗体构建体是上文所述的抗体构建体之一。在本发明的方法的某些实施方式中，所述抗体构建体包括如SEQ ID NO:161-171所示的蛋白质序列。

在替代的实施方式中，本发明提供了从本文以上所述的或根据用于制备冷冻保存状态下的冷冻保存的预负载的人NK细胞的方法制备的冷冻保存状态下的根据本发明的一个方面的人NK细胞重构/制备活的预负载的人NK细胞以用于向有此需要的受试者给药所述细胞的方法，该方法包括通过解冻来重构/制备用于给药至患者的细胞的步骤。

可以根据众所周知的方法来完成冷冻细胞的解冻。通常解冻程序涉及将冷冻的细胞迅速转移到37℃的水浴中，并提供温和的搅拌直到激活的NK细胞被完全解冻。解冻之后，解冻的NK细胞可以通过以下制备以用于给药至患者：在室温下，添加(优选地以逐滴的方式)药学上可接受的载体，例如，以稀释冷冻液的浓度和/或洗涤先前激活的NK细胞。如本文所证明的，在这样的保存之后，本发明的细胞群保持了它们与抗体构建体结合的激活的状态。保存之后的用于给药的细胞的制备取决于保存方法。例如，在通过细胞培养和/或冷藏的保存之后，细胞可以通过以下中的一种或多种来制备以用于给药：洗涤细胞，将细胞重新悬浮于药学上可接受的载体中，和/或将细胞包含在合适的递送装置(例如，注射器)中。在一种实施方式中，冷冻保存之后，细胞可以通过解冻(例如，通过在37℃的水浴中的温和搅拌)以及然后将细胞包含在合适的递送装置(例如，注射器)中来制备以用于给药。令人惊讶的是，这些解冻的细胞群在基于需要时在临床中几乎立即被应用，例如，在没有重新激活或其他广泛和/或耗时的操作的情况下。

因此，尽管没有必要，冷冻保存之后，所制备用于给药的细胞可以通过以下进一步制备：在室温下添加(优选地以逐滴的方式)药学上可接受的载体以例如，稀释冷冻液的浓度和/或从冷冻液将细胞洗涤出来。在一种实施方式中，药学上可接受的载体基本上不含活化剂。

在进一步替代的实施方式中，本发明提供了包括已从根据本发明的或根据本发明的方法制备的冷冻保存状态下的人NK细胞重构的人NK细胞的药物组合物。

某些实施方式提供了包括在本发明上下文中所定义的预负载的NK细胞以及进一步的一种或多种赋形剂(诸如在本部分和本文别处示例性描述的那些)的药物组合物。在这方面，赋形剂在本发明中可以用于各种各样的目的，诸如调节制剂的物理、化学或生物学特性，诸如调节粘度，和或本发明的一个方面的过程以提高效能和或稳定这样的制剂和过程以防止由于例如在制造、运输、储存、使用前制备、给药及其后期间发生的压力引起的降解和损坏。

在某些实施方式中，药物组合物可以包含制剂材料以用于修饰、维持或保存的目的，例如，组合物的pH、渗量、粘度、澄清度、颜色、等渗压、气味、无菌度、稳定性、溶解或释放的速率、吸收或穿透(参见，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18"Edition,(A.R.Genrmo,ed.),1990,Mack Publishing Company)。在这样的实施方式中，合适的制剂材料可以包括但不限于：

·氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、2-苯丙氨酸，包括带电荷的氨基酸，优选地赖氨酸、赖氨酸乙酸盐、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸

·抗微生物剂，诸如抗细菌剂或抗真菌剂

·抗氧化剂，诸如抗坏血酸、甲硫氨酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠；

·缓冲液、缓冲液体系和缓冲剂，其用于保持组合物处于生理的pH或处于稍低的pH下；缓冲液的实例是硼酸盐、碳酸氢盐，

·Tris-HCI、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸，琥珀酸盐、磷酸盐和组氨酸；例如约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液；

·非水性溶剂，诸如丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)以及可注射的有机酯，诸如油酸乙酯；

·水性载体，包括水、酒精/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质；

·可生物降解的聚合物，诸如聚酯；

·膨胀剂，诸如甘露醇或甘氨酸；

·螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；

·等渗和吸收延迟剂；

·配合剂，诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)

·填充剂；

·单糖；二糖以及其他糖类(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化物可以是非还原糖，优选海藻糖、蔗糖、八硫酸盐(octasulfate)、山梨糖醇或木糖醇；

·(低分子量)蛋白质，多肽或蛋白质的载体，诸如人或牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白，优选地是人来源的；

·着色和调味剂；

·含硫还原剂，诸如谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、[α]-单硫甘油以及硫代硫酸钠

·稀释剂；

·乳化剂；

·亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮)

·盐-形成反荷离子，诸如钠；

·防腐剂，诸如抗微生物剂、抗-氧化剂、螯合剂、惰性气体等；实例是：苯扎氯铵，苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；

·金属配合物，诸如Zn-蛋白质配合物；

·溶剂和共溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；

·糖和糖醇，诸如海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、甘露醇、山梨糖醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌肉肌糖(myoinisitose)、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油、环多醇类(例如，肌醇)、聚乙二醇；以及多元糖醇；

