用于培育三维细胞结构的流体装置、流体系统和方法

技术领域

本发明涉及用于在为细胞起始材料施加至少一个浓度梯度的情况下将细胞起始材料培育成一或数个三维细胞结构的一种流体装置、一种流体系统以及一种方法。

背景技术

目前，患者活体组织的匮乏是医学研究中的一道障碍。对于中枢神经系统的组织、例如脑组织而言尤为如此。出于这个原因，将不同类型的干细胞或者祖细胞(例如诱导性多能干细胞(iPS细胞)，即从组织提取并重编程成干细胞的细胞，胚胎干细胞(ES细胞)，器官特异性干细胞)用于培育充当疾病模型的细胞培养物。然而，目前主要将这类细胞培养物作为2D培养物加以培育。有潜力提供更具说服力的结果的3D培养物(例如类器官)目前无法制造，或者品质不够高，或者尺寸过小。对于基于其他细胞或组织类型的三维结构，例如可触及的病变的患者组织(如肿瘤组织)而言，也存在同样的问题。首要地，借助目前可供使用的方法和装置，无法实现细胞类型(沿组织轴线、器官轴线和身体轴线)的空间正确的布局、足够的分化度、以及细胞结构的处于微米乃至厘米范围内的足够的尺寸。

文献US 2018/0030409 A1、WO 2017/083705 A1和WO 2014/090993 A1例如揭示过培育三维类器官的方法，其中借助旋转式生物反应器来为细胞培养物供应培养基。在此，类器官或类器官所包含的细胞相对培养基的成分的位置不是固定的。使用这类旋转式生物反应器的缺点在于，各组织区域或器官区域以随机布置且不受控的方式发育，这使得培育出的类器官的品质不足以用于研究目的。

此外，文献WO 2017/123791 A1描述过三维类器官的静态活体外培育，其中细胞同样以随机定位且不受控的方式形成。

此外，文献US 2015/0298123 A1揭示过一种平台，其具有用于培养类器官的微流体系统。然而，由于微流体系统的尺寸较小，培养持续时间以及类器官的定量培育受到限制，亦即，从特定的尺寸起，不再有足够的空间可供用于进一步培育类器官。

有鉴于此，本发明的目的是克服现有技术中的缺陷。本发明的目的特别是在于，提供一种装置、一种系统以及一种方法，借此能够将细胞起始材料(一或数个细胞、细胞群或者组织)以可重现的方式培育成三维细胞结构(器官、类器官、组织、或者细胞群)以及/或者加以维持，使得这个组织具备足够的空间有序性、足够的分化程度以及足够大的尺寸。在本发明中这特别是意味着：三维细胞结构的分化程度、尺寸和/或有序性达到与天然器官接近的程度，故在应用于疾病模型中时能够实现特别有说服力的结果。实现与天然器官相同的分化程度、尺寸和/或有序性显然是极其困难的。但这通常也不是必要的。从一定的分化程度、尺寸和/或有序性起，便已能实现非常有说服力的结果，特别是与在现有技术中可实现的结果相比更优的结果。现有技术中的类器官的分化程度、尺寸和/或有序性不足。例如就脑组织而言，各区域仅随机地、未充分分化地、不准确地和/或分布有误地在前脑、中脑以及后脑中发育。

本发明用以达成上述目的的解决方案为根据独立权利要求所述的一种流体装置、一种流体系统和一种方法。所述流体装置、流体系统以及方法的进一步方案和实施方式参阅从属权利要求和下文的描述。

发明内容

本发明的用于将细胞起始材料(一或数个细胞、细胞群、组织)培育成一或数个三维细胞结构，以及用于三维细胞结构的进一步培育、成熟改善、尺寸增长促进和/或维持的流体装置包括基体，其具有沿x向、与x向正交的y向、以及与x向和y向正交的z向延伸的腔室，在所述腔室中容置有或者可容置基质(例如包括水凝胶)，例如采用基质将腔室大体完全填满的方式。所述基质主要用作支架，用于确保所述结构在腔室内的经定义的位置和定向。同时，该基质能够影响结构的生长、成熟和维持。维持特别是指通过持续地输入介质防止细胞死亡。在三个方向(x向、y向、z向)中的每一个上，所述腔室和(可)容置于其中的基质的延伸度优选可为数百微米，进一步优选为至少一毫米，进一步优选为数毫米，进一步优选为至少3mm，进一步优选为至少4mm，进一步优选为至少6mm，进一步优选为至少9mm，进一步优选为数厘米，进一步优选为至少5cm，进一步优选为至少7cm，进一步优选为至少10cm，其中在这三个方向上的延伸度可以相同或者不同。

本发明的流体装置的基体还包括至少两个流体储槽，其优选相互流体分隔。相互流体分隔特别是指：所述流体储槽分别构建为独立的空穴，并且在流体储槽之间不发生直接的流体交换。在此情形下，至多可通过腔室或基质进行间接的流体交换。所述基体特别是可包括至少四个流体储槽。

所述至少两个流体储槽中的每一个均包括用于将流体介质优选不间断地送入对应流体储槽的流体入口、用于将流体介质优选不间断地从对应流体储槽排出的流体出口、以及具有针对流体介质的半透性的分隔装置。所述分隔装置将对应的流体储槽与腔室分隔开，并且构成对应流体储槽的共同的与腔室的平面式界面，流体介质能够通过该界面扩散进入基质。换言之，基体故而包括至少四个独立的流体入口、至少四个独立的流体出口和至少四个独立的分隔装置。由于所述至少四个流体储槽中的每一个均具有自有的流体入口，根据本发明，能够使不同的流体介质流过所述流体储槽。

