用于保护猪对抗猪链球菌的疫苗

技术领域

本发明涉及保护猪对抗各种血清型的猪链球菌细菌致病性感染。

背景技术

猪链球菌(S.suis)是猪中接触传染性细菌性疾病的主要病原体之一。病原体可引起多种临床综合征，包括脑膜炎、关节炎、心包炎、多发性浆膜炎、败血病、肺炎和猝死。S.suis是革兰氏阳性兼性厌氧球菌，最初被定义为兰斯斐尔德(Lancefield)类群R、S、R/S或T。以后，提出了一种基于位于细胞壁中的类型特异性荚膜多糖抗原的新分型系统。这产生了包含35种血清型的系统(Rasmussen和Andresen,1998,“16S rDNA sequencevariations of some Streptococcus suis serotypes”,Int.J.Syst.Bacteriol.48,1063-1065)，其中的血清型2、9、1、7和1/2最为普遍，而血清型14是特别在欧洲出现的。猪群中猪链球菌的控制看来似乎非常困难。猪链球菌是猪的共生体和机会病原体。显然，并不是在每一次感染时都触发免疫系统。紧跟在这之后的是，猪链球菌是充分包有荚膜的病原体，并使用毒力因子库来逃避宿主免疫系统。这些特征已共同向开发有效疫苗来对抗这种重要病原体提出了挑战。最近，关于抗猪链球菌的疫苗的综述文章已经发表(Mariela Segura:“Streptococcus suis vaccines:candidate antigens and progress,Expert Review ofVaccines,第14卷，2015,第12期，第1587-1608页)。在这个综述中，已搜集并比较了临床现场信息(clinical field information)和实验数据，以概述抗猪链球菌的疫苗开发的现状，如下文所概述的。

当前使用的疫苗主要是全细胞菌苗。然而，现场报告描述了在疾病控制和管理中的困难，且特别地“疫苗失败(vaccine failure)”是常见的。携带者猪是主要的传染源，且垂直传递和水平传递两者都与疾病在畜群中的扩散有关。在应激性条件下，例如断奶和运输，将携带者动物与易感动物混合通常导致临床疾病。早期投药的断奶和分开的早期断奶实践没有消除猪链球菌感染。因此，预防疾病的有效控制措施的关键将在于预防/补救性预防(metaphylactic)程序(在允许的场合)和接种。目前，现场免疫工作已集中在商业或自体菌苗的使用上。这些疫苗策略已应用于小猪或母猪。自断奶及以后，由于与断奶亦及后来常见的运输相关的应激，小猪更易感猪链球菌感染。因此，经常使用母猪的分娩前(prepartum)免疫来对小猪尝试且传递被动免疫，并在一生中早期的这些应激性情况下提供抗猪链球菌的保护。此外，母猪接种成本较低且劳动强度较低，因而代表了小猪接种的经济备用方案。然而，可用的结果似乎表明用菌苗进行母猪接种也是一个有争论的问题。在许多情况下，接种的母猪，甚至当在分娩前接种两次时，对接种的反应也不良或根本没有反应，这导致传递到幼崽的母体免疫低。而且即使母体免疫以足够的水平传递，在许多情况下，母源性抗体仍然太低以致于无法在4-7周龄的最关键时期中提供保护。

在小猪中，在现场频繁地使用自体菌苗，尤其是在欧洲。它们是从有临床问题的农场分离的强毒株制备的，并应用于同一农场。自体菌苗的缺点之一是缺乏疫苗安全性数据并且可能发生严重的不利反应。采样错误(由于仅使用一头或两头猪或一个或两个样品)可能导致不能鉴定与最近的暴发有关的菌株或血清型。这种失败在地方性畜群中可能尤其成问题。最后，自体菌苗最重要的困境是对它们的实际功效尚缺少研究。由于自体疫苗的应用是根据经验性的，所以使用这些疫苗获得的结果不一致也就不令人惊讶了。

本领域还描述了其他实验性疫苗。Kai-Jen Hsueh等人表明(“Immunization withStreptococcus suis bacterin plus recombinant Sao protein in sows conveyspassive immunity to their piglets”,BMC Veterinary Research,BMC series–open,inclusive and trusted,13:15,2017年1月7日)菌苗+亚单元(subumit)可能是成功接种母猪以给予其小猪保护性免疫的基础。

在本领域中也已预期活减毒疫苗。猪链球菌血清型2的未包有荚膜的同基因突变体已被清楚地表明是无毒性的。然而，基于未包有荚膜的血清型2突变体的活疫苗制剂仅诱导对抗死亡率的部分保护，且未能阻止用野生型菌株攻击的猪中临床病征的发展(Wisselink HJ,Stockhofe-Zurwieden N,Hilgers LA等，“Assessment of protectiveefficacy of live and killed vaccines based on a non-encapsulated mutant ofStreptococcus suis serotype 2.”Vet Microbiol.2002,84:155–168.)

