一种灵芝酸A的检测方法

技术领域

本发明涉及食用菌中功能性成分快速检测的技术领域，更具体的说是涉及一种灵芝酸A的检测方法。

背景技术

灵芝富含多种活性成分，其药理作用各不相同。灵芝三萜是灵芝的主要活性成分之一，具有保肝护肝、抗肿瘤、增强免疫、抗氧化、降血脂血糖等功效。根据调查分析发现，在灵芝不同部位灵芝三萜化合物含量差别较大，而且不同品种间、野生与不同培育方式下灵芝三萜类的含量差别也比较大。因此，测定灵芝三萜对于灵芝原料和灵芝产品的质量控制具有重要意义。

对灵芝三萜可进行定性和定量分析，定性分析可采用化学试剂特征显色法；定量分析可采用香草醛-浓硫酸试剂可见光比色法、紫外分光光度法、薄层层析法、高效液相色谱法以及色谱-质谱联用技术。

高效液相色谱法已广泛用于灵芝三萜的定性测定中，具有分离效果好、操作简单、重现性好、仪器精密度好、灵敏度高等优点。此方法的主要缺陷为：灵芝三萜标准品的分离纯化困难，制备出的灵芝三萜纯品价格昂贵，仪器成本专业化程度高，普及较为困难。目前测定灵芝三萜的方法仅用于测定一种或几种灵芝三萜，而灵芝三萜种类有上百种，检测数量受限，并且检测时间和成本都比较高。

灵芝酸A在灵芝三萜中所占比例最大，是灵芝三萜类标志物之一，根据报道，灵芝酸A在提高免疫力功能方面起到主要作用。因此，灵芝酸A可以作为灵芝产品质量控制的一个重要指标。结合上述问题，开发一种快速、简便且能够定量测定灵芝酸A的检测方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种灵芝酸A的检测方法，在灵芝为原料的产品加工过程中，对灵芝酸A的含量调控和产品质量监控提供了一种简易、快速的定量测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种灵芝酸A的检测方法，采用酶联免疫吸附测定法，具体步骤为：

S1，制备试样，得到待测试样液，配制待测试样稀释液，将20μg/mL灵芝酸A偶联蛋白包被的酶标板置于室温中，在酶标板上选取标准孔标记为A1-A6，分别加入0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L灵芝酸A标准溶液50μL，酶标板上其它孔作为检测孔，分别加入50μL待测试样稀释液，再向酶标板的所有孔中分别加入效价值为1：20的灵芝酸A抗体溶液50μL，在振荡器上混匀，置入恒温培养箱中，37℃温度下反应30min；

S2，从培养箱中取出酶标板，甩干，加250μL洗涤液，洗板4次，每次间隔1min，洗板过程中洗涤液不溢出，洗板结束甩干洗涤液，向酶标板的所有孔中分别加入100μL的过氧化物酶标记的第一抗体溶液；

S3，在振荡器上混匀，置入恒温培养箱中，37℃温度下反应30min，从培养箱中取出酶标板，甩干，加250μL洗涤液，洗板5次，每次间隔1min，洗板过程中洗涤液不溢出，洗板结束甩干洗涤液，向酶标板的所有孔中分别加入50μL底物B液和50μL底物A液，底物B液为含0.05mg/ml过氧化氢尿素、0.1mol/L柠檬酸和0.2mol/L磷酸氢二钠的缓冲液，底物A液为0.2mg/ml四甲基联苯胺溶液，摇匀，置入恒温培养箱中，37℃温度下反应15min；

S4，向酶标板的所有孔中加入50μL硫酸溶液终止反应，硫酸溶液的浓度为1mol/L；

S5，将酶标板置于酶标测定仪上，在450nm处测定标准浓度孔及试样孔的吸光度值，计算相对吸光度值，绘制灵芝酸A标准溶液浓度与相对吸光度值关系的标准曲线，进行定量测定待测试样中灵芝酸A的含量。