本发明的流体装置被配置成：在使用适当的流体介质的情况下，在基质中形成至少一个浓度梯度、至少两个相互正交的和/或至少两个相互反向平行的浓度梯度，在基质沿z向的至少一延伸区段的范围内，所述浓度梯度大体均匀或者针对性地不均匀。优选地，在基质沿z向的整个延伸的范围内，基质中的所述至少一个浓度梯度、所述至少两个相互正交的和/或所述至少两个相互反向平行的浓度梯度是大体均匀的。

所述浓度梯度特别是可为物质(例如形态发生素，或者影响形态发生信号通路或分化信号通路的分子)的浓度的梯度。在本发明的范围内，浓度梯度可以是连续的，也可以是不连续的。据此，在特定实施方式中，浓度梯度概念也涵盖复杂的非单调浓度曲线。例如，浓度梯度概念也可以涵盖基质中的具有暂时高浓度的不稳定浓度梯度，其可能因对流体储槽的脉冲式加压而形成。可以理解的是，适当的流体介质是指原则上能够形成浓度梯度的流体介质。

借助本发明的流体装置，基于分隔装置相互之间以及涉及腔室和流体储槽的特定技术方案和布局，能够形成所述相互正交和/或反向平行的浓度梯度。因此，借助本发明的流体装置能够在基质的所有维度上形成生物或非生物物质的定义的浓度。正交和反向平行概念以浓度梯度的方向矢量为基准。据此，反向平行概念表示的是具有彼此相反的方向的浓度梯度。

根据所述特定技术方案和布局，所述平面式分隔装置中的两个均沿z向和x向延伸，其中这两个分隔装置彼此相对地布置，并且因所述腔室而在y向上相互间隔一定距离。借此，在将互不相同的流体介质应用于所述两个沿y向相隔一定距离的流体储槽中的情况下，构成一个沿y向在这两个分隔装置之间延伸的浓度梯度，或者两个相互反向平行的沿y向在这两个分隔装置之间延伸的浓度梯度。在z向和x向上，分隔装置中的这两个的延伸度优选可为数百微米，进一步优选为至少一毫米，进一步优选为数毫米，进一步优选为至少3mm，进一步优选为至少4mm，进一步优选为至少6mm，进一步优选为至少9mm，进一步优选为数厘米，进一步优选为至少5cm，进一步优选为至少7cm，进一步优选为至少10cm，其中在这两个方向上的延伸度可以相同或者不同。分隔装置中的这两个在y向上的相互间隔优选可为数百微米，进一步优选为至少一毫米，进一步优选为数毫米，进一步优选为至少3mm，进一步优选为至少4mm，进一步优选为至少6mm，进一步优选为至少9mm，进一步优选为数厘米，进一步优选为至少5cm，进一步优选为至少7cm，进一步优选为至少10cm。

此外，根据所述特定技术方案和布局，作为附加或替代方案，所述平面式分隔装置中的另两个均沿z向和y向延伸，其中所述另两个分隔装置彼此相对地布置，并且因所述腔室而在x向上相互间隔一定距离。借此，在将互不相同的流体介质应用于所述两个沿x向相隔一定距离的流体储槽中的情况下，构成一个沿x向在这两个分隔装置之间延伸的浓度梯度，或者两个相互反向平行的沿x向在这两个分隔装置之间延伸的浓度梯度。在z向和y向上，分隔装置中的这另外两个的延伸度优选可为数百微米，进一步优选为至少一毫米，进一步优选为数毫米，进一步优选为至少3mm，进一步优选为至少4mm，进一步优选为至少6mm，进一步优选为至少9mm，进一步优选为数厘米，进一步优选为至少5cm，进一步优选为至少7cm，进一步优选为至少10cm，其中在这两个方向上的延伸度可以相同或者不同。分隔装置中的这另两个在x向上的相互间隔优选可为数百微米，进一步优选为至少一毫米，进一步优选为数毫米，进一步优选为至少3mm，进一步优选为至少4mm，进一步优选为至少6mm，进一步优选为至少9mm，进一步优选为数厘米，进一步优选为至少5cm，进一步优选为至少7cm，进一步优选为至少10cm。

据此，平面式界面优选为沿z向并且沿至少另一与z向正交的空间方向(x向或y向)延伸的界面。

分隔装置中的每一个优选可仅沿前述方向延伸，即例如仅沿z向和x向延伸，或仅沿z向和y向延伸。换言之，其形成z-x平面或者z-y平面。换言之，在所述仅沿前述方向延伸(即仅沿z向和x向延伸或仅沿z向和y向延伸)的分隔装置具有相同尺寸的设计方案中，在将所述分隔装置中的两个的布局和设计方案围绕沿z向延伸的轴线旋转90度后，便得到分隔装置中的前述另两个的布局和设计方案。

特别是可使得形式为包含一或数个附加的生物或非生物物质(例如形态发生素、影响形态发生信号通路或分化信号通路的分子、营养素、生长因子、药物)的细胞培养基的流体介质流过彼此相对的分隔装置的流体储槽中的一个，而使得形式为不含这些(用于形成在其间延伸的梯度的)附加物质的细胞培养基或者包含其他(用于形成两个在其间延伸的反向平行的浓度梯度的)物质的细胞培养基的流体介质流过所述另一流体储槽。这样一来，基于所述流体装置的组件的结构布局和设计方案，在基质的一侧上，包含物质(例如形态发生素)的细胞培养基通过所述隔壁中的一个扩散进入基质，以及，在基质的相反的一侧上，不含物质或者含另一物质(例如形态发生素)的细胞培养基通过隔壁中的另一个扩散进入基质，使得在基质的相反的两侧之间随时间形成一个浓度梯度或者两个反向平行的浓度梯度。在使用包含药品的流体介质时，可以将本发明的装置用于基于三维细胞结构的药物测试，从而测量细胞效应的浓度依赖性。