·悬浮剂；

·表面活性剂或湿润剂，诸如普郎尼克类、PEG、山梨聚糖酯、聚山梨酯类(诸如聚山梨酯20)、聚山梨酯、氚核、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛(tyloxapal)；表面活性剂可以是洗涤剂，优选地分子量为>1.2KD和/或聚醚，优选地分子量为>3KD；优选的洗涤剂的非限制性实例是Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80和Tween 85；优选的聚醚的非限制性实例是PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000以及PEG 5000；

·稳定性增强剂，诸如蔗糖或山梨糖醇；

·张力增强剂，诸如碱金属卤化物，优选地氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇；

·肠胃外的递送运载体(vehicle)，包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油；

·静脉内递送运载体，包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)。

对本领域技术人员显而易见的是，药物组合物的不同的组成部分(例如，上文列出的那些)可以具有不同的效果，例如，以及氨基酸可以充当缓冲液、稳定剂和/或抗氧化剂；甘露醇可以充当膨胀剂和/或张力增强剂；氯化钠可以充当递送运载体和/或张力增强剂；等。

在某些实施方式中，最佳的药物组合物将通过本领域的技术人员确定，取决于例如，预定的给药途径、递送型式和期望剂量。参见，例如，REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES，见上。例如，合适的运载体或载体可以是可能补充有肠胃外给药的组合物中其他常见的材料的注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液。中性缓冲盐水或用血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性运载体。

在根据本发明的一个方面的药物组合物的一种实施方式中，将该组合物静脉内给药至患者。

用于本文所述的药物组合物的静脉内(iv)给药的方法和方案是本领域众所周知的。

在本发明的药物组合物的一个方面，使用所述药物组合物用于预防、治疗或改善选自增殖性疾病、肿瘤疾病或免疫紊乱的疾病。优选地，所述肿瘤疾病是恶性疾病，优选地癌症。

在本发明的药物组合物的一种实施方式中，鉴定的恶性疾病选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤以及实体瘤。

同样，在一种实施方式中，本发明提供了用于治疗或改善疾病的方法，所述方法包括以下步骤：将已根据本发明从冷冻保存状态下的人NK细胞中重构的或已通过根据本发明的方面的用于从冷冻保存状态重构/制备活的预负载的人NK细胞的方法制备的预负载的人NK细胞给药至有此需要的受试者。

与用于治疗或改善本发明的疾病的方法的一个方面一致，将预负载的人NK细胞静脉内给药至患者。

在用于治疗或改善疾病的所述方法的一种实施方式中，受试者患有增殖性疾病、肿瘤疾病或免疫紊乱。

优选的是，所述肿瘤疾病是恶性疾病，优选地癌症。

在用于治疗或改善疾病的所述方法的一种实施方式中，所述恶性疾病是选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤以及实体瘤。

***

必须注意的是，除非另有明确说明，否则如本文所用，单数形式的“一个或一种(a)”、“一个或一种(an)”以及“该或所述(the)”包括复数的引用。因此，例如，对“试剂”的引用包括这样的不同试剂中的一种或多种，以及对“方法”的引用包括对等价的步骤以及本领域技术人员已知的可以被修改或替换本文所述的方法的方法的引用。

除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”被理解为是指系列中的每一个元素。本领域的技术人员将意识到或能够使用不超出常规的实验来判明本发明所述的特定的实施方式的许多等价物。这样的等价物旨在被本发明所包括。

无论何处，本发明使用的术语“和/或”包括“和”、“或”以及“由所述术语连接的元素的全部或任何其他组合”的含义。

如本文所用，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的20％以内，优选地10％以内，以及更优选地5％以内。然而，这也包括该具体数字，例如，约20包括20。

术语“少于”或“大于”包括该具体数字。例如，少于20意指少于或等于。类似地，多于或大于分别意指多于或等于，或大于或等于。

贯穿这个说明书和所附的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”及其变型诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为意指包括已说明的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他的整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包括(comprising)”可以用术语“包含(containing)”或“包括(including)”替换，或有时当在本文中使用时，用术语“具有”替换。

当在本文中使用时，“由……组成(consisting of)”排除在权利要求元素中未指定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“本质上由……组成(consistingessentially of)”不排除对权利要求的基本和新颖特征没有实质性影响的材料或步骤。

在本文每一种情况下，术语“包括”、“本质上由……组成”和“由……组成”中的任一个可以用其他两个术语中的任何一个替换。

应该理解，本发明不限于本文所述的特定的方法、方案、材料、试剂和物质等，并且这样的可以变化。本文使用的术语是仅出于描述特定的实施方式的目的，并且不旨在限制本发明的范围，其仅由权利要求书限定。

贯穿本说明书的文档引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、说明书等)，无论参见上文或下文，将它们全文通过援引并入本文。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这样的公开。对于通过援引并入的材料与本说明书相矛盾或不一致，本说明书将取代任何这样的材料。

可以根据本发明使用的抗体构建体的实例在MAbs.2019Jul；11(5):899-918中描述。

参考以下实施例，将更好地理解本发明和其优点，实施例只作说明目的提供。实施例不旨在以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：在预负载和冷冻/解冻之后由NK细胞的抗体介导的细胞毒性的评估

