一种二代测序捕获探针的制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种二代测序捕获探针的制备方法。

背景技术

第二代DNA测序技术(简称“二代测序”)又称下一代测序技术，是对第一代测序技术的划时代变革的核心。现有的技术平台主要包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Sol-exaGenomeAnalyzer、Helicos BioSciences公司的HeliScope

杂交捕获的原理是认为设计探针，探针可以和目标区段部分或者全部互补。探针会将目标区段捕获，未设计探针的区段会被洗脱丢弃，之后通过变性将探针和捕获区段分开，倍捕获的片段即可进行二代测序文库构建。

本发明中的一种二代测序捕获探针的制备方法，实质上是固态杂交法，又称固相法，其本质就是芯片，芯片上布满了探针，其特点是DNA探针，探针长度为50-105bp不等，其探针的密度和序列都可以认为设置，相对而言，针对一个区段的探针密度越大，其捕获成功率越高。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种二代测序捕获探针的制备方法，解决现在技术中，如何利用固相化学法制备二代测序捕获探针，为二代测序研究提供了保障的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种二代测序捕获探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：氨解处理；

步骤二：活化纯化柱；

步骤三：纯化；

步骤四：测量、质谱检测。

作为本发明进一步的方案：所述氨解处理的具体过程如下：

S21、氨解前处理：向合成板的每孔中加入50μL的质量分数为10％的二乙胺，静置10min，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，之后再向每孔中加入50μL的体积分数为10％的二乙胺，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，然后用乙腈清洗2次，第2次清洗结束后在转速为4000r/min的条件下高速离心1min；

S22、氨解：

S221、第一步氨解：取一块新384板贴上标签，标签数据与原板相同，置于合成板底层，向合成板的每孔中加入50μL冰氨水，之后用保鲜膜横3层竖3层包裹，保证严密不漏气，置于氨解铁盒内，之后将氨解铁盒放置于温度为45℃的烘箱中氨解1h；

S222：氨解结束取出冷却，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，之后取出放置于通风橱中，用剪刀剪去保鲜膜，再次向合成板的每孔中加入50μL的冰氨水，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，取出，保留于收集板中；

S223：第二步氨解：在收集板上盖上塑胶盖，用保鲜膜横3层竖3层包裹，保证严密不漏气，置于氨解铁盒内，之后将氨解铁盒放置于温度为90℃的烘箱中氨解3h；

S224：氨解结束后，将氨解铁盒取出放在阴凉、通风处降温15-20min，待温度冷却，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，打开氨解铁盒，去掉塑胶盖，之后置于90℃烘箱中烘干残余氨水。

作为本发明进一步的方案：所述活化纯化柱的具体过程如下：

S31：往收集板的每孔内添加相应体积的体积分数为100％的乙腈，静置20s后，在转速为2800r/min的条件下配平高速离心1min；

S32：再重复S31步骤3次；

S33：之后往收集板的每孔内添加相应体积的0.1mol/L的TEAA溶液清洗，静置20s后，在转速为2800r/min的条件下配平高速离心1min；

S34：再重复S33步骤3次，得到活化的纯化柱。

作为本发明进一步的方案：所述纯化的具体过程如下：

S41：往收集板的每孔内加入M1-M2混合液100μL，静置2min待样品与溶液充分接触，得到待纯化样品；

S42、样品转移、吸附过柱：将待纯化样品转移至活化的纯化柱内，静置5s后，之后在转速为100r/min的条件下配平高速离心5min，之后在转速为300r/min的条件下配平高速离心5min，之后在转速为800r/min的条件下配平高速离心5min，之后在转速为1600r/min的条件下配平高速离心2min，之后在转速为2400r/min的条件下配平高速离心2min；

S43：再重复S42步骤4-6次，以保证全部吸附至纯化柱，母液保存，纯化柱继续下面步骤；

S44：往纯化柱内添加100μL的0.1mol/L的TEAA溶液清洗，静置5s后，在转速为2400r/min的条件下配平高速离心1min；

S45：再重复S44步骤2次；

S46：在纯化柱底部放置一块96孔收集板，往纯化柱内添加100μL的M4试剂，静置后，在转速为2400r/min的条件下配平高速离心1min，观察收集板内液体颜色；正常情况下颜色为橙红色，颜色越红，说明吸附上的DNA片段也就越多，但时间也不是越长越好，时间过长会出现脱嘌呤；

S47：在纯化柱底部放置一块新的384孔收集板，往纯化柱内添加100μL的M5试剂，静置30s后，在转速为300r/min的条件下配平高速离心1min，之后在转速为800r/min的条件下配平高速离心1min，之后在转速为1600r/min的条件下配平高速离心1min，之后在转速为2400r/min的条件下配平高速离心1min。

