一种神经元特异性烯醇化酶的冻干方法

技术领域

本发明属于冻干技术领域，具体涉及一种神经元特异性烯醇化酶的冻干方法。

背景技术

神经元特异性烯醇化酶(Neuron-Specific Enolase，NSE)是一种分子量约78000的酸性蛋白酶。NSE是小细胞肺癌的重要标志物之一，可用于鉴别诊断，以及检测小细胞肺癌放疗、化疗后的治疗效果。NSE还可用于神经母细胞瘤和肾母细胞瘤的鉴别诊断，对神经母细胞瘤的早期诊断亦有较高的临床应用价值。

NSE是一种不稳定的生物活性物质，在常温和2-8℃环境中会迅速丧失活性。当NSE作为试剂盒组分使用时，如果不进行冻干处理，会造成检测错误并导致试剂盒失效。使用特殊的缓冲体系溶解NSE并将其冻干为干粉，可以长时间保持其活性，保证试剂盒的稳定性和有效性。

使用一般缓冲液溶解NSE，在常温(10-30℃)环境下可以保持活性3天、在2-8℃条件下可保持活性3个月、在-20℃条件下可保持活性9个月。保存时间较短，不利于试剂盒产品的生产、储存及应用。

中国专利申请CN 106568976 A公开了一种神经元特异性烯醇化酶稳定剂及其制备方法，涉及神经元特异性烯醇化酶稳定剂，通过如下原料制备而成：Tris·HCl缓冲液、NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、PEG6000、赖氨酸、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇、甘油、Tween-20、TritonX-100、终浓度抑肽酶、Proclin300，Millipore超纯水作为溶剂，溶液混匀后用0.22μm滤膜过滤，0～10℃保存。能提高神经元特异性烯醇化酶的保存稳定性，延长试剂盒的货架寿命；简化神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒的生产工艺及医生检测操作过程；提高了神经元特异性烯醇化酶配制、运输和储存过程中抗质变的能力；降低了由冻干工艺造成的批间差。但是该稳定剂中的有效成分种类较多成本较高，另外，该发明中使用的成分复杂，不同成分之间的相互作用反而不利于稳定剂提高NSE保存的稳定性。

本发明的目的是为了使神经元特异性烯醇化酶保持最大的活性，而提供的一种有效的冻干品制备方法。

发明内容

为克服以上技术问题，本发明提供了一种神经元特异性烯醇化酶(NSE)的冻干方法，该冻干方法能有效保存神经元特异性烯醇化酶，有利于保持其最大的活性。

为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：

一种神经元特异性烯醇化酶的冻干方法，包括以下步骤：取缓冲液将NSE溶解，制成NSE试剂，放入真空冷冻干燥机内进行冻干；其中，所述缓冲液包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钾(KCl)、十二水磷酸氢二钠、硫酸镁、海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)。

优选地，按照重量份数计，所述缓冲液包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷4-20份、KCl6-25份、十二水磷酸氢二钠1-6份、硫酸镁0.1-10份、海藻糖5.0-50份、BSA 1.0-50份。

优选地，按照重量份数计，所述缓冲液包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷4.2-15.6份、KCl 8.5-24份、十二水磷酸氢二钠1.2-5.8份、硫酸镁0.1-10份、海藻糖5.0-50份、BSA1.0-50份；

优选地，所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取Tris、KCl、十二水磷酸氢二钠、MgSO

(2)用滤膜进行过滤，即可。

优选地，所述pH值在6.8～8.5之间。

优选地，所述滤膜的孔径为0.22μm。

优选地，所述NSE试剂由NSE抗原和缓冲液配制而成，用于标准品、质控品或参考品。

优选地，所述冻干方法，包括以下步骤：

将真空冷冻干燥机设置成三个阶段，分别为预冷冻段、升华干燥段、解析干燥段；冻干后，在4-8℃环境下保存。

优选地，所述预冷冻段为：将NSE试剂从常温降温至0℃；降温时间为30分钟；

在0℃保温10分钟后，再降温至-30℃，降温时间为30分钟；

在-30℃保温60分钟后，再降温至-55℃，降温时间为30分；在-55℃保温240分钟；

优选地，所述升华干燥段为：将真空度在1-5分钟内降至0-5帕斯卡(pa)；设置7个温度点，分别为-50℃、-45℃、-35℃、-30℃、-25℃、-25℃、-5℃；