腔室或(可)容置于其中的基质具有数对(至少两对)彼此相反的侧，其相互邻接，故作为反向平行的浓度梯度的附加或替代方案，可借助本发明的流体装置在基质中形成相互正交的浓度梯度。所述两个包含物质的细胞培养基可以互不相同。

可以理解的是，视具体应用或使用的流体介质而定，借助本发明的流体装置能够选择性地形成至少一个浓度梯度、至少两个浓度梯度(两个正交的浓度梯度或两个反向平行的浓度梯度)、至少三个浓度梯度(两个相互反向平行的浓度梯度和一个与这些浓度梯度正交的浓度梯度)、或者至少四个浓度梯度(两个相互反向平行的浓度梯度和两个与其正交并且相互反向平行的浓度梯度)。原则上，本发明的流体装置基于其结构配置而适于在基质中形成至少两个浓度梯度。可以理解的是，用于形成仅一个浓度梯度或者两个反向平行的浓度梯度的流体装置仅需要包括两个具有对应的(即两个彼此相对的)分隔装置的流体储槽。同样可以理解的是，用于形成两个相互正交的浓度梯度、三个或者四个浓度梯度的流体装置需要包括四个具有对应的(即两对分别彼此相对的)分隔装置的流体储槽。

借助流体储槽的结构设计方案，结合以流体装置的与流体储槽结构性或功能性连接的组件(特别是对应的分隔装置、腔室以及流体入口和流体出口)，能够在基质沿z向的至少一个延伸区段的范围内，优选在基质沿z向的整个延伸范围内，实现浓度梯度的均匀性。通过对应的流体入口和流体出口，能够使流体介质不间断地流过流体储槽，进而不间断地为流体储槽供应新鲜的流体介质。这样便能实现新鲜流体介质与旧流体介质的不间断交换，从而实现最佳的营养素供应，并将废料导出。同时，流体储槽使得流入的流体介质以预定的程度积聚在流体储槽中，使得在面向对应的流体储槽的一侧上，整个半透性的分隔装置总是被流体介质完全地(即在分隔装置的整个面的范围内)覆盖。借此能够在相应分隔装置的整个z向延伸范围内，将通过分隔装置中的每一个扩散进入基质的流体介质的体积和浓度保持在恒定水平，从而在基质沿z向的至少一个延伸区段的范围内，优选在基质沿z向的整个延伸范围内，在基质中形成均匀的浓度梯度。

z向上的均匀的浓度梯度优选表示：第一位置z

z向上的不均匀的浓度梯度则优选表示：第一位置z

浓度梯度的预定的(针对性的)不均匀性例如可如下实现：分隔装置中的一个或每一个在分隔装置内具有不同的半透性。据此，与腔室的侧部区域相比，在腔室的中心处，两个相对侧之间的浓度差可以更高。针对性的不均匀性与非针对性的(随机的)不均匀性的区别在于，前者是可通过相应的措施以定义的方式可重现地设置。在其他实施方式中，除了浓度梯度在z向上的上述均匀性或者针对性的不均匀性以外，在既与z向也与浓度梯度的方向正交的空间方向上实现另一均匀性或者另一针对性的不均匀性。前文就浓度梯度在z向上的均匀性和针对性的不均匀性所作的叙述也适用于在所述空间方向的范围内额外的均匀性或者额外的针对性的不均匀性。

通过在包含细胞起始材料的基质中形成至少两个相互正交和/或反向平行的浓度梯度，其分别在基质沿z向的延伸范围内均匀或者针对性地不均匀，能够对细胞起始材料到三维细胞结构(例如细胞培养物到类器官)的三维培育进行空间控制。借此，本发明的流体装置能够针对性地同时培育数个组织区域，例如背侧和腹侧的前脑、中脑和后脑。可以理解的是，除脑组织以外，也可以借助本发明的流体装置培育其他器官组织。此外，与已知的系统相比，使用本发明的流体装置能够增强培育的类器官的可重现性，因为借助该流体装置能够在空间和强度方面有针对性地在基质中形成浓度梯度。

此外，通过腔室和(可)容置于其中的基质在三个不同的空间方向上的延伸，与采用目前的装置的情况相比，能够培育出尺寸更大的三维细胞结构。据此，借助本发明的流体装置的特定实施方式，能够培育出处于毫米乃至厘米范围内的细胞结构。

与现有技术中的装置相比，本发明的流体装置还具有以下优点：通过将流体介质受控地送入流体储槽，以及将流体介质受控地排出流体储槽，能够对各流体储槽中的压力、进而对各侧上的压力进行调节。借此，可借助施压针对性地将新鲜营养素送入相对较大的细胞结构的内部，以及/或者借助减压促进代谢废物流出。这些效应对于较大的类器官以及其他细胞结构的尺寸增长和/或维持而言非常重要，使得所述流体装置具备更多用途。借助现有技术中已知的装置无法实现这一点，在采用这些装置的情况下，从一定的类器官尺寸(通常处于几mm的范围内)起，在内器官内部便难以为细胞供应养分且细胞死亡，因为培养基的成分至类器官内部的扩散路径过大，并且无法通过在将类器官包围的培养基中加压来改善。此外，由于缺少供给，借助已知装置所能实现的尺寸增长也受到限制。