优选的，所述步骤S1中制备试样，对块状、片状或颗粒状的样品进行粉碎后过10目筛，取筛下物。

优选的，所述步骤S1中制备待测试样液的过程为，精确称量5g筛下物，精确度为0.01g，置入100mL具塞三角瓶中，加入无水乙醇25mL，加塞振荡1min，浸泡24h，再加塞振荡1min，过滤得到待测试样液。

优选的，所述步骤S1中待测试样液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液进行稀释，稀释倍数按体积比为1：10

优选的，所述步骤S1中，酶标板的包被浓度为20μg/mL。

优选的，所述步骤S2中的过氧化物酶标记的第一抗体溶液以酶标记物体积：稀释液体积为1：1000进行稀释，效价值为1：500-2000。

优选的，所述步骤S5中，在450nm处测定吸光度值后，用不同浓度灵芝酸A标准溶液及待测试样稀释液测定的吸光度值除以0μg/L灵芝酸A标准溶液的吸光度值计算相对吸光度值。

优选的，所述标准曲线以灵芝酸A标准液浓度为横坐标，百分相对吸光度值为纵坐标，待测试样稀释液根据百分相对吸光度值及标准曲线得到对应的灵芝酸A的浓度。

优选的，所述步骤S5中，定量测定待测试样中灵芝酸A的含量，以质量分数X计，按式(1)计算：

其中，式中：

ρ为根据标准曲线得出待测试样稀释液中灵芝酸A的浓度；

v——待测试样稀释液的体积；

n——待测试样稀释液的稀释倍数；

m——试样的质量。

优选的，所述灵芝酸A的含量X，单位为μg/kg。

优选的，所述ρ单位为μg/L。

优选的，所述m单位为kg。

优选的，所述v单位为L。

优选的，计算结果保留2位有效数字。

优选的，计算结果经过重复测定，相对偏差≤15％。

经由上述技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

灵芝作为一种药用植物，具有广泛的市场需求，市场中以灵芝为原料的相关产品存在以假乱真、以次充好的现象，尤其是网购产品，由于监管不到位，质量良莠不齐。灵芝酸A理化性质稳定，本发明采用的方法可以对各类灵芝加工产品中灵芝酸A进行便捷、快速的定量检测，包括灵芝粉制剂、颗粒制剂、干片制剂以及添加灵芝成分的中成药。通过广泛抽样检测，测定结果具有较高的准确率和灵敏度，尤其在含有多种药用植物的中成药中，通过样品处理，其它成分对灵芝酸A测定结果的干扰在可控范围，微量灵芝原料的存在即可实现灵芝酸A定量检测。

本发明反应为间接竞争酶联免疫吸附法，第一步通过竞争机制，使试样中灵芝酸A，与包被于微量反应板中的灵芝酸A偶联蛋白特异性竞争抗灵芝酸A抗体；第二步引入酶标记物，通过酶标记物与结合在灵芝酸A偶联蛋白上的抗体发生反应。加入酶底物后显色，试样中灵芝酸A的含量与颜色呈反比，用酶标仪测定吸光度值后，通过与灵芝酸A标准标准溶液比较判断试样中灵芝酸A的含量。本发明所开发的间接ELISA检测灵芝酸的方法高效快速，且灵敏度高，其最低检测限为0.08ng/mL，最低定量限为0.25ng/mL，是Sakamoto建立的ELISA检测方法的20多倍，是LC/MS/MS方法的2倍，本发明能够为灵芝作为原料的产品中灵芝酸A含量调控和产品质量监控提供一种快速的标准检测方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为相对吸光度值与灵芝酸A标准溶液浓度的关系曲线；

图2为本发明方法与高效液相色谱法对样品中灵芝酸A测定结果的对比(Gp1、Gp2、Gp3样品为赤灵芝整枝干品，Bf1、Bf2、Bf3样品为灵芝孢子粉，Zc2、Zc3、Zc4样品为中成药)。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本发明实施例1公开了一种灵芝酸A待测试样液的制备方法，采用的技术方案如下：