细胞系的培养

将MM.1S(ATCC,目录:CRL2974)和DK-MG细胞(DSMZ,目录:ACC277)在补充有10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL的青霉素G钠以及100μg/mL的链霉素硫酸盐的RPMI1640培养基中培养。将所有的细胞系在标准条件下培养，并且如供应商所推荐的，在37℃下，在具有5％CO

从血沉棕黄层中分离PBMC以及人NK细胞的富集

通过密度梯度离心从血沉棕黄层(德国红十字会，曼海姆(Mannheim)，德国)中分离PBMC。用二至三倍体积的PBS(Invitrogen,目录:14190-169)稀释血沉棕黄层样品，在淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)(Stem Cell Technologies,目录:07861)的缓冲垫上分层，并在室温下在800x g下离心25min，w/o制动。收集位于界面处的PBMC并用PBS洗涤3次，然后将它们在完全RPMI 1640培养基(补充有10％热灭活FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL的青霉素G钠以及100μg/mL链霉素硫酸盐的RPMI 1640培养基(所有组分来自Invitrogen))中在没有刺激的情况下培养过夜。对于NK细胞的富集，PBMC收获自过夜的培养物并用于一轮阴性选择，所述一轮阴性选择根据制造商的说明使用用于未接触的人NK细胞的免疫磁性分离的EasySep

NK细胞的预负载和冷冻/解冻

将富集的原代人NK细胞的等分试样重新悬浮于包含总体积为0.5mL的10μg/mL的指示的抗体构建体的完全RPMI 1640培养基中，并在室温下孵育30min。如所指示的，等分试样的一半用5mL完全RPMI 1640培养基洗涤两次以及然后重新悬浮于0.5mL完全RPMI 1640培养基中，以及在添加补充有20％DMSO(Sigma)的FCS之前，等分试样的另一半未被洗涤。然后将细胞悬浮液转移到2mL冷冻管(Greiner bio-one)中并且在冷冻1℃冷冻容器(Nalgene)中以-80℃冷冻多于12h。

4h钙黄绿素释放细胞毒性测定

对于钙黄绿素释放细胞毒性测定，指示的靶细胞收获自培养物，用无FCS的RPMI1640培养基洗涤，并且用10μM钙黄绿素AM(Invitrogen/Molecular Probes,目录:C3100MP)在37℃下在无FCS的RPMI培养基中标记30min。在温和洗涤之后，标记的细胞被重新悬浮于完全RPMI 1640培养基中至1x10

在以200g离心2min之后，将测定在37℃下，在具有5％CO

结果在图1中示出。

实施例2：抗-CD16抗体与不同抗原变体的结合的分析

FcgRIII(CD16)，IgG的Fc部分的低亲和力受体，以由两种几乎同一的基因编码的两种异构体存在：FCGR3A(CD16A)和FCGR3B(CD16B)，导致替代的膜锚定的异构体的组织特异性表达(Ravetch和Perussia,1989,J Exp Med.)：

-FcgRIIIA(CD16A)作为跨膜蛋白在NK细胞、巨噬细胞、单核细胞以及T细胞的亚组上表达。

-FcgRIIIB(CD16B)是中性粒细胞表达的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的，并且在嗜酸性粒细胞刺激γ-干扰素之后。

CD16A和CD16B二者的等位变体/多态性是众所周知的(总结在表2中)。

CD16B同种异型变体不同于胞外结构域(ECD)的五种氨基酸(表2)。这些中的两个能够额外糖基化，导致GPI-锚定的FcγRIIIB粒细胞抗原的三种不同的变体：HNA-1a、-1b、以及-1c(之前命名为NA1、NA2以及SH)。

在CD16A和B的氨基酸序列中仅有很少的差异。它们的差异仅限于在成熟的ECD中的两种替代的氨基酸(表2)。额外的差异在于CD16A和CD16B的膜锚定的方式不同。以成熟的GPI-锚定形式切除下来的CD16B的C末端前肽序列，与连接CD16A ECD至它的跨膜结构域的序列是高度同源的(表2)。

表2：FcgRIIIA(CD16A)和FcgRIIIB(CD16B)等位基因的序列变异的概括。我们使用在左列显示的氨基酸编号。在右边示出了来自Uniprot的对应的编号以用于比较。其中CD16A与CD16B不同的位置用粗体和下划线突出表示。以CD16B的成熟形式删除的前肽序列以划掉的字母示出。

先前已描述了缺乏CD16B结合的CD16A特异性抗体“LSIV21”的分离(Reusch等人,2014,MAbs)。

为了研究CD16A/CD16B序列变异中的那些决定了我们的CD16A选择性抗体的结合位点，我们生成并表征了可溶性重组CD16A-和CD16B-抗原变体的组。

CD16B(NA1)ECD重组蛋白质以成熟形式(无前肽)(CD16B

包括已公布的CD16A-和CD16B-反应性抗体3G8的可变重和轻链序列的scFv抗体识别所有的测试的CD16A和CD16B抗原变体(图2，表3)。包含“LSIV21”或亲和力改进的“P2C47”的可变重和轻链序列的不同的抗体(以单价scFv或二价结合四价双特异性级联双体抗体的形式)识别CD16A但不识别CD16B的成熟的或包含前肽的ECD融合抗原。然而，如果CD16BECD中的处于140位的组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)(该氨基酸处于CD16A中的相应的位置)，则CD16B的这种突变形式(CD16B