一个实施方式涉及一种流体装置，包括基体，其具有沿x向、与x向正交的y向、以及与x向和y向正交的z向延伸的腔室，在所述腔室中容置有或者可容置基质，以供将待培育的起始材料送入；并且包括至少四个流体储槽。所述至少四个流体储槽中的每一个均包括用于将流体介质送入对应流体储槽的流体入口、用于将流体介质从对应流体储槽排出的流体出口、以及具有针对流体介质的半透性的分隔装置，所述分隔装置将对应的流体储槽与腔室分隔开，并且构成对应流体储槽的共同的与腔室的平面式界面，流体介质能够通过该界面扩散进入基质。所述流体装置被配置成：在使用适当的流体介质的情况下，在基质中形成至少两个相互正交和/或反向平行的浓度梯度，在基质沿z向的至少一延伸区段的范围内，所述浓度梯度均是大体均匀的，具体实现方式为，所述分隔装置中的两个均沿z向和x向延伸，并且彼此相对地布置，并且因所述腔室而在y向上相互间隔一定距离，以及，所述分隔装置中的另两个均沿z向和y向延伸，并且彼此相对地布置，并且因所述腔室而在x向上相互间隔一定距离。

在所述流体装置的一个实施方式中，所述腔室可具有矩形的、优选正方形的横截面。据此，容置于或可容置于其中的基质也可具有对应的矩形的、优选正方形的横截面。

在一个进一步方案中，流体装置的分隔装置可以相连，并且共同地构成位于分隔装置之间的腔室。更确切言之，相邻的分隔装置具有共同的沿z向延伸的边缘。在这个进一步方案中，位于中间的腔室可由分隔装置界定，进而由分隔装置的形状和延伸定义。在此情形下，彼此相对的分隔装置因位于其之间具有另一定向的分隔装置而在x向或y向上相互间隔一定距离。

根据所述流体装置的一个实施方式，所述分隔装置中的每一个均可构建为配设有大量通孔的隔壁的形式。所述通孔可以在整个隔壁的范围内均匀地和/或依据特定样式分布。通过隔壁中的不均匀分布和/或尺寸不均匀的开口，能够针对性地生成不均匀的浓度梯度，其例如在基质沿z向的延伸范围内不同，进而沿z向对组织的不同区域造成不同的影响。相应地，可在基质沿x向和/或沿y向的延伸范围内针对性地形成不均匀的浓度梯度，即不同的浓度差。为此，通孔在对应的方向上的数目特别是可以有变化。通过形成一或数个不均匀的浓度梯度，能够在三维细胞结构中在不同的位置上引发不同的效应。

所述隔壁可每mm

作为隔壁形式的分隔装置的替代方案，在其他实施方式中，分隔装置可构建为膜片、栅格构造或类似的形式。

在所述流体装置的进一步方案中，所述腔室可以包括输入开口和输出开口，腔室在这些开口之间沿z向延伸。沿z向视之，输入开口与输出开口是相互全等的或者至少重叠，使得可借助光束沿z向对腔室进行透射。借此例如能够在培育期间不间断地对分化的类器官进行分析，因为腔室在中心处一概通过输入开口和输出开口向上或向下敞开。借助腔室的包含输入开口和输出开口的进一步方案，特别是能够在培育期间使用显微镜来观察和分析细胞起始材料或(例如细胞培养物或类器官的)三维细胞结构。此外，所述包含输入开口和输出开口的进一步方案是一种开放式系统，其中腔室中的基质能够与环境空气进行气体交换。

前述进一步方案使得所述流体装置可用显微镜检测，但可在基质中形成的正交和/或反向平行的浓度梯度的数目被限制为总共最多四个不同的浓度梯度(两个相互反向平行的x浓度梯度，其沿x向延伸，以及两个与上述浓度梯度正交并且相互反向平行的y浓度梯度，其沿y向延伸)。然而，这对于近乎所有实际应用而言已经足够，因为多数组织/器官沿两个主轴线发育(前-后[前-后]和背-腹[上-下])。但在所述流体装置的一个替代性方案中，也可以具备在基质中形成总共六个浓度梯度(两个相互反向平行的x浓度梯度，其沿x向延伸，两个与上述浓度梯度正交并且相互反向平行的y浓度梯度，其沿y向延伸，以及两个与上述浓度梯度正交并且相互反向平行的z浓度梯度，其沿z向延伸)的能力。在此情形下，可以沿前-后轴线、背-腹轴线和右-左轴线对培育进行控制。在这种替代性进一步方案中，所述流体装置，更确切言之所述基体具有两个额外的分隔装置，其均沿x向和y向延伸，其中这两个额外的分隔装置彼此相对地布置，并且因所述腔室而在z向上相互间隔一定距离。借此，在将互不相同的流体介质应用于与这两个在z向上间隔开的分隔装置对应的流体储槽中的情况下，能够构成处于这两个分隔装置之间的第三浓度梯度。

在一个实施方式中，所述流体装置还可包括盖部，其已与或者可与所述基体连接，并且在z向上在一侧将所述至少四个流体储槽中的至少一个或者所有密封式封闭。特别是可采用以下方案：所述盖部已与或者可与基体可分离地连接，例如借助螺钉连接实现。此外，所述盖部可以至少局部地在腔室的输入开口的范围内延伸，并且在z向上至少部分地将这个输入开口封闭，其中盖部可以具有盖部凹口，其在z向上与腔室的输入开口对准。这样一来，在三维细胞结构的培育期间，可以穿过盖部凹口特别是借助显微镜观察培育过程。通过选择与腔室的输入开口的面积相比更小的盖部凹口面积，盖部还可用于防止基质沿z向意外流出。