在过去的几年中，经报道了抗原性或免疫原性猪链球菌分子的广泛清单，并且已通过使用来自感染的猪或人的恢复期血清和/或实验室产生的免疫血清的免疫蛋白质组学发现了这些中的大多数。WO2015/181356(IDT Biologika GmbH)已显示，IgM蛋白酶抗原(完整蛋白或仅相当于全蛋白约35％的高度保守的Mac-1结构域)可以在任选与含菌苗的最初接种(prime vaccination)组合的施用两剂IgM蛋白酶抗原的接种方案中在小猪中引发保护性免疫应答。要指出的是，WO2017/005913(Intervacc AB)也描述了IgM蛋白酶抗原(特别是与核苷酸酶融合的IgM蛋白酶多肽)的用途。然而，仅已显示了能够引起血清应答(seroresponse)的性质。在这个国际专利申请中未显示IgM蛋白酶抗原的保护作用。

增加提供抗猪链球菌的足够保护的问题的另一个因素是现有疫苗的异源保护的缺乏。例如，Porcilis

这些发现与Smith(US 7,125,548；2006年10月24日公布)的发现一致。她指出：“抗体是血清型特异性的，且将经常仅给予抗一群链球菌中已知的许多血清型中的仅一种的保护。例如，通常基于猪链球菌的全细胞细菌制剂或荚膜富集的级分的目前可商购获得的猪链球菌疫苗仅给予抗异源菌株的有限保护”(美国专利第4栏第42-28行)。2008年1月发表的一项研究(Medycyna Weterynaryjna，第64卷，第1期，第113-116页)描述了抗血清型2和1/2的猪链球菌细菌的保护。如果在不同血清型之间将存在任何预期水平的异源保护，那么其将在这些血清型之间，这是因为它们在免疫学上非常紧密地相关。两种血清型仍然都包含在疫苗中以获得足够的保护。总部设在英国的RUMA(Responsible Use of Medicines inagriculture Alliance)已于2006年11月发表了关于在猪生产中使用疫苗和接种的指南。关于由猪链球菌引起的疾病，这些指南指出(在第19页)，可以通过接种母猪来实现对猪的保护，但是“不太可能发生对抗由其他猪链球菌血清型引起的疾病的保护”。

发明目的

本发明的目的是找到在保护猪对抗链球菌属，特别是抗两种流行的血清型2和14的细菌中有效的疫苗。进一步的目的是达到(至少)相当于现有的可商购获得的菌苗疫苗的保护水平的抗两种血清型细菌的保护水平。

发明内容

为了达到本发明的主要目的，已发现猪链球菌的IgM蛋白酶抗原可用于保护猪对抗血清型2的猪链球菌的致病性感染和对抗血清型14的猪链球菌的致病性感染的方法中。IgM蛋白酶抗原一般包含在疫苗组合物中，即可以安全施用于猪的组合物，在所述组合物中抗原与药学上可接受的载体混合以易于施用。通过给猪施用抗原，发现猪被保护以对抗血清型2和血清型14的猪链球菌细菌的致病性感染。甚至发现抗两种血清型的保护水平相当于当使用常规的血清型2菌苗疫苗(参看Porcilis Strepsuis)时达到的同源保护水平。这意味着至少在血清型2和血清型14之间对于IgM蛋白酶抗原已显示出异源保护。这是第一次通过使用仅一种抗原就已显示出对抗至少血清型2和血清型14的猪链球菌细菌的足够的主动保护，特别是第一次使用IgM蛋白酶抗原已显示出这一点。这提供了给猪本身接种并诱导主动异源保护的独特选择，而不是依靠可以通过免疫的母体动物的初乳获得的短暂的被动保护，如从WO2010/108977已知的。紧跟在这之后的是，同源和异源两者的实际保护水平似乎显著好于用已知的菌苗型疫苗所可获得的水平。

本发明还涉及猪链球菌的IgM蛋白酶抗原在制备用于保护猪对抗血清型2的猪链球菌的致病性感染和抗血清型14的猪链球菌的致病性感染的疫苗中的用途，且涉及用于通过向猪施用包含猪链球菌的IgM蛋白酶抗原的疫苗来保护猪对抗血清型2的猪链球菌的致病性感染和抗血清型14的猪链球菌的致病性感染的方法。