-55℃到-50℃的升温时间为10分钟、在-50℃的保温时间为60分钟；

-50℃到-45℃的升温时间为60分钟、在-45℃的保温时间为120分钟；

-45℃到-35℃的升温时间为60分钟、在-35℃的保温时间为240分钟；

-35℃到-30℃的升温时间为60分钟、在-30℃的保温时间为480分钟；

-30℃到-25℃的升温时间为60分钟、在-25℃的保温时间为240分钟；

-25℃到-15℃的升温时间为60分钟、在-15℃的保温时间为120分钟；

-15℃到-5℃的升温时间为30分钟、在-5℃的保温时间为60分钟。

优选地，所述解析干燥段为：设置两个温度点，分别为20℃、25℃；

-5℃到20℃的升温时间为120分钟、在20℃的保温时间为60分钟；

20℃到25℃的升温时间为15分钟、在25℃的保温时间为460-620分钟。

与现有技术比，本发明的技术优势在于：

1.本发明提供的冻干方法使用本发明提供的缓冲体系能够有效提高NSE的保存效果，可使NSE在4-8℃储存期达到12个月、在-20℃储存期达到3年。

2.本发明提供的冻干方法及缓冲液能够提高NSE检测试剂的检测灵敏度；检测灵敏度达到0.5纳克/毫升(0.5×10

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

一种神经元特异性烯醇化酶的冻干方法，包括以下步骤：

(1)制备缓冲液

所述缓冲液包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷16g、KCl 12g、十二水磷酸氢二钠3g、硫酸镁6g、海藻糖7g、BSA 15g。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：

称取Tris、KCl、十二水磷酸氢二钠、MgSO

(2)冻干品的制备

取NSE重组蛋白以缓冲液将其溶解，充分混合后配制成6个浓度的NSE试剂作为校准品，浓度为0ng/mL、1ng/mL、20ng/mL、75ng/mL、150ng/mL、300ng/mL。

(3)将不同浓度的冻干品放入真空冷冻干燥机的冻干仓内，按照表1设计好的程序进行冻干。冻干后，在4-8℃环境下保存。

表1冻干程序

实施例2

一种神经元特异性烯醇化酶的冻干方法，包括以下步骤：

(1)制备缓冲液

所述缓冲液包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷4g、KCl 25g、十二水磷酸氢二钠1g、硫酸镁0.1g、海藻糖50g、BSA 1.0g。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取Tris、KCl、十二水磷酸氢二钠、MgSO

(2)冻干品的制备

取NSE重组蛋白以缓冲液将其溶解，充分混合后配制成6个浓度的NSE试剂作为校准品，浓度为0ng/mL、1ng/mL、20ng/mL、75ng/mL、150ng/mL、300ng/mL。

(3)将不同浓度的冻干品放入真空冷冻干燥机的冻干仓内，按照表2设计好的程序进行冻干。冻干后，在4-8℃环境下保存。

表2冻干程序

实施例3

一种神经元特异性烯醇化酶的冻干方法，包括以下步骤：

(1)制备缓冲液

所述缓冲液包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷20g、KCl 6g、十二水磷酸氢二钠6g、硫酸镁10g、海藻糖5.0g份、BSA 50g。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取Tris、KCl、十二水磷酸氢二钠、MgSO

(2)冻干品的制备

取NSE重组蛋白以缓冲液将其溶解，充分混合后配制成6个浓度的NSE试剂作为校准品，浓度为0ng/mL、1ng/mL、20ng/mL、75ng/mL、150ng/mL、300ng/mL。

(3)将不同浓度的冻干品放入真空冷冻干燥机的冻干仓内，按照表3设计好的程序进行冻干。冻干后，在4-8℃环境下保存。

表3冻干程序

对比例1

与实施例1相比，区别仅在于缓冲液的组成不同。

将部分海藻糖替换为蔗糖，其余步骤不变。

一种神经元特异性烯醇化酶的冻干方法，包括以下步骤：

(1)制备缓冲液

所述缓冲液包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷16g、KCl 12g、十二水磷酸氢二钠3g、硫酸镁6g、蔗糖5g、海藻糖2g、BSA 15g。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：

称取Tris、KCl、十二水磷酸氢二钠、MgSO

(2)-(3)的过程同实施例1。

对比例2

与实施例1相比，区别仅在于缓冲液的组成不同。

将硫酸镁替换为乙二胺四乙酸二钠，其余步骤不变。

一种神经元特异性烯醇化酶的冻干方法，包括以下步骤：

(1)制备缓冲液

所述缓冲液包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷16g、KCl 12g、十二水磷酸氢二钠3g、乙二胺四乙酸二钠6g、海藻糖7g、BSA 15g。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：

称取Tris、KCl、十二水磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、牛血清白蛋白，加入到纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值至7.0，定容至1000ml；用0.22μm的滤膜进行过滤，即可。