所述流体装置还可包括底部组件，其已与或者可与所述基体连接，并且在z向上在另一侧将所述至少四个流体储槽中的至少一个或者所有密封式封闭，其中所述底部组件布置在腔室的与盖部相反的一侧上。特别是可采用以下方案：所述底部组件已与或者可与基体可分离地连接，例如借助螺钉连接实现。此外，所述底部组件可以至少局部地在腔室的输出开口的范围内延伸，并且在z向上至少部分地将这个输出开口封闭，其中底部组件可以具有底部凹口，其在z向上与腔室的输出开口对准。这样一来，在类器官的培育期间，可以穿过底部凹口，或盖部凹口和底部凹口，特别是借助显微镜观察培育过程。这样也能够方便地将结构装入以及将结构从腔室取出。通过选择与腔室的输出开口的面积相比更小的底部凹口面积，底部组件还可用于防止基质沿z向意外流出。优选地，所述底部之间在底部凹口的区域内配设有覆盖玻璃，借此使得流体装置更适于用显微镜检测。

所述流体储槽中的至少一个可以采用开放式构建方案，从而实现与培养箱的连接。

所述底部组件可呈截锥状或者截棱锥状，其顶面与基体邻接。借此，底部组件也可用作流体装置的底座，并且将基体稳定地相对基底支撑。

在一个实施方式中，所述底部组件可以配设有凹口、凹槽、沟槽或者诸如此类。其可如此布置和构建在底部组件上，使得在基体与底部组件相互连接的状态下，所述凹口、凹槽、沟槽或者诸如此类中的各一个与流体储槽的流体出口中的各一个连接，从而将不间断地从流体出口流出的流体介质针对性地导出，例如导出至一或数个相邻的收集容器。

所述流体装置的基体可由金属，优选由不锈钢、玻璃、陶瓷或者聚合物制成。流体装置的其他组件也可以由这些材料中的一个制成，优选由与基体相同的材料制成。流体装置的组件特别是可由可高压灭菌、无细胞毒性且无自体萤光的材料制成。在使用的材料可高压灭菌的情况下，流体装置可重复利用。此外需要避免采用有细胞毒性的材料，因为不阻碍待培育的细胞起始材料的生长。通过使用无自体萤光的材料，能够避免在对具有自体萤光的组分进行显微镜检测时发生非期望的干扰。

所述基质用于在培育期间将待培育的细胞起始材料或待培育的三维细胞结构保持在预定位置中，优选保持在腔室的中心处。也可以将数个三维细胞结构安设在单独一个腔室中。此外，借助基质实现细胞起始材料的定量生长和分化。此外，基质允许流体介质的扩散。优选地，将光学透明材料用作基质，以便观察起始材料或三维细胞结构随时间的培育。所述基质特别是可为水凝胶基质。所述基质特别是可为琼脂糖基质。作为替代方案，例如可以将胶原蛋白基质、基膜类基质(例如

优选地，基质中的琼脂糖比例处于0.4-1.2wt％的范围内。非常高的琼脂糖比例是不利的，因为可能会对类器官的尺寸增长造成阻碍。但琼脂糖比例也不应过小，否则会导致基质的稳定性和耐压性降低，且基质可能会从腔室内部掉落。此外，琼脂糖比例需要足以保持三维细胞结构的稳定性。可以将腔室的内部区域内的和外部区域处(朝向隔壁)的不同的琼脂糖比例加以组合。一般而言，可以将不同的基质物质组合。在某些实施方式中，基质包括各种物质。

在本发明的流体装置的一个进一步方案中，每个流体储槽的流体入口和流体出口可以在z向上相互间隔一定距离，并且优选布置在沿z轴延伸的线上。换言之，每个体储槽的流体入口和流体出口可以具有竖直布局。此举实现每个流体储槽的最佳的不间断通流。在特定实施方式中，每个流体储槽的流体出口的横截面大于同一流体储槽的流体入口的横截面，借此进一步改善流体储槽的通流。作为替代方案，每个流体储槽的流体入口和流体出口可以具有水平布局或者其他布局。每个流体储槽的流体入口与流体出口例如可以互成24度的角度。流体入口和流体出口可以分别具有朝向储槽减小的直径。在将软管连接至流体入口和/或流体出口时，上述方案能够防止软管的前端意外地进入储槽。

本发明还涉及一种流体系统，用于将细胞起始材料培育成一或数个三维细胞结构，以及用于三维细胞结构的进一步培育、成熟改善、尺寸增长促进和/或维持。本发明的流体系统包括前述类型的流体装置和泵系统，其中每个流体入口通过进入软管与用于将流体介质优选不间断地送入对应流体储槽的泵连接。借此，通过所述泵系统能够以预定的方式控制将流体介质送入每个流体储槽的操作。

每个泵可配置成通过所述流体入口以介于1与1000μl/h之间、优选介于1与100μl/h之间、进一步优选介于15与60μl/h之间、进一步优选介于20与50μl/h之间的流率输送流体介质。如下选择流率：使得每个单位时间输送至流体储槽的包含物质(例如形态发生素)的流体介质远多于通过扩散离开流体储槽的包含物质(例如形态发生素)的流体介质，而同时避免基质因流体介质而被压缩。除了恒定流率以外，也可以通过动态流率来实现浓度梯度。通过设置动态流率，可以动态地、特别是脉冲式地为流体储槽施加压力(脉冲)，从而在基质中形成复杂的非单调浓度曲线形式的浓度梯度。