表3：在ELISA中分析的不同的抗-CD16抗体与包被的CD16抗原变体的结合的概括。在Graphpad Prism中使用四参数逻辑(4PL)曲线模型log(激动剂)对应答—可变斜率—计算结合EC

在ELISA中类似地分析了额外的亲和力成熟的抗-CD16 scFv抗体。结果示出，除了scFv“CD16-5”示出了与CD16B的弱的交叉反应性之外，其他亲和力成熟的抗-CD16 scFv抗体保持了亲本抗体的CD16A选择性结合特性。它们不与CD16B结合，除非CD16B包含前文所述的氨基酸交换CD16B

CD16 ECD中的处于140位的酪氨酸(Y)对于我们的抗体的CD16A特异性识别的重要性也使用在细胞表面上具有不同的CD16抗原变体的转基因表达的重组CHO细胞被证实。ECD序列被融合至人EGFR的跨膜结构域(Wang等人,2011,Blood 118(5)1255)或使用人CD16B内源性序列及全长前肽序列通过GPI锚定，以进行GPI-锚定的翻译后处理和脂化。

包括已公布的CD16A-和CD16B-反应性抗体3G8的可变重和轻链序列的scFv抗体识别所有细胞表面表达的CD16A和CD16B抗原变体(图3)，但不识别表达为特异性对照的重组EGFR。包含“LSIV21”和亲和力改进的“P2C47”的可变重和轻链序列的scFv抗体识别CHO细胞表面表达的CD16A变体，但不识别CD16B(NA1)的成熟的或包含前肽的ECD。然而，如果CHO膜-锚定的CD16B ECD中的处于140位的组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)(该氨基酸处于CD16A中的相应的位置)，则CD16B的这种突变形式(CD16BH140Y)被包含“LSIV21”或“P2C47”可变结构域的scFv抗体很好地识别(图3)。

在SDS-PAGE和蛋白质印迹法之后，当样品在非还原条件下处理时，也是CD16A和CD16BH140Y抗原变体，而不是CD16B抗原，被包含“LSIV21”、“P2C47”或亲和力成熟的可变结构域的抗体识别(图5)，但抗体3G8识别所有CD16A和CD16B抗原变体。当样品在SDS-PAGE凝胶上上样之前被还原时，在蛋白质印迹法上没有获得信号(数据不示出)，表明非线性的序列，而不是三维结构作为结合表位。在被这些抗体的“LSIV21”、“P2C47”或亲和力成熟的变体识别的情况下，三维表位结构可能是由CD16的140位中的酪氨酸确定的。

表3：在ELISA中分析的不同的抗-CD16抗体与包被的CD16抗原变体的结合的概括。在Graphpad Prism中使用四参数逻辑(4PL)曲线模型log(激动剂)对应答—可变斜率—计算结合EC

FcgRIII的IgG结合位点是受体的膜近端的胞外结构域上的不连续结合区域。FcgRIIIA(CD16A)与IgG的Fc部分的低亲和力相互作用的关键氨基酸被先前鉴定和描述(例如Ahmed等人,2016)。参与了与Fc部分的CH2结构域的相互作用的CD16A中的残基是K120、Y132、H134、H135和K161。然而，据报道抗体3G8结合CD16A和CD16B并且阻断IgG结合(Tamm和Schmidt,1996)，我们没有观察到我们的抗-CD16抗体通过IgG与CD16A的结合的阻断。为了支持我们的抗-CD16A特异性抗体的结合位点不同于FcgRIIIA上的IgG结合位点的假设，我们进行了竞争ELISA。随着包含3G8的可变结构域的scFv抗体的浓度的增加，3G8 mAb与CD16A的结合被阻断，而其他抗-CD16 scFv抗体不会阻断或替代CD16A上的3G8 mAb，并且独立地结合(图6)。因为已知3G8结合位点阻断IgG结合，我们推断我们的抗-CD16抗体的结合位点与IgG结合位点不同。

ELISA中结合的分析

将96孔ELISA板(Immuno MaxiSorp；Nunc)用在浓度为1.5或3μg/mL的100mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的融合至人IgG1 Fc或单体mFc.67的CD16胞外结构域(ECD)抗原变体的重组产生的融合蛋白质(Ying等人,2012,J.Biol.Chem.)在4℃下包被过夜。在用溶解于PBS中的3％(w/v)脱脂奶粉(Merck)的封闭步骤之后，将在包含0.3％(w/v)脱脂奶粉的PBS中系列稀释的不同抗体在室温下在板上孵育1.5h。在用包含0.1％(v/v)Tween 20的PBS(每孔300μL)洗涤三次之后，将板与检测抗体在室温下一起孵育1h。对于His-标记的分析物的检测，以1:3000稀释使用Penta-HIS-HRP(Qiagen)。对于四价双特异性BCMA/CD16 TandAb抗体(T763)的检测，在室温下以1:20.000稀释使用蛋白质L-HRP缀合物(Pierce)持续1小时。在用包含0.1％(v/v)Tween 20的PBS(每孔300μL)洗涤三次之后，将板与四甲基联苯胺(TMB)底物(Seramun)一起孵育直到显色是清晰可见的为止。通过添加每孔100μL的0.5MH2SO4，使反应停止。在450nm处使用多标签板读取器(Victor,Perkin Elmer)测量吸光度。使用以下绘制并分析吸光度值：用GraphPad Prism version 6.07(GraphPad软件，拉由拉市加利福尼亚美国(La Jolla California USA))的非线性回归、S形剂量应答(可变斜率)、最小平方(常规)拟合。