如上文所指出的，在疫苗中，抗原一般与药学上可接受的载体组合，即生物适合性介质，即，在施用后不在主体动物中诱导显著不利反应，在施用疫苗后能将抗原呈递给宿主动物的免疫系统的介质。这种药学上可接受的载体可以例如是包含水和/或任何其他生物适合性溶剂的液体或固体载体，例如通常用于获得冷冻干燥的疫苗(基于糖和/或蛋白质)的，任选地包含免疫刺激剂(佐剂)。取决于疫苗的预期用途或所需性质，可以添加任选地其他物质，例如稳定剂、粘度调节剂或其他组分。

定义

猪链球菌的IgM蛋白酶抗原是特异性降解猪IgM(而不是猪IgG或猪IgA；Seele等人,Journal of Bacteriology,2013,195 930-940；和Vaccine 33:2207-2212；2015年5月5日)的酶，称为IdeSsuis的蛋白质，或其免疫原性部分(一般具有全长酶的至少约30-35％的长度)。完整酶具有约100-125kDa的重量，对应于约1000-1150个氨基酸，大小取决于S.suis的血清型。在WO 2015/181356中，给出了代表猪链球菌的IgM蛋白酶抗原的几个序列，即SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：5，后者是全长酶的免疫原性部分(表示为Mac-1结构域，即SED ID NO:7的氨基酸80-414)。全长酶的免疫原性部分的其他例子在WO2017/005913中给出。特别地，所述IgM蛋白酶可以是根据WO2015/1818356的SEQ ID NO：1的蛋白酶或在重叠区域中具有至少90％，或甚至91、92、93、94、95、96、97、98、99％一直到100％序列同一性的蛋白质。可以用使用带有默认参数的blastp算法的BLAST程序确立氨基酸序列同一性。预期各种血清型的猪链球菌的IgM蛋白酶具有高于90％的序列同一性，特别是预期为91、92、93、94、95、96、97、98、99％一直到100％。例如，为了在抗原重组生产系统中最优化得率而制备的人工蛋白质与完整酶相比可能导致较低的氨基酸序列同一性，例如85％、80％、75％、70％或甚至60％，同时保持所需的免疫原性功能，并且被理解为是在本发明的意义上的猪链球菌的IgM蛋白酶抗原。

抗微生物的致病性感染的保护与获得保护性免疫相同，即，帮助预防、改善或治愈该微生物的致病性感染或由该感染引起的病症，例如预防或减少由病原体的致病性感染引起的实际感染或一种或多种临床病征。

包括仅施用一次抗原的方法意味着仅在单次注射抗原后给予的保护性免疫，且因此，省略了加强接种以获得所述保护性免疫。在两次注射方案中，第一次(最初)接种一般在自第一次施用的6周内进行加强，通常在自第一次施用的3或甚至2周内，并且仅在第二次(加强)施用后，才理解为获得了保护性免疫，即如上文所定义的成功保护。

具体实施方式

在本发明的第一实施方式中，所述方法包括仅对猪施用一次抗原。出乎意料地，仅一次注射的抗原似乎能够引发猪中的保护性免疫。在本领域中，非活的猪链球菌疫苗已一直以初免-加强(prime-boost)方案施用，且仍然导致相对差的功效。关于供本发明中使用的抗原，本领域(参见WO2015/181356和WO2017/005913)已在两次注射施用方法中一贯地使用这种抗原，任选地使用复合疫苗(即，不止仅IgM蛋白酶抗原)。因此，发现单剂IgM蛋白酶能够诱导猪中的保护性免疫是令人惊讶的。

在第二个实施方式中，所述方法包括在最多28日龄向猪施用抗原。如上文所示的，猪链球菌是猪的共生体和机会病原体。特别地，在应激下，细菌可引发致病性感染并诱导疾病。在现代猪生产条件下，在猪达到28日龄时或之后诱导主要应激，例如，由小猪断奶(3-4周)和其后不久幼小小猪的运输所诱导的。为了对抗猪链球菌的致病性感染，因此，猪需要在非常幼小的龄期就接受其疫苗，一般在它们达到28日龄之前。发现通过在最多28日龄在猪中使用IgM蛋白酶抗原，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28日的任何龄期，可以获得足够的(异源)保护。如本领域中已知的，特别是从WO2017/005913，自出生日及以后，可以在幼小的猪中获得抗IgM蛋白酶抗原的阳性免疫应答。这意味着，通过目前显示在25日龄猪中的实际保护作用，可以理解的是，甚至在更幼小的龄期也能获得保护。

