一种稻田环境中溴虫氟苯双酰胺残留的提取与检测方法

技术领域

本发明涉及农药残留的测定技术领域，更具体的说是涉及一种稻田环境中溴虫氟苯双酰胺残留的提取与检测方法。

背景技术

溴虫氟苯双酰胺为二酰胺类化合物(表1)，是由巴斯夫公司和三井化学公司共同开发的新型杀虫剂，作用机理新颖，与现有杀虫剂无交互抗性，有广阔的应用前景。溴虫氟苯双酰胺可用于防治水稻、蔬菜、大豆、缅花等作物上的害虫，且能够有效的防治对其他杀虫剂产生抗性的害虫。

表1溴虫氟苯双酰胺的理化性质

目前，中国农业大学研究了溴虫氟苯双酰胺在五种土壤中的超高效液相色谱分析方法，江西农业大学研究了5％溴虫氟苯双酰胺悬浮剂的高效液相色谱分析方法，利用超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱对稻田环境中溴虫氟苯双酰胺残留的检测分析方法尚未有人开展研究。

因此，提供一种利用超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱对稻田环境中溴虫氟苯双酰胺残留的检提取与检测方法对于本领域技术人员来说是亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种稻田环境中溴虫氟苯双酰胺残留的提取与检测方法，提供稻田环境(稻田水、稻田土、稻株、稻谷、稻壳)中溴虫氟苯双酰胺残留的提取方法及利用超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱的检测方法。本方法可以高效的提取出稻田环境(稻田水、稻田土、稻株、稻谷、稻壳)中溴虫氟苯双酰胺的残留，并灵敏、精确的检测其残留量，以利于控制污染并确保食品和环境安全。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种稻田环境中溴虫氟苯双酰胺残留的提取与检测方法，包括以下步骤：

S1、样品的采集与提取：

采集样品，再与提取剂混合，提取得到提取液，然后将所述提取液经除水、第一次离心并收集第一上清液，并与净化剂混合进行净化，再进行第二次离心并收集第二上清液，过滤后得到待测溶液；

S2、标准工作液的配制：

配制溴虫氟苯双酰胺浓度为1000mg·L

S3、测定溴虫氟苯双酰胺的含量：

32)标准工作曲线的绘制：

利用超高效液相色谱法-高分辨飞行时间质谱法测定不同浓度梯度的溴虫氟苯双酰胺的标准工作液，并进行回归分析，得到标准工作曲线；

32)测定溴虫氟苯双酰胺的含量：

在相同条件下利用超高效液相色谱法-高分辨飞行时间质谱法测定待测溶液，根据标准工作曲线，得到待测溶液中溴虫氟苯双酰胺的含量，经换算得到样品中溴虫氟苯双酰胺的含量。

优选地，在步骤S1中，所述样品包括稻田水、稻田土、稻株、稻谷和稻壳；

其中稻田土、稻株、稻谷和稻壳在加入提取剂之前要加入超纯水。更具体的将5mL超纯水添加到5g稻田土样品中，将7mL超纯水添加到5g稻谷样品中，将10mL超纯水分别添加到5g稻壳和5g稻株样品中

采用上述技术方案的技术效果：样品加水涡旋之后可形成质地均匀的体系，与随后加入的有机相能够更充分的接触，从而提高提取效率。

优选地，在步骤S1中，所述提取剂为乙腈或含有体积浓度为0.1％甲酸的乙腈，提取温度为15-35℃，提取时间为5-10min；

所述除水是在提取液中加入MgSO

所述第一次离心的温度为2-5℃，转速为11000-15000rpm，时间为5-10min。

优选地，在步骤S1中，所述净化剂为MgSO

所述第二次离心的温度为2-5℃，转速为5000-10000rpm，时间为5-10min。

优选地，所述吸附剂为PSA，且与所述第一上清液的用量比为：(50-100)mg：(1.5-2)mL，用于稻田水的净化处理。

优选地，所述吸附剂为C18，且与所述第一上清液的用量比为：(50-100)mg：(1.5-2)mL，用于稻田土和稻谷的净化处理。

优选地，所述吸附剂为GCB和C18的混合物，且GCB、C18与所述第一上清液的用量比为：(10-50)mg：(50-100)mg：(1.5-2)mL，用于稻株和稻壳的净化处理。

采用上述技术方法的技术效果：PSA是一种弱阴离子交换剂，可从样品中提取有机酸和碳水化合物，C18是一种非极性材料，用于去除极性样品中的非极性和中等极性化合物，GCB是一种有效的吸附剂，用于去除色素，包括叶绿素和类胡萝卜素。