作为本发明进一步的方案：所述测量、质谱检测的具体过程如下：

S51：将384孔收集板置于震荡仪上震荡混匀30min后，取2μL的引物与48μL的水混匀后置于酶标仪测量；

S52：取5μL的引物与60μL的水混匀后进行质谱检测。

作为本发明进一步的方案：所述TEAA溶液是由三乙胺、醋酸、水按照体积比为14:6:80的混合物。

作为本发明进一步的方案：步骤S41中所述M1-M2混合液为M1试剂和M2试剂按照体积比为2:3的混合物，其中M1试剂是体积分数为3％的三乙胺溶液，M2试剂是由N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺、水按照体积比为5:2:93的混合物；步骤S46中所述M4试剂为体积分数为2％的三氟乙酸；步骤S47中所述M5试剂为体积分数为25％的乙腈。

作为本发明进一步的方案：合成过程中使用768合成仪，768合成仪运行，开始至少监控第一个碱基完整循环，着重监控试剂喷打，载体完整、试剂渗透及载体试剂抽干情况，并着重观察第一个碱基结束时的DMT颜色，中途不定期观察运行状态，同时需核对试剂量是否充足，缓冲瓶试剂液面是否没过试剂管路底部。

本发明的有益效果：

本发明的一种二代测序捕获探针的制备方法，通过固相亚磷酸酰胺三脂法将DNA固定在固相载体上，经过脱保护、耦连、加帽、氧化四步循环反应，逐步将若干个核苷酸单体依次连接上去，最终完成DNA链的合成，此法具有高效、快速偶联、起始反应物比较稳定的优点。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本实施例为一种二代测序捕获探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：氨解处理；

步骤二：活化纯化柱；

步骤三：纯化；

步骤四：测量、质谱检测。

所述氨解处理的具体过程如下：

S21、氨解前处理：向合成板的每孔中加入50μL的质量分数为10％的二乙胺，静置10min，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，之后再向每孔中加入50μL的体积分数为10％的二乙胺，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，然后用乙腈清洗2次，第2次清洗结束后在转速为4000r/min的条件下高速离心1min；

S22、氨解：

S221、第一步氨解：取一块新384板贴上标签，标签数据与原板相同，置于合成板底层，向合成板的每孔中加入50μL冰氨水，之后用保鲜膜横3层竖3层包裹，保证严密不漏气，置于氨解铁盒内，之后将氨解铁盒放置于温度为45℃的烘箱中氨解1h；

S222：氨解结束取出冷却，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，之后取出放置于通风橱中，用剪刀剪去保鲜膜，再次向合成板的每孔中加入50μL的冰氨水，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，取出，保留于收集板中；

S223：第二步氨解：在收集板上盖上塑胶盖，用保鲜膜横3层竖3层包裹，保证严密不漏气，置于氨解铁盒内，之后将氨解铁盒放置于温度为90℃的烘箱中氨解3h；

S224：氨解结束后，将氨解铁盒取出放在阴凉、通风处降温15min，待温度冷却，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，打开氨解铁盒，去掉塑胶盖，之后置于90℃烘箱中烘干残余氨水。

所述活化纯化柱的具体过程如下：

S31：往收集板的每孔内添加相应体积的体积分数为100％的乙腈，静置20s后，在转速为2800r/min的条件下配平高速离心1min；

S32：再重复S31步骤3次；

S33：之后往收集板的每孔内添加相应体积的0.1mol/L的TEAA溶液清洗，静置20s后，在转速为2800r/min的条件下配平高速离心1min；

S34：再重复S33步骤3次，得到活化的纯化柱。

所述纯化的具体过程如下：

S41：往收集板的每孔内加入M1-M2混合液100μL，静置2min待样品与溶液充分接触，得到待纯化样品；

S42、样品转移、吸附过柱：将待纯化样品转移至活化的纯化柱内，静置5s后，之后在转速为100r/min的条件下配平高速离心5min，之后在转速为300r/min的条件下配平高速离心5min，之后在转速为800r/min的条件下配平高速离心5min，之后在转速为1600r/min的条件下配平高速离心2min，之后在转速为2400r/min的条件下配平高速离心2min；

S43：再重复S42步骤4次，以保证全部吸附至纯化柱，母液保存，纯化柱继续下面步骤；

S44：往纯化柱内添加100μL的0.1mol/L的TEAA溶液清洗，静置5s后，在转速为2400r/min的条件下配平高速离心1min；

S45：再重复S44步骤2次；

S46：在纯化柱底部放置一块96孔收集板，往纯化柱内添加100μL的M4试剂，静置后，在转速为2400r/min的条件下配平高速离心1min，观察收集板内液体颜色；正常情况下颜色为橙红色，颜色越红，说明吸附上的DNA片段也就越多，但时间也不是越长越好，时间过长会出现脱嘌呤；

S47：在纯化柱底部放置一块新的384孔收集板，往纯化柱内添加100μL的M5试剂，静置30s后，在转速为300r/min的条件下配平高速离心1min，之后在转速为800r/min的条件下配平高速离心1min，之后在转速为1600r/min的条件下配平高速离心1min，之后在转速为2400r/min的条件下配平高速离心1min。