在另一个实施方式中，所述方法包括在猪断奶的龄期之前施用抗原。换句话说，抗原在小猪实际断奶之前(一般在3-4周龄)施用。已经显示，在这个早期龄期使用抗原，可以获得对抗由正好在断奶后2-3周的短窗口内的应激诱导的猪链球菌致病感染的异源保护。公认的是，WO2015/181356显示了使用IgM蛋白酶作为抗原的成功接种。然而，除了未显示异源保护的事实外，所述疫苗用于具有5-7周龄且在9周龄期接受攻击感染的小猪，因此在断奶/运输后2-3周即5-7周龄的危险期(即致病性猪链球菌感染的最高发病率时期)后很久。因此，在实际情况下(即在断奶和运输应激后2-3周的窗口中攻击感染)没有任何有效性的证据的情况下，除了是否将达到异源保护的问题外，如WO 2015/181356中所述的IgM蛋白酶/菌苗组合疫苗策略是否在实际情况下，仍然是有疑问的。

在再另一个实施方式中，所述方法包括向具有母体来源的抗猪链球菌抗体的猪施用抗原。幼小动物的主动接种具有可能干扰通过母猪自然感染或主动免疫产生的母源性抗体的顾虑(Baums CG,Bruggemann C,Kock C,et al.“Immunogenicity of an autogenousStreptococcus suis bacterin in preparturient sows and their piglets inrelation to protection after weaning”,in:Clin Vaccine Immunol.2010；17:1589–1597)。的确，在8周龄时，来自免疫的母猪的哺乳和断奶小猪的接种都不伴随显著的主动免疫应答和保护的产生。这种失败与母源性抗体或其他初乳组分的强抑制作用有关。在这方面，母源性抗体和抗猪链球菌抗体的主动产生之间的干扰也可以在接种自体猪链球菌荚膜类型1/2疫苗制剂后的现场研究中得到证实(Lapointe L,D’Allaire S,Lebrun A,et al.:“Antibody response to an autogenous vaccine and serologic profile forStreptococcus suis capsular type 1/2.”in:Can J Vet Res.2002；66:8–14)。目的在于确定单剂猪链球菌血清型14菌苗规程在4-日龄的哺乳小猪中的功效的现场研究也未能保护小猪对抗同源攻击(Amass SF,Stevenson GW,Knox KE,et al.“Efficacy of anautogenous vaccine for preventing streptococcosis in piglets”in:Vet Med.1999,94,480–484)。因此令人惊讶的是，使用IgM蛋白酶抗原，甚至在有母体来源的抗猪链球菌抗原的情况下也可以获得足够的保护。

在再另一个实施方式中，所述方法用于赋予保护免于与猪链球菌血清型2和血清型14的致病性感染相关的死亡。

在再另一个实施方式中，所述方法用于赋予保护免于与猪链球菌血清型2和血清型14的致病性感染相关的临床体征。与猪链球菌致病性感染有关的典型临床病征是升高的直肠温度、受损的运动(跛行，肿胀关节)、增加的呼吸率和神经病征(例如震颤、抽搐、斜颈(torticollosis)、共济失调)。除了表明致病性感染正在被抑制外，预防、改善或治愈这些病征中的一种或多种对将猪是有益的。

现在将基于以下实施例进一步解释本发明。

实施例

实施例1

第一项研究的目的是测试IgM蛋白酶抗原，在这种情况下是猪链球菌血清型2的IgM蛋白酶抗原，与常规的含灭活的血清型2猪链球菌细菌的菌苗疫苗(参看PorcilisStrepsuis)相比，是否能够提供抗血清型2的猪链球菌攻击的保护。

研究设计

使用了30头断奶的猪。将猪分配到各10头猪的三个组中(在不同的幼崽范围内均匀分布)。第1组在5周和7周龄用在水包油型佐剂中每剂230μg(如通过使用BSA作为标准物的Bradford蛋白质测定所确定的)的重组rIdeSsuis IgM蛋白酶抗原(Seele等人:Vaccine33:2207-2212；2015年5月5日,2.2.节)肌内两次接种。第2组在5周和7周龄用在水包油型佐剂中的血清型2全细胞菌苗(参看Porcilis Strepsuis)肌内两次接种(阳性对照)。第3组未接种并充当攻击对照。在9周龄时，猪用猪链球菌血清型2的致病性强的培养物攻击。在攻击之前和之后的定期时间，收集肝素血液以重新分离攻击菌株。攻击后，每天观察猪的猪链球菌感染的临床病征(例如抑郁、运动问题和/或神经病征)，并使用从0(无病征)变为严重病例的3的常规评分系统进行评分。对严重受影响的动物实施安乐死术并进行尸检。在研究结束时(攻击后7天)，对所有存活的猪实施安死术并进行尸检。