1、本发明方法可以对灵芝加工后的粉制剂、颗粒制剂、干片制剂、灵芝整枝以及添加灵芝成分的中成药进行检测，因待检材料不同，前处理方式存在差异。

2、如果样品为粉制剂，可以直接过10目筛，如果样品是颗粒制剂、干片制剂、灵芝整枝以及添加灵芝成分的中成药颗粒，则将样品用粉碎机粉碎处理。对粉碎机型号及处理方式没有特殊要求，样品粉碎程度达到九成左右即可，粉碎完成后过10目筛，取筛下物。

3、精确称量5g筛下物，精确度为0.01g，置入100mL具塞三角瓶中，加入无水乙醇25mL，加塞振荡1min，浸泡24h，再加塞振荡1min，采用中速定量分析滤纸过滤后得到试样液，试样液稀释倍数为1：5(样品重量：溶液体积)。

4、制成待测试样液后，不能直接用于测定，需要用0.01mol/L磷酸盐缓冲液进一步稀释。根据表1中的要求，不同待测样品的最终稀释倍数在1：10

表1不同待测样品的稀释倍数

在本实施例中，试样处理得到试样液的方式能够让样品中灵芝酸A最大程度地溶解到试样液中。试样液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液进一步稀释到1：10

实施例2：

本发明实施例2公开了一种通过酶联免疫吸附法测定灵芝酸A的操作方法，采用的技术方案如下：

1、将灵芝酸A与鸡卵清蛋白的偶联物用pH 9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释为20μg/mL的包被液，包被酶标板各孔，每孔100μL，4℃温度下反应24h。反应完成后，甩干孔中反应液，每孔加250μL洗涤液，洗涤液为含0.06％吐温20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，1min后甩干洗液，此过程为1次洗板操作，共计洗板3次。

2、将制备标准曲线的0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L等6个梯度浓度的灵芝酸A标准溶液及待测试样稀释液分别加入酶标板各对应孔中，每孔50μL，通常前6孔作为标准溶液孔，其它孔作为检测孔，标准孔与检测孔均做2个重复孔。将兔抗灵芝酸A抗体IgG(本实施例中抗体IgG通过灵芝酸A与牛血清白蛋白的偶联物免疫日本大耳白试验兔制备)用样品稀释液(样品稀释液为含0.06％吐温20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液)稀释为效价值为1：20的IgG溶液，再向每孔中分别加入IgG溶液50μL，在振荡器上混匀，置入恒温培养箱中，37℃温度下反应30min。

3、反应结束后从培养箱中取出酶标板，甩干反应液，洗板4次，洗涤过程同本实施例步骤1中所述。将工作效价值为1：500-1：2000过氧化物酶标记的羊抗兔IgG溶液用样品稀释液做1：1000稀释(酶标羊抗兔IgG溶液体积：稀释液体积)，洗板结束后，向每孔中加入稀释后的酶标羊抗兔IgG溶液100μL，在振荡器上混匀，置入恒温培养箱中，37℃温度下反应30min。

4、反应结束后从培养箱中取出酶标板，甩干反应液，洗板5次，洗涤过程同本实施例1中所述。洗板结束后，向每孔中均加入50μL底物B液和50μL底物A液，底物B液为含0.05mg/ml过氧化氢尿素的0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，底物A液为0.2mg/ml四甲基联苯胺溶液，摇匀，置入恒温培养箱中，37℃温度下反应15min。

5、向酶标板中的每孔加入50μL硫酸溶液终止反应，硫酸溶液浓度为1mol/L。反应终止后10min内，将酶标板置于酶标测定仪上，在450nm处测定标准浓度孔及试样孔吸光度值。