(2)-(3)的过程同实施例1。

对比例3

与实施例1相比，区别仅在于缓冲液的组成不同。

将十二水磷酸氢二钠替换为NaCl。

一种神经元特异性烯醇化酶的冻干方法，包括以下步骤：

(1)制备缓冲液

所述缓冲液包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷16g、KCl 12g、NaCl 3g、硫酸镁6g、海藻糖7g、BSA 15g。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：

称取Tris、KCl、NaCl、MgSO

(2)-(3)的过程同实施例1。

对比例4

与实施例1相比，区别仅在于冷冻程序不同，其它步骤不变。

表4冻干程序

对比例5

中国专利申请CN 106568976 A的具体实施例1。

NSE稳定剂的制备，组成见下表：

表5 CN 106568976 A的具体实施例1组分

制备步骤为：

1.称取Tris适量，加入Millipore超纯水溶解，配成50mM的Tris溶液，用盐酸调节pH＝7.4；

2.依次称取的NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、PEG6000、赖氨酸、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇，溶解于Tris·HCl缓冲液；

3.取甘油、Tween-20、Triton X-100、抑肽酶和Proclin 300加入上述配制好的溶液中，充分搅拌溶解，最后用0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。

效果例

1.检测方法

采用北京美联泰科生物技术有限公司自研的全自动化学发光免疫分析仪进行检测。反应所需样本量为30μL，自动检验流程为：

①免疫反应：将30μL样本、50μL试剂A、50μL试剂B、50μL试剂C依次加入反应孔位，在37℃条件下反应20min。

②磁分离及清洗：在1号清洗孔位加入300μL清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出反应孔位，在1号清洗孔位脱磁。清洗2min后。在2号或3号清洗孔位分别进行1次磁分离及清洗。

③读值：在测读孔位加入150uL发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出3号清洗孔位，在测读孔位脱磁。ALP催化的发光底物发光后检测相对发光强度(RLU)。

④根据检测的校准品数值可获得一条NSE浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。

⑤样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。

2.检测指标

2.1外观

冻干品应为白色、无杂质的疏松体。冻干物质整体应为上、下等宽的柱状体，上表面不应出现裂痕、下表面不应出现收缩。整体不应出现明显气孔。复溶后液体均匀(无肉眼可见颗粒、无沉淀)，视为合格。

2.2浓度偏差

使用神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒(磁微粒化学发光法)对六个浓度的冻干品进行检测，进行双平行测试。按照设置完成的程序运行，结束后读取发光值，将浓度和发光值输入仪器进行拟合。按公式(1)进行计算。浓度偏差应满足：B点浓度在瓶标浓度±12％范围内；C点、D点、E点、F点在瓶标浓度±8％范围内(其中，A：0ng/mL；B：1ng/mL；C：20ng/mL；D：75ng/mL；E：150ng/mL；F：300ng/mL)。视为合格。

浓度偏差＝(拟合浓度-瓶标浓度)/瓶标浓度…………………(1)

2.3含水量

取10个不同浓度的冻干品。将冻干品去除顶盖和胶塞后称重，记为M1

含水量＝[(M1

2.4准确度

将浓度约为20ng/mL(允许偏差±10％)的神经元特异性烯醇化酶(NSE)液(A)加入到浓度范围0ng/mL-0.5ng/mL的样本B中，所加入NSE抗原与样本B之间的体积比例为1:9，使用冻干品和配套的检测试剂盒(磁微粒化学发光法)进行检测。根据公式(3)计算回收率R，其回收率应在85％～115％范围内。视为合格。

式中：

R—回收率；

V—样品A液的体积；

V

C—血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；

C

C

2.5线性区间

将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(y

式中：

r————相关系数；

x

y

2.6重复性

重复测试冻干品C点10次，计算10次测试结果的平均值

式中：s——样本测试值的标准差；

2.7稳定性效果

实验方法：在不同的条件下(4-8℃设置0个月、3个月、6个月、9个月、12个月五个时间节点；-20℃设置0个月、6个月、12个月、18个月、24个月、36个月六个时间点)使用上述2.1-2.6记载的指标检测方法进行试验，测试实施例1-3及对比例1-5的稳定性，2.1-2.6六个指标中，每合格一个指标计1分，六个指标均合格者为6分即为满足有效期条件。试验结果见下表：

表6稳定性效果数据

由此可知，本发明提供的缓冲液及冻干方法可以使NSE在4-8℃下能有效保存12个月，-20℃下有效保存36个月。当改变缓冲液体系或者冻干方法时，其性能稳定性受到不同程度的影响。同时，由对比例5的实验结果可知，当缓冲液中增加过多的有效成分时反而不利于稳定剂提高NSE的保存稳定性。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。