一种鉴定软骨组织中细胞种类的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定软骨组织中细胞种类的方法，属于生物技术、涉及动物组织与细胞工程等领域。

背景技术

骨关节炎是以关节软骨退化、软骨下骨硬化，骨赘形成并伴有关节疼痛、肿胀、畸形及活动障碍的慢性退行性关节病，且多发于膝、髓等负重关节叫。据统计全世界骨关节炎患病率约为15％，其中50岁以上老年人群的发病率达到50％，最终致残率高达53％。我国流行病调查研究发现我国40岁以上人群膝、手、颈、腰关节炎的总患病率则高达46.3％。关节功能的丧失及致残不仅严重影响老年人群的生活质量还加重家庭和社会的经济负担，有效预防该病已成为国内外重大的公共卫生问题。

骨关节炎发病与衰老软骨细胞的累积导致的软骨细胞外基质合成降解平衡失调，关节软骨组织的分解退变，关节内持续病理性炎症状态密切相关。临床骨关节炎患者的关节软骨细胞常会出现衰老现象，且该现象随着关节软骨组织退变的严重程度越发明显。软骨细胞衰老在骨关节炎的发生发展过程中起着重要作用，因此延缓或清除衰老软骨细胞有可能抑制骨关节炎的炎性反应，保护关节软骨组织的完整性，改善骨关节炎的病理变化，缓解骨关节炎患者的疼痛。

因此，若能不断发现骨关节炎软骨组织中包含的各种细胞亚群以及各种细胞的特异性标记分子，从分子水平探讨骨关节炎与软骨组织中细胞之间的相互作用，可为深刻揭示骨关节炎发病的机制提供更有效的科学依据，同时也能为临床治疗骨关节炎提供新思路和新方法。

我们利用单细胞测序技术在软骨细胞的单细胞水平上对全转录组进行扩增与测序，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律，最后利用生物信息学分析技术，从mRNA水平上分析寻找软骨组织中细胞亚群的特异性标记分子，为骨关节炎的靶向治疗提供新靶点。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种鉴定软骨组织中细胞种类的方法。

本发明的目的是这样实现的，一种鉴定软骨组织中细胞种类的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)消毒，用75％酒精擦拭患者膝关节进行消毒；

(2)取样，在手术台中取出关节软骨，PBS清洗三遍，剪碎并用胶原酶消化后，用移液枪轻轻吹匀，制备成单细胞悬液；

(3)单细胞测序仪器进行上机建库；将单细胞悬液加入单细胞测序仪器的上样孔中，开机后单细胞悬液中每个细胞和微粒一起在仪器中会被单个油滴包裹，微粒上面有扩增所需的引物，并且每条引物以及每个油滴都有唯一的标记；随后PCR扩增后进行高通量测序，因此可以单独检测出每个细胞内所有基因的表达量；

(4)对测序数据进行分析；单个细胞的所有mRNA进行高通量测序后，软件分析细胞内所有基因的表达模式，通过降维算法将表达矩阵降低到重要特征值，则有效解决上述问题；为了将基因表达矩阵简化为最重要的特征，Cell Ranger使用主成分分析(PCA)将表达矩阵的维度从Cells×Genes降低到Cell×M(M为选择的主成分数)；为了可视化二维空间中的数据，Cell Ranger将PCA降维后的数据传递到非线性降维方法t-SNE(t-随机邻近嵌入)中；Cell Ranger还支持使用UMAP(统一流形逼近与投影)进行可视化，UMAP估计高维数据的拓扑，并使用此信息来估计低维嵌入，以保留数据中存在的关系；相同类型的细胞一般具有相似的表达谱；因此可以通过表达相似性对细胞进行聚类，从而将各细胞类型的细胞分离成独特的细胞群；Cell Ranger使用Graph-based和K-means两种方法对细胞进行聚类，这两种方法均在PCA空间中进行；Graph-based是基于图的聚类算法，通过构建稀疏邻近的图，然后在图中寻找高度关联的模块；K-means是将数据构建k个子集，然后计算每个类的中心点，向中心点聚集直到聚类结果不再变化为止。

(5)细胞亚群的鉴定；亚群分好后，需要借助标记基因来鉴定，Seurat软件对数据降维聚类分析，并对结果进行可视化展示；但是聚类出来的细胞类型并不清楚，因此需要对细胞进行注释，用于后续分析；SingleR是用于单细胞转录组测序数据对细胞类型自动注释的方法；通过给定的具有已知类型标签的细胞样本作为参考数据集，对测试数据集中与参考集相似的细胞进行标记注释，以鉴别细胞类型。