此外，可以借助所述泵系统在相对的流体储槽之间产生定义的压差。此举可能涉及特定的应用，特别是经组织化的三维细胞结构的培育后的过程，如三维细胞结构的维持或者代谢产物的定向导出。

所述泵系统特别是可为喷射泵系统。在此情形下，所述泵为喷射泵。

在所述流体系统的进一步方案中，流体装置的每个流体出口均可与用于将流体介质从对应的流体储槽排出的排出软管连接。每个排出软管均优选可与用于为流体出口施加预定负压的排出泵连接。借此能够更好地控制流率，进而更好地控制流体介质在流体储槽中的通流。可以将泵仅连接至进入软管，仅连接至排出软管，或者同时连接至两者。

在所述流体系统的另一实施方式中，可以设有至少两个、优选数个前述类型的流体装置，其以并联形式布置，并且可借助泵系统并行地为所述流体装置供应流体介质。也可以通过出口处的负压泵系统来实现并联，或者通过进入泵和排出泵的组合来实现并联。

本发明还涉及一种用于将细胞起始材料培育成一或数个三维细胞结构和/或用于三维细胞结构的成熟、尺寸增长或者维持的方法，其中所述方法包括以下步骤：

-在基质中提供待培育的细胞起始材料，所述基质沿x向、与x向正交的y向、以及与x向和y向正交的z向延伸；以及

-在所述基质中形成至少一个浓度梯度、至少两个相互正交的浓度梯度和/或至少两个相互反向平行的浓度梯度，其中所述浓度梯度中的每一个均沿x向或者y向延伸，并且是在z向上均匀或者针对性不均匀的浓度梯度。更确切言之，所述浓度梯度中的每一个均在基质沿z向的至少一个延伸区段或者整个延伸的范围内均匀或者针对性地不均匀。

所述浓度梯度特别是可为形态发生素、影响形态发生信号通路或分化通路的物质、或者药物的浓度的梯度。在某些实施方式中，所述浓度梯度特别是可为形态发生素或者影响形态发生信号通路或分化通路的物质的浓度的梯度。在某些实施方式中，所述浓度梯度特别是可为药物的浓度的梯度。

在进一步方案中，本发明还涉及一种用于将细胞起始材料培育成一或数个三维细胞结构和/或用于三维细胞结构的成熟、尺寸增长或者维持的方法，其中所述方法包括以下步骤：

-在基质中提供待培育的起始材料(一或数个细胞，细胞群，或者组织)，其容置在流体装置的腔室中，其中所述腔室和所述基质沿x向、与x向正交的y向、以及与x向和y向正交的z向延伸，且其中，所述流体装置具有至少两个相互流体分隔的流体储槽，其中所述流体储槽中的每一个均包括具有针对流体介质的半透性的分隔装置，其将对应的流体储槽与腔室分隔开，并且构成对应流体储槽的共同的与腔室的平面式界面，且其中，分隔装置两两一组地布置在基质的彼此相对的侧上；

-使得各一流体介质流过所述至少两个流体储槽；

-在基质中形成至少一个浓度梯度、至少两个相互正交的浓度梯度和/或至少两个相互反向平行的浓度梯度，其均在基质沿z向的至少一个延伸区段的范围内大体均匀或者针对性地不均匀，具体方式为，通过所述至少两个经通流的流体储槽的半透性的分隔装置，使得对应的流体介质在基质沿z向的的延伸范围内扩散进入基质，其中在基质的彼此相反的侧上，互不相同的流体介质扩散进入基质。

特别是可借助前述类型的流体装置或者流体系统来实施所述方法。

本发明的另一方面涉及一种三维细胞结构，其可通过前述类型的方法制造。

可以理解的是，本发明的主题不局限于前述实施方式和/或进一步方案。此外可以理解的是，尽管前文仅结合流体装置或者流体系统对实施方式、进一步方案以及特征中的一些进行了描述，但这些实施方式、进一步方案和特征也相应地适用于本发明的方法。同样地，前文仅结合所述方法描述的实施方式、进一步方案和特征也相应地适用于所述流体装置和/或流体系统。

附图说明

下面结合示意性附图对本发明的实施例进行详细说明。其中

图1为根据一个实施例的流体装置的透视图。

图2为根据图1中的实施例的流体装置的俯视图。

图3为根据图1和图2中的实施例的流体装置的剖视图。

图4为根据图1中的实施例的包含盖部和第一底部组件的流体装置的透视图。

图5为根据图4的包含盖部和第一底部组件的流体装置的剖视图。

图6为根据图1中的实施例的包含盖部和第二底部组件的流体装置的透视图。

图7A至7C示出水凝胶基质的沿z向的延伸的不同位置上的例示性第一浓度梯度。

图8A至8C示出水凝胶基质的沿z向的延伸的不同位置上的例示性第二浓度梯度。

具体实施方式

图1至图3为本发明的流体装置10的一个实施例的各种视图，其中图1为透视图，图2为俯视图，且图3为流体装置10的沿图2中的线A-A的剖视图。

流体装置10具有基体12，在所述基体中形成有腔室14，所述腔室沿x向、与x向正交的y向、以及与x向和y向正交的z向延伸。在所示实施例中，腔室14在所述三个相互正交的方向中的每一个上的延伸度均为数毫米。