所述测量、质谱检测的具体过程如下：

S51：将384孔收集板置于震荡仪上震荡混匀30min后，取2μL的引物与48μL的水混匀后置于酶标仪测量；

S52：取5μL的引物与60μL的水混匀后进行质谱检测。

所述TEAA溶液是由三乙胺、醋酸、水按照体积比为14:6:80的混合物。

步骤S41中所述M1-M2混合液为M1试剂和M2试剂按照体积比为2:3的混合物，其中M1试剂是体积分数为3％的三乙胺溶液，M2试剂是由N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺、水按照体积比为5:2:93的混合物；步骤S46中所述M4试剂为体积分数为2％的三氟乙酸；步骤S47中所述M5试剂为体积分数为25％的乙腈。

实施例2：

本实施例为一种二代测序捕获探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：氨解处理；

步骤二：活化纯化柱；

步骤三：纯化；

步骤四：测量、质谱检测。

所述氨解处理的具体过程如下：

S21、氨解前处理：向合成板的每孔中加入50μL的质量分数为10％的二乙胺，静置10min，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，之后再向每孔中加入50μL的体积分数为10％的二乙胺，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，然后用乙腈清洗2次，第2次清洗结束后在转速为4000r/min的条件下高速离心1min；

S22、氨解：

S221、第一步氨解：取一块新384板贴上标签，标签数据与原板相同，置于合成板底层，向合成板的每孔中加入50μL冰氨水，之后用保鲜膜横3层竖3层包裹，保证严密不漏气，置于氨解铁盒内，之后将氨解铁盒放置于温度为45℃的烘箱中氨解1h；

S222：氨解结束取出冷却，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，之后取出放置于通风橱中，用剪刀剪去保鲜膜，再次向合成板的每孔中加入50μL的冰氨水，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，取出，保留于收集板中；

S223：第二步氨解：在收集板上盖上塑胶盖，用保鲜膜横3层竖3层包裹，保证严密不漏气，置于氨解铁盒内，之后将氨解铁盒放置于温度为90℃的烘箱中氨解3h；

S224：氨解结束后，将氨解铁盒取出放在阴凉、通风处降温20min，待温度冷却，在转速为4000r/min的条件下高速离心1min，打开氨解铁盒，去掉塑胶盖，之后置于90℃烘箱中烘干残余氨水。

所述活化纯化柱的具体过程如下：

S31：往收集板的每孔内添加相应体积的体积分数为100％的乙腈，静置20s后，在转速为2800r/min的条件下配平高速离心1min；

S32：再重复S31步骤3次；

S33：之后往收集板的每孔内添加相应体积的0.1mol/L的TEAA溶液清洗，静置20s后，在转速为2800r/min的条件下配平高速离心1min；

S34：再重复S33步骤3次，得到活化的纯化柱。

所述纯化的具体过程如下：

S41：往收集板的每孔内加入M1-M2混合液100μL，静置2min待样品与溶液充分接触，得到待纯化样品；

S42、样品转移、吸附过柱：将待纯化样品转移至活化的纯化柱内，静置5s后，之后在转速为100r/min的条件下配平高速离心5min，之后在转速为300r/min的条件下配平高速离心5min，之后在转速为800r/min的条件下配平高速离心5min，之后在转速为1600r/min的条件下配平高速离心2min，之后在转速为2400r/min的条件下配平高速离心2min；

S43：再重复S42步骤6次，以保证全部吸附至纯化柱，母液保存，纯化柱继续下面步骤；

S44：往纯化柱内添加100μL的0.1mol/L的TEAA溶液清洗，静置5s后，在转速为2400r/min的条件下配平高速离心1min；

S45：再重复S44步骤2次；

S46：在纯化柱底部放置一块96孔收集板，往纯化柱内添加100μL的M4试剂，静置后，在转速为2400r/min的条件下配平高速离心1min，观察收集板内液体颜色；正常情况下颜色为橙红色，颜色越红，说明吸附上的DNA片段也就越多，但时间也不是越长越好，时间过长会出现脱嘌呤；

S47：在纯化柱底部放置一块新的384孔收集板，往纯化柱内添加100μL的M5试剂，静置30s后，在转速为300r/min的条件下配平高速离心1min，之后在转速为800r/min的条件下配平高速离心1min，之后在转速为1600r/min的条件下配平高速离心1min，之后在转速为2400r/min的条件下配平高速离心1min。

所述测量、质谱检测的具体过程如下：

S51：将384孔收集板置于震荡仪上震荡混匀30min后，取2μL的引物与48μL的水混匀后置于酶标仪测量；

S52：取5μL的引物与60μL的水混匀后进行质谱检测。

所述TEAA溶液是由三乙胺、醋酸、水按照体积比为14:6:80的混合物。

步骤S41中所述M1-M2混合液为M1试剂和M2试剂按照体积比为2:3的混合物，其中M1试剂是体积分数为3％的三乙胺溶液，M2试剂是由N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺、水按照体积比为5:2:93的混合物；步骤S46中所述M4试剂为体积分数为2％的三氟乙酸；步骤S47中所述M5试剂为体积分数为25％的乙腈。

实施例1-2的质谱检测如下表所示：

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。