结果

没有一种疫苗诱导任何不可接受的部位或全身反应，且因此可以被认为是安全的。表1显示了安乐死术(第7天)之前时间段的攻击后数据。要注意的是，在攻击日，第1组中的一头猪似乎是最弱小的仔畜，且决定不攻击该动物。两种疫苗的平均临床分数、攻击后死亡的动物数目以及可以从血液中重新分离出病原体的动物数目似乎都得到了改善。

表1：攻击后数据研究1

结论

如所预期的，灭活的全细胞疫苗诱导显著的同源保护。IgM蛋白酶抗原诱导抗猪链球菌血清型2感染的甚至更好的保护。

实施例2

第二项研究的目的是测试IgM蛋白酶抗原是否能够提供抗血清型14的猪链球菌攻击的保护。

研究设计

研究的设计大体上与第一项研究的相同。使用10头猪的组，并在5周和7周龄用IgM蛋白酶抗原接种两次(第1组)，或者使它们作为未接种的对照动物(第2组)。在9周龄时，将猪用猪链球菌血清型14的致病性强的培养物攻击。

结果

同样在这项研究中，疫苗没有诱导任何不可接受的部位或全身反应。在初次接种的当天(5周龄)，大多数猪的(母源性)抗体滴度约为4log 2。疫苗接种后，疫苗组在加强免疫后显示出良好的抗体应答，平均抗体滴度为9.3log2。对照动物的抗体滴度保持在较低水平，平均抗体滴度为4.1log2。表2中显示了安乐死术(攻击后第11天时)之前的时间段的攻击后数据(ACS＝平均临床分数；APT＝平均峰值温度；AST＝平均生存时间；DAC＝攻击后死亡；PBI＝阳性血液分离)。

表2：攻击后数据研究2

结论

尽管在这项研究中，攻击似乎显示出较弱的毒力，但是结果表明，IgM蛋白酶抗原诱导了针对猪链球菌血清型14攻击的保护作用。通过临床分数、达到人道终点的动物数目以及可以从血液中重新分离出攻击细菌的动物数目的减少证明了这一点。紧跟其后的是，似乎接种疫苗的动物的平均生存时间更好。和第一项研究的数据一起，可以得出结论认为，IgM蛋白酶抗原能够提供对抗用血清型2和血清型14的细菌的致病性猪链球菌感染的保护。这意味着，并且考虑到血清型2的IgM蛋白酶和血清型14的IgM蛋白酶之间的高度同一性，已经证明了这些血清型之间的交叉保护作用(即猪链球菌血清型2的IgM蛋白酶保护对抗血清型14攻击，且反之亦然)。同样，似乎抗两种血清型的保护水平相当于(或甚至好于)用通常可获得的血清型2菌苗疫苗可获得的同源保护水平。

实施例3

由于优选在危险期(一般为4-7周龄)获得对于猪的抗猪链球菌的保护，所以评估了含IgM蛋白酶的疫苗作为母体来源的抗猪链球菌阳性猪中于3周龄的一次注射疫苗是否有效。

研究设计

研究设计与前两项研究的设计类似，而主要区别在于，对3周龄的抗-Ssuis MDA阳性小猪而不是5周龄的动物进行接种(每10头动物中只有1头似乎具有低于检出限的MDA水平)。第1组用在水包油型佐剂中的IgM蛋白酶抗原肌内一次接种。第2组充当阴性攻击对照组。在4周龄时，使小猪断奶。在6周龄时，将小猪运输到攻击室并立即攻击。在运输和攻击之间没有顺应期以模拟自然应激。用猪链球菌血清型2的致病性强的培养物攻击小猪。

结果

疫苗没有诱导任何不可接受的部位或全身反应。表3显示了安乐死术(第7天)之前的时间段的攻击后数据。在攻击日，第2组中的一头猪似乎是最弱小的仔畜，且决定不攻击该动物。

表3：攻击后数据研究3

结论

总之，结果证明，通过仅一次施用IgM蛋白酶抗原，在3周龄MDA阳性小猪中就可诱导抗猪链球菌致病性感染的足够保护，即使当在接种后3周、断奶后2周和运输后立即进行攻击时。尽管仅用血清型2攻击证明了这一点，但由于实施例2表明抗原也能够诱导抗血清型14的保护，所以要理解的是，当目的在于这种类型的猪中抗血清型14感染的保护时获得类似的结果。