优选地，所述过滤采用0.22μm有机滤膜。

优选地，在步骤S2中，所述不同梯度浓度包括0.05mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L和50mg/L。

优选地，所述超高效液相色谱法采用的色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱。

优选地，所述超高效液相色谱法的色谱条件如下：流动相由0.1％甲酸的水溶液和乙腈组成，且体积比为25:75；采用等度洗脱方式，洗脱时间6min；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。

采用上述技术方法的技术效果：经实验验证，采取本方法提供的色谱条件，杂质峰与目标峰可完全分离，且目标峰峰形优美。

优选地，高分辨飞行时间质谱法的条件如下：加热的电喷雾离子源(HESI)的温度为200℃；喷涂电压为5500V；离子传输管的温度为550℃；离子源气体2；离子源气体和窗帘气体分别为30、145、30psi；正离子采集采用HR MRM扫描方式；采集范围为100～1400Da；第一和第二质量分辨率分别超过26000和25000FWHM；碰撞池能量(CE)为35±15eV。

采用上述技术方法的技术效果：经实验验证，采取本方法提供的质谱条件，杂质峰与目标峰可完全分离，且目标峰峰形优美。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开的一种稻田环境中溴虫氟苯双酰胺残留的提取与检测方法，具有如下有益效果：

(1)本发明提供稻田环境(稻田水、稻田土、稻株、稻谷、稻壳)中溴虫氟苯双酰胺残留的提取方法及利用超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱的检测方法。本方法可以高效的提取出稻田环境(稻田水、稻田土、稻株、稻谷、稻壳)中溴虫氟苯双酰胺的残留，并灵敏、精确的检测其残留量，以利于控制污染并确保食品和环境安全。

(2)本发明提供稻田环境(稻田水、稻田土、稻株、稻谷、稻壳)中溴虫氟苯双酰胺残留量的平均回收率为85.82％-97.46％，平均相对标准偏差(RSD)为3.29％-8.15％，检出限为0.16μg/kg-1.67μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例中溴虫氟苯双酰胺标准曲线图。

图2附图为本发明实施例中溴虫氟苯双酰胺标样(5mg·kg

图3附图为本发明实施例中添加溴虫氟苯双酰胺标样(0.5mg·kg

图4附图为本发明实施例中添加溴虫氟苯双酰胺标样(1mg·kg

图5附图为本发明实施例中添加溴虫氟苯双酰胺标样(1mg·kg

图6附图为本发明实施例中添加溴虫氟苯双酰胺标样(1mg·kg

图7附图为本发明实施例中添加溴虫氟苯双酰胺标样(1mg·kg

图8附图为本发明实施例中不同溶剂对稻田水中溴虫氟苯双酰胺回收率的结果统计图。

图9附图为本发明实施例中不同溶剂pH对溴虫氟苯双酰胺在不同样品中回收率的结果统计图。

图10附图为本发明实施例中不同吸附剂对溴虫氟苯双酰胺在不同样品中回收率的结果统计图。

图11附图为本发明实施例中不同吸附剂用量对稻秆和稻壳中溴虫氟苯双酰胺回收率的结果统计图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中采用的试验材料包括：溴虫氟苯双酰胺标准品(纯度≥98.6％)和5％溴虫氟苯双酰胺悬浮剂(日本三井化学股份有限公司)；甲酸(≥88％)(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；氯化钠(NaCl)；无水硫酸镁(MgSO

实施例中使用的仪器包括：超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱仪(型号：SCIEXX500R，美国AB SCIEX公司)，色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 column(2.1mm×100mm×1.8μm，美国Agilent公司)，高速冷冻离心机(型号：5810R，德国Eppendorf公司)，涡旋混匀器(型号：XH-D，达洛仪器有限公司)，万分之一分析天平(型号：Mettler Toledo AL204，深圳深博瑞仪器有限公司)，超声波清洗器(型号：SB-5200DT，新智生物技术有限公司)，高速粉碎机(型号：FW80，北京永光明医疗器械有限公司)。

本发明实施例提供了一种稻田环境中溴虫氟苯双酰胺残留的提取与检测方法，包括以下步骤：

S1、样品的采集与提取：

采集样品，再与提取剂混合，提取得到提取液，然后将所述提取液经除水、第一次离心并收集第一上清液，并与净化剂混合进行净化，再进行第二次离心并收集第二上清液，过滤后得到待测溶液；