在SDS-PAGE和蛋白质印迹法之后的结合的分析

将纯化的重组CD16抗原变体(人CD16A

CD16A竞争ELISA

将96孔ELISA板(Immuno MaxiSorp；Nunc)用在浓度为1.5μg/mL的100mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的融合至单体mFc.67的CD16A(48R,158V)ECD的重组产生的融合蛋白质(Ying等人,2012,J.Biol.Chem.)在4℃下包被过夜。在用溶解于PBS中的3％(w/v)脱脂奶粉(Merck)的封闭步骤之后，将在包含0.3％(w/v)脱脂奶粉的PBS中系列稀释的不同scFv-抗体与1nM的抗-CD16 mAb 3G8(BD Bioscience)混合并在室温下在板上共孵育1.5h。在用包含0.1％(v/v)Tween 20的PBS(每孔300μL)洗涤三次之后，将板与检测抗体在室温下一起孵育1h。对于CD16A-结合的3G8的检测，以1:10.000稀释使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)-HRPO(Dianova 115-035-003)。在用包含0.1％(v/v)Tween 20的PBS(每孔300μL)洗涤三次之后，将板与四甲基联苯胺(TMB)底物(Seramun)一起孵育直到显色是清晰可见的为止。通过添加每孔100μL的0.5M H2SO4，使反应停止。在450nm处使用多标签板读取器(Victor,PerkinElmer)测量吸光度。使用以下绘制并分析吸光度值：用GraphPad Prism version 6.07(GraphPad软件，拉由拉市加利福尼亚美国(La Jolla California USA))的非线性回归、S形剂量应答(可变斜率)、最小平方(常规)拟合。

实施例3：在37℃下在存在或不存在10mg/mL多克隆人IgG的情况下，抗-CD16AscFv对原代人NK细胞的结合

方法：

从血沉棕黄层中分离PBMC以及人NK细胞的富集

通过密度梯度离心从血沉棕黄层(德国红十字会，曼海姆(Mannheim)，德国)中分离PBMC。用二至三倍体积的PBS(Invitrogen,目录:14190-169)稀释血沉棕黄层样品，在淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)(Stem Cell Technologies,目录:07861)的缓冲垫上分层，并在室温下在800x g下离心25min，w/o制动。收集位于界面处的PBMC并用PBS洗涤3次，然后将它们在完全RPMI 1640培养基(补充有10％热灭活FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL的青霉素G钠以及100μg/mL链霉素硫酸盐的RPMI 1640培养基(所有组分来自Invitrogen)中在没有刺激的情况下培养过夜。对于NK细胞的富集，PBMC收获自过夜的培养物并用于一轮阴性选择，所述一轮阴性选择根据制造商的说明使用用于未接触的人NK细胞的免疫磁性分离的EasySep

细胞结合测定和流式细胞术分析

在存在10mg/mL多克隆人IgG(Gammanorm,Octapharma)或相应缓冲液的情况下，将0.2-1x 106个富集的人NK细胞的等分试样与100μL的在包含2％热灭活的FCS(Invitrogen,目录:10270-106)、0.1％叠氮化钠(Roth,Karlsruhe,Germany,目录:A1430.0100)的FACS缓冲液(PBS,Invitrogen,目录:14190-169)中系列稀释的指示的scFv构建体在37℃下一起孵育45min。在用FACS缓冲液反复洗涤之后，用10μg/mL抗-His mAb 13/45/31-2(Dianova，汉堡(Hamburg)，德国，目录:DIA910-1MG)，紧接着15μg/mL FITC-缀合的山羊抗-小鼠IgG(Dianova,目录:115-095-062)检测细胞-结合的抗体。在最后的染色步骤之后，将细胞再次洗涤并重新悬浮于包含2μg/mL碘化丙啶(PI)(Sigma,目录:P4170)的0.2mL的FACS缓冲液中以排除死细胞。使用Millipore Guava EasyCyte流式细胞仪(Merck Millipore，施瓦尔巴赫(Schwalbach)，德国)或CytoFlex细胞仪(Beckman Coulter,克雷菲尔德(Krefeld)，德国)测量2-5x 103活细胞的荧光，并测定细胞样品的中位荧光强度。在减去单独用第二试剂和第三试剂染色的细胞的荧光强度值之后，将所得值用于使用GraphPad Prism软件(GraphPad Prism version 7.04用于Windows，GraphPad软件，拉由拉市加利福尼亚美国)的非线性回归分析。对于KD的计算，使用单位点结合(双曲线)的方程。

结果

在37℃下，在存在或不存在10mg/mL多克隆人IgG的情况下，在原代人NK细胞上滴定包含来自克隆CD16-1的人Fv结构域的抗-CD16scFv、包含来自克隆CD16-2的人抗-CD16Fv结构域的scFv以及包含来自mAb3G8的鼠Fv结构域的scFv_3G8。相应的结果在图7中示出。