腔室14适于容置基质(未绘示)。例如可以将水凝胶基质、特别是琼脂糖基质送入腔室14并将此腔室完全填满。所述基质用于将送入基质的、待借助流体装置10培育成三维细胞结构的细胞起始材料设置在腔室14中的预定的位置中，并将其保持在这个位置中，且同时为培育、尺寸增长、成熟和/或维持提供最佳的环境。

流体装置10的基体12还包括四个流体储槽16，其相互隔开并且完全相互流体隔绝。四个流体储槽16中的每一个均通过分隔装置18与腔室14隔开，其中这四个分隔装置18相连，由此构成位于这些分隔装置之间的腔室14。换言之，分隔装置18中的每一个均在一侧界定对应的流体储槽16，分隔装置18在其另一侧则共同地界定腔室14。优选地，所述四个分隔装置18如所示示例那样构成位于其间的具有正方形横截面的腔室14。因此，在所示示例中，腔室14是具有正方形横截面的立方体。在所示实施例中，分隔装置18均构建为平面状隔壁的形式。

对于可送入流体储槽16的流体介质而言，这四个分隔装置18中的每一个均是半透性的。因此，分隔装置18分别在四个流体储槽16中与之对应的那一个与腔室14之间充当界面，流体介质能够通过该界面从流体储槽16中的每一个进入腔室14以及从腔室14离开。流体介质特别是能够从流体储槽16通过对应的分隔装置18扩散进入容置于腔室14中的基质，并借此在基质中形成浓度梯度。

在如图所示的实施例中，形式为开孔隔壁的分隔装置16中的每一个均配设有大量通孔20。为清楚起见，在附图中用附图标记标示出通孔20中的最多一个。在所示示例中，所述通孔均具有直径约0.5mm的圆形横截面。可以根据使用的基质、根据使用的流体介质、根据期望的浓度差大小以及/或者根据期望的梯度均匀性，来选择通孔的数目、几何结构、尺寸和布局，从而一方面确保在基质与积聚于流体储槽16中的流体介质之间有适当的接触面，以便实现预定的扩散，另一方面防止基质通过通孔20从腔室14离开。

如图1至图3所示，在所示实施例中，平面状分隔装置18中的两个，即分隔装置18A和18B(参阅图2)仅沿z向和x向延伸。这两个分隔装置18A、18B是彼此相对地布置，并且因腔室14而在y向上相互间隔一定距离。借此，在将互不相同的流体介质应用于对应的流体储槽16A、16B中的情况下，构成一个沿y向在这两个分隔装置18A、18B之间延伸的浓度梯度(Y1或Y2)，或者两个相互反向平行的沿y向在这两个分隔装置之间延伸的浓度梯度(Y1和Y2)。仅为了清楚起见，在图2中用附图标记16A至16D区分流体储槽16，并且用附图标记18A至18D区分分隔装置18，以便阐释。

此外还可看出，在所示实施例中，分隔装置18中的另两个，即分隔装置18C和18D(参阅图2)均仅沿z向和y向延伸，其中所述另两个分隔装置18C、18D是彼此相对地布置，并且因腔室14而在x向上相互间隔一定距离。借此，在将互不相同的流体介质应用于对应的流体储槽16C、16D中的情况下，构成一个沿x向在这两个分隔装置18C、18D之间延伸的浓度梯度(X1或X2)，或者两个相互反向平行的沿x向在这两个分隔装置18C、18D之间延伸的浓度梯度(X1和X2)。

这样一来，借助所示流体装置10，在使用适当的流体介质的情况下能够在基质中形成至多四个浓度梯度，即各两对反向平行的浓度梯度(X1、X2和Y1、Y2)，其中这些对相互正交。当然，在特定应用中也可以仅形成所示浓度梯度X1、X2、Y1、Y2中的一个、两个或者三个。基于腔室14或分隔装置18在z向上的延伸，浓度梯度X1、X2、Y1、Y2中的所有均能够在基质沿z向的延伸范围内均匀地形成。在图7A至7C以及图8A至8C中示出这一点，下文将对此作详细说明。

在所示实施例中，基体12具有大体呈圆柱形的造型，其中基体12具有套筒状外罩22。在此示例中，四个流体储槽16中的每一个均由对应的分隔装置18和套筒状外罩22的内周面的对应区段或节段构成。基体12的这种包含套筒状外罩22的圆柱形构建方案特别是有利于流体装置10的制造。例如，可在第一步骤中相互独立地制造套筒状外罩22和构成(具有正方形横截面的)立方体状腔室14的分隔装置18。随后可以将腔室14压入套筒状外罩22的内部凹口，使得立方体状腔室14的四个纵边与套筒状外罩22的内周面发生接触、更确切言之与此内周面形成过盈配合。借此使得四个流体储槽16相互流体隔绝。作为制造各部件且随后将其组装的替代方案，可以一个步骤制造所述系统，例如借助3d打印实现。