S2、标准工作液的配制：

配制溴虫氟苯双酰胺浓度为1000mg·L

S3、测定溴虫氟苯双酰胺的含量：

33)标准工作曲线的绘制：

利用超高效液相色谱法-高分辨飞行时间质谱法测定不同浓度梯度的溴虫氟苯双酰胺的标准工作液，并进行回归分析，得到标准工作曲线；

32)测定溴虫氟苯双酰胺的含量：

在相同条件下利用超高效液相色谱法-高分辨飞行时间质谱法测定待测溶液，根据标准工作曲线，得到待测溶液中溴虫氟苯双酰胺的含量，经换算得到样品中溴虫氟苯双酰胺的含量。

为了进一步优化上述技术方案，在步骤S1中，稻田环境中的样品包括稻田水、稻田土、稻株、稻谷和稻壳，其中稻田土、稻株、稻谷和稻壳在加入提取剂之前要加入超纯水。

为了进一步优化上述技术方案，在步骤S1中，提取剂为乙腈或含有体积浓度为0.1％甲酸的乙腈，提取温度为15-35℃，提取时间为5-10min；

除水的操作为：在提取液中加入MgSO

第一次离心的温度为2-5℃，转速为11000-15000rpm，时间为5-10min。

为了进一步优化上述技术方案，在步骤S1中，净化剂为MgSO

第二次离心的温度为2-5℃，转速为5000-10000rpm，时间为5-10min。

为了进一步优化上述技术方案，吸附剂为PSA，且与第一上清液的用量比为：(50-100)mg：(1.5-2)mL，用于稻田水的净化处理；

吸附剂为C18，且与第一上清液的用量比为：(50-100)mg：(1.5-2)，用于稻田土和稻谷的净化处理；

吸附剂为GCB和C18的混合物，且GCB、C18与第一上清液的用量比为：((10-50)mg：(50-100)mg：(1.5-2)mL，用于稻株和稻壳的净化处理。

为了进一步优化上述技术方案，过滤采用0.22μm有机滤膜。

为了进一步优化上述技术方案，在步骤S2中，不同梯度浓度包括0.05mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L和50mg/L。

为了进一步优化上述技术方案，超高效液相色谱法采用的色谱柱为AgilentEclipse XDB-C18色谱柱。

为了进一步优化上述技术方案，超高效液相色谱法的色谱条件如下：流动相由0.1％甲酸的水溶液和乙腈组成，且体积比为25:75；采用等度洗脱方式，洗脱6min；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。

为了进一步优化上述技术方案，高分辨飞行时间质谱法的条件如下：加热的电喷雾离子源(HESI)的温度为200℃；喷涂电压为5500V；离子传输管的温度为550℃；离子源气体2；离子源气体和窗帘气体分别为30、145、30psi；正离子采集采用HR MRM扫描方式；采集范围为100～1400Da；第一和第二质量分辨率分别超过26000和25000FWHM；碰撞池能量(CE)为35±15eV。

实施例1

本实施例提供了一种稻田环境中溴虫氟苯双酰胺残留的提取与检测方法，包括以下步骤：

(1)大田试验设置

田间试验于2019年7月在江西省宜春市上高县曾家村实施。试验根据中华人民共和国农业部药检所发布的《农药残留试验指南》(NY/T788-2018)进行设计，每个小区面积为30m

(2)样品采集与提取

2.1样品采集

空白样品取自江西省宜春市上高县曾家村未施用溴虫氟苯双酰胺的试验田。采样在水稻收获期进行。用烧杯随机舀取5份(每份1kg)稻田水样品，混合均匀并过滤；在0-20cm深土壤表层随机收集5份(每份1kg)稻田土样品，将样品充分混合、风干、研磨、过20目筛，并分成四等份以获得500g子样品；用剪刀随机收割5份(每份1kg)稻株样品，稻株剪成0.5cm长，放入高速粉碎机搅碎；在水稻成熟阶段，随机收集了5份(每份1kg)的稻穗样品并去壳，分别将稻壳和稻谷粉碎，将所有稻壳和稻谷样品分成4等份，每份500g。样品在-18℃以下保存直至使用。

2.2样品提取

样品前处理参考QuEChERS方法。使用乙腈作为提取剂从样品中提取溴虫氟苯双酰胺。用移液枪将5mL稻田水样品转移到50mL离心管中，添加10mL乙腈，使用涡旋混匀器进行5min剧烈涡旋，涡旋结束后将2gMgSO

(3)标准溶液的配制

使用分析天平(±0.0001g)称取0.1014g的溴虫氟苯双酰胺标准品，置于100mL容量瓶中。加入85mL乙腈溶解，使用超声波清洗器进行助溶20分钟，冷却至室温，静置40分钟。然后，将含有1000mg·L