实施例4：在用抗-EpCAM和抗-CD30抗体预负载以及冷冻/解冻之后由NK细胞的抗体介导的细胞毒性的评估

方法：

表4：抗体构建体

细胞系的培养

将COLO 205(由Dr.G.Moldenhauer，德国癌症研究中心，海德堡，德国友善提供)以及KARPAS-299细胞(DSMZ,目录:ACC31)在补充有10％热灭活的FCS、2mM的L-谷氨酰胺和100IU/mL的青霉素G钠以及100μg/mL的链霉素硫酸盐的RPMI 1640培养基中培养。将所有的细胞系在标准条件下培养，并且如供应商所推荐的，在37℃下，在具有5％CO

从血沉棕黄层中分离PBMC以及人NK细胞的富集

通过密度梯度离心从血沉棕黄层(德国红十字会，曼海姆(Mannheim)，德国)中分离PBMC。用二至三倍体积的PBS(Invitrogen,目录:14190-169)稀释血沉棕黄层样品，在淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)(Stem Cell Technologies,目录:07861)的缓冲垫上分层，并在室温下在800x g下离心25min，w/o制动。收集位于界面处的PBMC并用PBS洗涤3次，然后将它们在完全RPMI 1640培养基(补充有10％热灭活FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL的青霉素G钠以及100μg/mL链霉素硫酸盐的RPMI 1640培养基(所有组分来自Invitrogen))中在没有刺激的情况下培养过夜。对于NK细胞的富集，PBMC收获自过夜的培养物并用于一轮阴性选择，所述一轮阴性选择根据制造商的说明使用用于未接触的人NK细胞的免疫磁性分离的EasySep

NK细胞的预负载和冷冻/解冻

将富集的原代人NK细胞的等分试样重新悬浮于包含总体积为0.5mL的10μg/mL的指示的抗体构建体的完全RPMI 1640培养基中，并在室温下孵育30min。在添加补充有20％DMSO(Sigma)的0.5mL FCS之后，将细胞悬浮液转移到2mL冷冻管(Greiner bio-one)中并且在冷冻1℃冷冻容器(Nalgene)中以-80℃冷冻多于12h。

4h钙黄绿素释放细胞毒性测定

对于钙黄绿素释放细胞毒性测定，指示的靶细胞收获自培养物，用无FCS的RPMI1640培养基洗涤，并且用10μM钙黄绿素AM(Invitrogen/Molecular Probes,目录:C3100MP)在37℃下在无FCS的RPMI培养基中标记30min。在温和洗涤之后，标记的细胞被重新悬浮于完全RPMI 1640培养基中至1x10

在以200g离心2min之后，将测定在37℃下，在具有5％CO

结果：

用抗-EpCAM抗体构建体(诸如EpCAM/NKp46 scFv-IgAb_73、EpCAM/NKG2D scFv-IgAb_75、EpCAM/CD16A scFv-IgAb_80以及IgG抗-EpCAM)预负载的原代人NK细胞诱导EpCAM-阳性COLO 205细胞而不是EpCAM-阴性KARPAS-299细胞的特异性裂解。在双特异性的抗-EpCAM构建体中，用EpCAM/CD16A scFv-IgAb_80预负载的NK细胞在COLO 205细胞裂解中展现出最高的功效，以及用EpCAM/NKG2D scFv-IgAb_75负载的NK细胞展现出最低的功效。用抗-CD30抗体构建体预负载的NK细胞的制剂中没有一个介导COLO 205的基本裂解(图8A和表5)。

相比之下，用CD30/CD16A TandAb或Fc-增强的IgG抗-CD30预负载的NK细胞介导了CD30-阳性KARPAS-299细胞而不是CD30-阴性COLO 205细胞的裂解。用野生型IgG抗-CD30预负载的NK细胞不介导KARPAS-299的裂解，表明这种野生型IgG抗-CD30在冷冻、解冻和洗涤过程中过快地从NK细胞中离解，并且其余的IgG的数目太低而不能介导基本的靶细胞裂解(图8B和表5)。

有趣的是，用10μg/mL EpCAM/NKG2D scFv-IgAb_75或CD30/CD16A TandAb预负载的，冷冻的、解冻的和洗涤的NK细胞，分别诱导了COLO 205或KARPAS-299细胞的类似的裂解，未被预负载的但是在细胞毒性测定中补充有10μg/mL的新鲜的EpCAM/NKG2D scFv-IgAb_75或CD30/CD16A TandAb的NK细胞也是如此。

表5：由预负载和冷冻的NK细胞在E:T比率为5:1下的靶细胞裂解的功效。将NK细胞用10μg/mL的所指示的抗体构建体或在不含抗体(w/o抗体)的情况下在室温下预负载30min，并然后在-80℃下冷冻。将解冻的NK细胞洗涤并在COLO 205或KARPAS-299靶细胞上的4h钙黄绿素释放细胞毒性测定中作为效应细胞使用。作为对照，将EpCAM/NKG2D scFv-IgAb_75和CD30/CD16A T116以10μg/mL的浓度新鲜地添加到冷冻前未被预负载的NK细胞(w/o抗体)中。示出了在E:T比率为5:1下的重复裂解值的平均值。实验编号RBL 1464。