在本实施例中，采用灵芝酸A与鸡卵清蛋白的偶联物包被酶标板，采用灵芝酸A与牛血清白蛋白偶联物制备的抗体IgG进行竞争反应，采用不同载体蛋白制备偶联物，其有益效果是可以有效排除竞争抗体IgG针对载体蛋白的交叉反应，降低背景色，提高检测灵敏度。本实施例中的包被浓度为20μg/mL，该浓度是优选出来的最佳浓度，是能够有效呈现试验结果的最低包被浓度。在本实施例中，竞争抗体及酶标记抗体使用剂量都是以效价值为基础，非传统的浓度表述，其原因在于随着保持时间的延长，抗体活性下降，原有的表述浓度不能够重复试验结果，效价值大小是抗体活性的体现，只要到达表述的效价值，就能够重复试验结果，因而以效价值表述抗体使用剂量具有明显的有益效果。在本发明中，竞争抗体的使用剂量是效价值为1：20的IgG溶液，该剂量的抗体在反应中能够得到最佳的竞争效果。在本实施例中，制备标准曲线采用0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L等6个梯度浓度的灵芝酸A标准溶液，其有益效果是该浓度范围经过多次重复试验证实是灵芝酸A溶液浓度与吸光度值之间剂量反应关系的最佳线性范围。

实施例3：

本发明实施例3公开了一种通过酶联免疫吸附法测定灵芝酸A环节中标准曲线制备及待测试样定量的方法，采用的技术方案如下：

1、分别计算0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L等梯度浓度灵芝酸A标准溶液及待测试样稀释液重复孔的平均吸光度值，不同浓度标准溶液及待测试样稀释液的平均吸光度值分别除以0μg/L标准溶液的平均吸光度值，得到相对吸光度值A/A

2、以灵芝酸A标准溶液浓度为横坐标，百分相对吸光度值为纵坐标，根据1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L等5个浓度灵芝酸A标准溶液的百分相对吸光度值结果，在坐标上绘制百分相对吸光度值与灵芝酸A标准溶液浓度关系的标准曲线，见图1。进一步进行曲线拟合并得到回归方程和R

3、试样稀释液根据百分相对吸光度值和回归方程计算出试样稀释液中灵芝酸A的浓度，按式(1)计算出待测试样中灵芝酸A的含量X，单位为μg/kg。

其中，式中：

ρ为根据回归方程计算出的试样稀释液中灵芝酸A浓度，单位为μg/L；

v——试样液体积，单位为L；

n——试样液稀释倍数；

m——试样的质量，单位为kg。

4、以下是本实施例中对一些不同来源样品的测定结果，样品中有不同产地的赤灵芝整枝干品，结果见表2；不同品牌的灵芝孢子粉，结果见表3；以及不同配方的添加灵芝成分的中成药，结果见表4。可以看出，本发明的方法能够对多种样品中灵芝酸A含量进行定量测定，由测定结果还可见，不同整枝赤灵芝样品中灵芝酸A含量的变化幅度较小，不同加工产品中灵芝酸A含量的变化幅度则相对较大。

表2不同产地7种赤灵芝整枝中灵芝酸A含量的测定结果

表3不同品牌6种灵芝孢子粉中灵芝酸A含量的测定结果

表4不同配方7种中成药中灵芝酸A含量的测定结果

为了验证本发明测定方法的准确性，从表2、表3、表4的样品中各取3种，采用高效液相色谱法进行测定并与本发明方法的测定结果进行对比分析，结果见图2，由图2可见两种方法的测定结果具有高度的相关性，通过数据分析计算两种方法测定结果的相关系数，r＝0.9968。在本实施例中，完成了百分相对吸光度值与灵芝酸A标准溶液浓度关系的标准曲线的制备，曲线符合对数关系，拟合后回归方程的R2＝0.982，说明有较高的拟合度。在本实施例中，还完成了不同来源样品的定量测定，本方法测定结果与高效液相色谱法测定结果的相关系数r＝0.9968，说明本发明的灵芝酸A测定方法具有较高的准确性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。