(4)利用UHPLC-ESI-QTOF-MS检测

将步骤S2中的不同浓度梯度的标准工作液进行超高效液相色谱法-高分辨飞行时间质谱法UHPLC-ESI-QTOF-MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；

在相同条件下将步骤S1中样品的待测溶液进行UHPLC-ESI-QTOF-MS测定，测得待测溶液中溴虫氟苯双酰胺中的色谱峰面积，代入标准曲线，得到待测溶液中溴虫氟苯双酰胺的含量，经换算得到样品中溴虫氟苯双酰胺的含量。

溴虫氟苯双酰胺残留通过超高效液相色谱(UHPLC)与混合四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪(ABSCIEXX500R)进行分析。在环境温度(30℃)下，流动相由溶剂A(0.1％甲酸水)和溶剂B(色谱级乙腈)组成(25：75，v/v)，选择AgilentEclipseXDB-C18色谱柱(2.1mm×100mm×1.8μm)进行分离实验。采用40％A的等距洗脱步骤，以0.3mL/min的流速洗脱6分钟。柱温40℃，样品进样量为10μL，样品存储在4℃下。光谱条件如下：加热的电喷雾离子源(HESI)的温度为200℃；喷涂电压为5500V；离子传输管的温度为550℃；离子源气体2；离子源气体和窗帘气体分别为30、145、30psi；正离子采集采用HRMRM扫描方式；采集范围为100～1400Da；第一和第二质量分辨率分别超过26000和25000FWHM；碰撞池能量(CE)为35±15eV。

(5)检测结果分析

1)方法实际应用效果验证。

基于本发明提供的UHPLC-ESI-QTOF-MS方法，测定了稻田中100个实际样品中的残留溴虫氟苯双酰胺浓度。检测结果的浓度范围在0.95-14.86μg·kg

2)线性相关性测定。

在确定的色谱分析条件下，配制一系列不同质量浓度的标准溶液进行测定。以溴虫氟苯双酰胺的质量浓度为横坐标，其峰面积值为纵坐标，用安捷伦液相色谱工作站拟合工作曲线，得线性回归方程y＝17.576x+1.4606，线性相关系数r＝0.9999，如图1所示。在不同样品(稻田水、稻田土、稻株、稻谷和稻壳)中溴虫氟苯双酰胺的回归方程、相关系数(R

表1不同样品中溴虫氟苯双酰胺的回归方程、相关系数、检出限、定量限和基质效应。

在不同样品(稻田水、稻田土、稻株、稻谷和稻壳)中，每种样品加标准物3种浓度的加标回收率和相对标准偏差，如表2所示，其中稻田水分别0.0.1、0.05、0.5mg·kg

其中，溴虫氟苯双酰胺标样(5mg·kg

3)溶剂的优化。

在杀虫剂残留分析中，样品的预处理和准备是最耗时且最复杂的过程。杀虫剂的化学性质决定了可用于提取的溶剂：典型的例子包括丙酮，乙酸乙酯，乙腈，甲醇和二氯甲烷。这项研究比较了这五种溶剂在稻田水样品中溴虫氟苯双酰胺的加标回收率，添加量分别为0.01和0.1mg·kg

然后，将一定体积分数(0.1％)的甲酸和氢氧化钠(NaOH)添加到乙腈中，并研究了加标浓度为0.5mg·kg

4)吸附剂的优化。

为了获得满意的溴虫氟苯双酰胺提取物，在QuEChERS程序中将PSA，C18和GCB作为吸附剂进行了比较。PSA是一种弱阴离子交换剂，可从样品中提取有机酸和碳水化合物；C18是一种非极性材料，用于去除极性样品中的非极性和中等极性化合物；GCB是一种有效的吸附剂，用于去除色素(包括叶绿素)和类胡萝卜素。使用MgSO

由于稻株和稻壳中的色素含量很高，因此将C18与GCB结合使用可减少干扰。鉴于GCB对颜料的高吸附能力，控制吸附剂剂量以防止回收不足至关重要。加标浓度为0.1mg·kg

因此，获得了通过QuEChERS程序提取和纯化溴虫氟苯双酰胺的最佳条件：稻田水为50mg PSA+150mg MgSO

综上所述，本发明提供稻田环境(稻田水、稻田土、稻株、稻谷、稻壳)中溴虫氟苯双酰胺残留的提取方法及利用超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱的检测方法。本方法可以高效的提取出稻田环境(稻田水、稻田土、稻株、稻谷、稻壳)中溴虫氟苯双酰胺的残留，并灵敏、精确的检测其残留量，以利于控制污染并确保食品和环境安全。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。