流体储槽16中的每一个均配设有形成于基体12中的流体入口24和形成于基体12中的流体出口26(在图1中仅示出两个流体入口24和两个流体出口26)。流体入口24从外部穿过基体12的外罩22向内伸入流体储槽16。流体出口26从流体储槽16的内侧穿过基体12的外罩22向外延伸。从图3特别是可看出这一点。流体入口24和流体出口26可用于使流体介质不间断地流过流体储槽18。借此能够确保新鲜流体介质与旧流体介质的不间断交换，从而实现最佳的营养素供应。借此也能够将在细胞中产生并以较低的浓度存在于储槽中的废料导出。在将超压泵连接于与相对侧相比生成更高压力的一侧时，优选地将此类废料沿一个方向导出。据此，可以将所述流体装置用作动态系统。当然，在其他实施例中，流体入口24和/或流体出口26可以与软管流体连接，以便更好地将使用的介质输入和/或导出。所述软管还可以与泵系统、例如喷射泵系统连接，以便对各流体储槽16中的流率进行控制。优选地，借此能够在流体储槽16中的每一个中实现介于20与50μl/h之间的流率。为此，可以借助泵系统在流体入口24上产生过压，以及/或者在流体出口26上产生负压。

所示流体装置10的腔室14具有输入开口30和输出开口32，腔室14在这些开口之间沿z向延伸。沿z向视之，输入开口30与输出开口32是相互全等的。因此，可借助光束沿z向对腔室14进行透射，以便在培育期间借助显微镜对产生的细胞三维结构进行观察和分析。此外，流体装置10通过腔室14的输入开口30和输出开口32构建为开放式系统，其中腔室14中的基质能够与环境空气进行气体交换。

在本实施例中，流体装置10的基体12还在其端侧上分别具有四个孔34，其中在所示附图中仅能看出端侧36。通过端侧36上的孔34能够将流体装置10的基体12与盖部和/或底部组件连接。

图4示出与基体12连接的盖部38以及与基体12连接的底部组件或底板40的第一实施例。盖部38和底板40是与基体的端侧全等。此外，在图4中，盖部38和底板40采用彼此等同的构建方案。盖部38包括盖部凹口42，其在z向上与腔室14的输入开口30对准。相应地，底板40配设有底部凹口44(参阅图5)，其在z向上与腔室14的输出开口32对准。这样一来，尽管设有盖部38和底板40，流体装置10仍旧可以是开放式系统，具备前述优点和效应。

为了将盖部38以及底板40可分离地与基体连接，盖部38和底板40同样具有四个孔46。通过将盖部38的四个孔46与基体12的孔34对准，能够将盖部38与基体12连接。随后可以将螺钉或者销件置入所述孔。此方案相应地适用于底板40，尽管在附图中未示出底部组件的孔。

如图5以剖视图所示，盖部38和底板40在z向上将流体储槽16封闭。更确切言之，盖部38在z向上在一侧(在图中为自上方)将流体储槽16密封，而底板40则在z向上在相反的一侧(在图中为自下方)将流体储槽16密封。这样一来，流体介质仅能通过流体入口24、流体出口26和半透性的分隔装置18进入流体储槽16或从流体储槽16离开。

图6示出与基体12连接的盖部38以及与基体12连接的底部组件或底板48的第二实施例。图6中的第二实施例的盖部38等同于图4和图5中的第一实施例的盖部38。但这两个实施例的底板有区别。不同于第一实施例的底板40，第二实施例的底板48呈截锥状。底板48借助截锥的顶面与基体12的下端面邻接。借此，底板48也用作流体装置10的底座，其能够将基体12稳定地相对基底支撑。在所示示例中，截锥的顶面略大于基体12的邻接端侧的面。然而，在替代性实施方式中，截锥的顶面与基体12的邻接端侧的面可以彼此等同。

图4和图5中的第一实施例的底板40与图6中的第二实施例的底板48的另一区别在于，底板48具有四个沟槽50或凹槽。沟槽50形成于截锥状底板48的侧面中，并且在底板48与基体12连接的状态下，所述沟槽以分别与流体储槽16的一个流体出口26邻接。借助沟槽50能够将自流体出口26流出的流体介质针对性地导出至一或数个相邻的收集容器。

图7A至7C以及图8A至8C示出可借助本发明的流体装置10形成的例示性的、基质的沿z向的延伸的不同位置上的均匀的第一浓度梯度。更确切言之，图7A和图8A分别示出基质中与腔室14的下端侧间隔1mm处的浓度梯度。图7B和图8B分别示出基质中与腔室14的下端侧间隔2.5mm处的浓度梯度。图7C和图8C分别示出基质中与腔室14的下端侧间隔4mm处的浓度梯度。图7A至图7C示出在以下情形下在基质中构成的浓度梯度：将包含Alexa fluor647-右旋糖酐的流体介质应用在流体储槽16A(参阅图2)中，并且将中性流体介质应用在相对的流体储槽16B(参阅图2)中，所述流体介质通过对应的隔壁18A和18B扩散进入琼脂糖基质。图8A至图8C示出在以下情形下在水凝胶基质中构成的浓度梯度：将包含FITC-右旋糖酐的流体介质应用在流体储槽16C(参阅图2)中，并且将中性流体介质应用在相对的流体储槽16D(参阅图2)中，所述流体介质通过对应的隔壁18C和18D扩散进入琼脂糖基质。借助使用的染料例示性地展示两个相互正交的均匀浓度梯度的形成。可以以类似的方式用生物物质(例如形态发生素，影响形态发生信号通路和/或分化通路的物质，药物)来形成浓度梯度。

10 流体装置

12 基体

14 腔室

16，16A，16B，16C，16D 流体储槽

18，18A，18B，18C，18D 分隔装置

20 通孔

22 外罩

24 流体入口

26 流体出口

30 输入开口

32 输出开口

34 孔

36 端侧

38 盖部

40 底部组件

42 盖部凹口

44 底部凹口

46 孔

48 底部组件

50 沟槽

X1，X2 沿x向延伸的浓度梯度

Y1，Y2 沿y向延伸的浓度梯度。