序列表

<110> 阿菲姆德股份有限公司（Affimed GmbH）

<120> 用抗体构建体预负载的冷冻保存的NK细胞

<130> PPI21170323US

<150> EP18191031.6

<151> 2018-08-27

<160> 178

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 1

Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 2

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 3

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser

20

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 4

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 8

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 9

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 10

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 11

<211> 328

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链恒定结构域

<400> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

100 105 110

Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

180 185 190

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

195 200 205

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

210 215 220

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

225 230 235 240

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 12

<211> 328

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 重链恒定结构域

<400> 12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

100 105 110

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

180 185 190

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

195 200 205

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

210 215 220

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

225 230 235 240

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 13

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 轻链恒定结构域

<400> 13

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 轻链恒定结构域

<400> 14

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 15

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH2-CH3 恒定结构域

<400> 15

Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 16

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH2-CH3 恒定结构域

<400> 16

Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu

165 170 175

Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

210 215

<210> 17

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ch2-ch3 恒定结构域

<400> 17

Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 18

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ch2-ch3 恒定结构域

<400> 18

Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 19

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> ch1 结构域

<400> 19

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 20

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cl 结构域

<400> 20

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ser Ser

100 105

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cl 结构域

<400> 21

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser

100 105

<210> 22

<211> 216

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> ch2-ch3 结构域

<400> 22

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 23

<211> 192

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> CD16a

<400> 23

Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro

1 5 10 15

Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln

20 25 30

Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr

50 55 60

Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu

65 70 75 80

Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln

85 90 95

Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys

100 105 110

His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn

115 120 125

Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro

130 135 140

Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe

145 150 155 160

Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln

165 170 175

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln

180 185 190

<210> 24

<211> 192

<212> PRT

<213> 猕猴属

<220>

<223> CD16a

<400> 24

Gly Met Arg Ala Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro

1 5 10 15

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20 25 30

Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Arg Trp Phe His Asn Glu

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Ser Leu Ile Ser Ser Gln Thr Ser Ser Tyr Phe Ile Ala Ala Ala Arg

50 55 60

Val Asn Asn Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu

65 70 75 80

Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln

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Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Glu Ser Ile His Leu Arg Cys

100 105 110

His Ser Trp Lys Asn Thr Leu Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn

115 120 125

Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His Gln Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro

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Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Ile

145 150 155 160

Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln

165 170 175

Asp Leu Ala Val Ser Ser Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln

180 185 190

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽标签

<400> 25

His His His His His His

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽标签

<400> 26

Glu Pro Glu Ala

1

<210> 27

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 27

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr

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Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys

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65 70 75 80

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn

20 25 30

Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

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50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile

85 90 95

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<220>

<223> cdr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 31

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<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

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<400> 33

000

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<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

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<213> 人工序列

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50 55 60

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65 70 75 80

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<213> 人工序列

<220>

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Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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50 55 60

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65 70 75 80

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<220>

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

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210

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<213> 人工序列

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<223> cdr

<400> 41

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 42

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 44

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<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 47

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Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val

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50 55 60

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65 70 75 80

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<220>

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

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<212> PRT

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<220>

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210

<210> 51

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 51

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 52

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 53

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 54

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<400> 55

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

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Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 57

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<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 58

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

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Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Gln Ser Val

20 25 30

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65 70 75 80

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<212> PRT

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<220>

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Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

245 250 255

<210> 60

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VH

<400> 60

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

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Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

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165 170 175

Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser

180 185 190

Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro

195 200 205

Thr Glu Cys Ser

210

<210> 95

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 95

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr

1 5

<210> 96

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 96

Ile Glu Pro Asp Gly Gly Arg Arg

1 5

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 97

Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 98

Gln Gly Val Ser Gly Asp

1 5

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<400> 99

000

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 100

Gln Gln Trp Asp Asn Tyr Ser Val Thr

1 5

<210> 101

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 101

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Val Ile Glu Pro Asp Gly Gly Arg Arg Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 102

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Gly His Gln Gly Val Ser Gly Asp

20 25 30

Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Asn Lys Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Asn Tyr Ser Val

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Glu Pro Asp Gly Gly Arg Arg Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln

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Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser

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Cys Arg Gly His Gln Gly Val Ser Gly Asp Val His Trp Tyr Gln Gln

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Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Asn Lys Arg

180 185 190

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210 215 220

Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Asn Tyr Ser Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

245 250 255

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<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VH

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

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Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Glu Pro Asp Gly Gly Arg Arg Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

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<210> 105

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VL

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Gly His Gln Gly Val Ser Gly Asp

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Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Asn Tyr Ser Val

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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

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Phe Asn Arg Gly Glu Cys

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 106

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Asp

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 107

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 108

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

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000

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 111

Ala Gly Pro His Lys Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 112

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Thr Arg Gly Asp Ile Thr Ser Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 113

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1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Gly

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Pro His Lys Tyr Pro Leu

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Thr Arg Gly Asp Ile Thr Ser Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

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Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Gly Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

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Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Asp

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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr

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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys

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Ala Gly Pro His Lys Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

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Glu Ile Lys Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

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<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VH

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Thr Arg Gly Asp Ile Thr Ser Tyr Arg Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

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<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VL

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Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 117

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Asp

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 118

Ile Thr Thr Gly Gly Gly Asp Thr

1 5

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 119

Val Arg His Gly Tyr Tyr Asp Gly Tyr His Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

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<210> 120

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 120

Gln Gly Ile Ser Asn Asn

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000

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 122

Gln Gln Phe Thr Ser Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 123

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 123

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val

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Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 124

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 124

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Gln Gly Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv

<400> 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

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Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

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Ala Asn Gln Gly Ile Ser Asn Asn Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Phe Thr Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Ile Lys Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

245 250

<210> 126

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VH

<400> 126

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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Val Arg His Gly Tyr Tyr Asp Gly Tyr His Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

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130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215

<210> 127

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VL

<400> 127

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Gln Gly Ile Ser Asn Asn

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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile

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Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Leu Pro Tyr

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 128

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 128

Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 129

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr

1 5

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<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 130

Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 131

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 131

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

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<400> 132

000

<210> 133

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 133

Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp His Val Leu

1 5 10

<210> 134

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 134

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 135

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 135

Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 136

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv

<400> 136

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln

130 135 140

Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys

145 150 155 160

Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro

180 185 190

Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala

195 200 205

Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr

210 215 220

Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp His Val Leu Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His

245 250 255

His

<210> 137

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VH

<400> 137

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215

<210> 138

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VL

<400> 138

Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 139

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 139

Gly Tyr Met Phe Ser Thr Phe Trp

1 5

<210> 140

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 140

Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asn Thr

1 5

<210> 141

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 141

Ala Lys Ile Arg Asp Gly Tyr Ser Tyr Asp Ala Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 142

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 142

Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr

1 5

<210> 143

<400> 143

000

<210> 144

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 144

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 145

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 145

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Ala Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Met Phe Ser Thr Phe

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ile Arg Asp Gly Tyr Ser Tyr Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 146

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 146

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Leu Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 147

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv

<400> 147

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Ala Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Met Phe Ser Thr Phe

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ile Arg Asp Gly Tyr Ser Tyr Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr

130 135 140

Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser

145 150 155 160

Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp

165 170 175

Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val

180 185 190

Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser

195 200 205

Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu

210 215 220

Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Ala Tyr

225 230 235 240

Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser

245 250 255

His His His His His His

260

<210> 148

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VH

<400> 148

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Ala Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Met Phe Ser Thr Phe

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ile Arg Asp Gly Tyr Ser Tyr Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215

<210> 149

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VL

<400> 149

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Leu Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

130 135 140

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

145 150 155 160

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

180 185 190

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

195 200 205

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 150

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 150

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 151

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 151

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 152

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 152

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr His Tyr Gly Leu Asp Val

1 5 10

<210> 153

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 153

Lys Leu Gly Asp Lys Tyr

1 5

<210> 154

<400> 154

000

<210> 155

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cdr

<400> 155

Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Gly Val

1 5

<210> 156

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 156

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr His Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 157

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可变结构域

<400> 157

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Ala Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Gly Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 158

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv

<400> 158

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr His Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln

130 135 140

Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys

145 150 155 160

Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Arg Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Leu Ile Tyr Gln Asp Ala Lys Arg Pro

180 185 190

Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala

195 200 205

Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr

210 215 220

Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

245 250 255

<210> 159

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VH

<400> 159

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr His Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215

<210> 160

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fab VL

<400> 160

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Ala Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Gly Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn

115 120 125

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val

130 135 140

Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu

145 150 155 160

Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser

180 185 190

Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro

195 200 205

Thr Glu Cys Ser

210

<210> 161

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 级联双体抗体构建体

<400> 161

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly

130 135 140

Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn

145 150 155 160

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile

165 170 175

Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala

195 200 205

Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val

210 215 220

Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

245 250 255

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

260 265 270

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

275 280 285

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

290 295 300

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

305 310 315 320

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

325 330 335

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

340 345 350

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

355 360 365

Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro

370 375 380

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Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser

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Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu

435 440 445

Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser

450 455 460

Asp His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala

465 470 475 480

Ala Gly Ser His His His His His His

485

<210> 162

<211> 705

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv-IgAb 多肽链

<400> 162

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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

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370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln

450 455 460

Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr

465 470 475 480

Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser

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515 520 525

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Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

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595 600 605

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Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp

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Leu

705

<210> 163

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<212> PRT

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<220>

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<210> 164

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<212> PRT

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<220>

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<400> 164

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85 90 95

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100 105 110

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130 135 140

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180 185 190

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Lys

<210> 165

<211> 727

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<213> 人工序列

<220>

<223> scFv-IgAb 多肽链

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<210> 166

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv-IgAb 多肽链

<400> 166

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<210> 167

<211> 729

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KiH-scDb-Fc 多肽链

<400> 167

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165 170 175

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225 230 235 240

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245 250 255

Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln

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Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu

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Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val

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Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp

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Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Glu

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Pro Met Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val

405 410 415

Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser

420 425 430

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser

435 440 445

Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

450 455 460

Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val

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Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn

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530 535 540

Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile

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Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp

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Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

580 585 590

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

595 600 605

Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

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Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

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Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Glu Pro Met Tyr Gly Ser Thr

645 650 655

Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr

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Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

675 680 685

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe

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Ala Gly Ser His His His His His His

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<210> 168

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KiH-scDb-Fc 多肽链

<400> 168

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

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Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Thr Arg Gly Asp Ile Thr Ser Tyr Arg Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gln Asp Tyr Tyr Thr Asp Tyr Met Gly Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

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165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Asp

180 185 190

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys

210 215 220

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Glu Ile Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

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275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

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450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly

465

<210> 169

<211> 721

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Db-Fc 多肽链

<400> 169

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

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50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu

85 90 95

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<213> 人工序列

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<223> scFv-Ig 多肽链

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