步骤(3)中，还包括单细胞活性检测，吸取20ul制备好的单细胞悬液，加入0.4％的台盼蓝染色10分钟，显微镜下观察并且统计细胞的活性，活细胞概率需大于80％方可上机检测。

步骤(3)中，上机测序中，单细胞悬液制备好后，加入到微流体装置的单细胞测序仪器的上样孔中，同时上样的还有一种微粒，每个微粒含有超过10的8次方个独立的引物，它们共享相同的“PCR处理”和“细胞条形码”，但具有不同的独特分子标识符(UMI)；细胞条码只在相同微粒的所有引物中相同，但与其他珠子上的细胞条码不同，可以追溯细胞的来源；每个引物上不同的UMI允许mRNA转录物进行数字计数并识别PCR重复；一旦单细胞悬液和微粒准备就绪后，微流体装置将单个细胞与微粒一起封装在油滴中进行反应；随后通过添加试剂来破坏液滴以使油-水界面不稳定，并且收集微粒并洗涤；然后将mRNA在一个反应中一起逆转录成cDNA，然后可以通过PCR反应进行扩增以进行高通量mRNA测序。

本发明方法先进科学，通过本发明，提供了一种鉴定软骨组织中细胞种类的方法，旨在鉴定骨关节炎中软骨组织中所有的细胞种类,从分子水平探讨骨关节炎与软骨组织中细胞之间的相互作用，可为深刻揭示骨关节炎发病的机制提供更有效的科学依据，同时也能为临床治疗骨关节炎提供新思路和新方法。

本发明的优越性在于：

1、本发明可以准确的鉴定软骨组织中细胞的种类，与传统的测序方式不同，单细胞测序可以检测细胞之间的异质性，在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析，在相关研究中具有极高的准确性和可信度。

2、本发明中的鉴定软骨组织中细胞的种类方法也可以应用于其他组织研究中，具有很好的推广应用价值。

附图说明

图1为单细胞测序检测软骨组织中细胞亚群。

图2为注释后的软骨组织中细胞亚群类别。

图3为气泡图展示软骨组织中细胞的标记分子表达情况。

图4为聚类热图示软骨组织中细胞的标记分子表达情况。

具体实施方式

下面结合附图以及附图说明，对本发明做进一步说明。

一种鉴定软骨组织中细胞种类的方法，包括以下步骤：

1.准备软骨组织单细胞样品。分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解。

2.对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国Thermo Fisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA。

3.以cDNA为模板进行扩增，构建测序文库，进行测序，使用美国Illumina公司的Nextera XT试剂盒，按照说明书对得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序。

4.单细胞活性检测：吸取20ul制备好的单细胞悬液，加入0.4％的台盼蓝染色10分钟，显微镜下观察并且统计细胞的活性，活细胞概率需大于80％方可上机检测。

5.上机测序：单细胞悬液制备好后，加入到微流体装置的单细胞测序仪器的上样孔中，同时上样的还有一种微粒，每个微粒含有超过10的8次方个独立的引物，它们共享相同的“PCR处理”和“细胞条形码”，但具有不同的独特分子标识符(UMI)。细胞条码只在相同微粒的所有引物中相同，但与其他珠子上的细胞条码不同，可以追溯细胞的来源。每个引物上不同的UMI允许mRNA转录物进行数字计数并识别PCR重复。一旦单细胞悬液和微粒准备就绪后，微流体装置将单个细胞与微粒一起封装在油滴中进行反应。随后通过添加试剂来破坏液滴以使油-水界面不稳定，并且收集微粒并洗涤。然后将mRNA在一个反应中一起逆转录成cDNA，形成称为“附着于微粒的单细胞转录组”的(STAMP)的一组珠子。然后可以通过PCR反应对带有条形码的STAMP进行扩增以进行高通量mRNA测序，以分析任何期望数量的单个细胞。该装置如附图3所示。

6.数据分析：单个细胞的所有mRNA进行高通量测序后，软件分析细胞内所有基因的表达模式，通过降维算法将表达矩阵降低到重要特征值，则有效解决上述问题；为了将基因表达矩阵简化为最重要的特征，Cell Ranger使用主成分分析(PCA)将表达矩阵的维度从Cells×Genes降低到Cell×M(M为选择的主成分数)；为了可视化二维空间中的数据，CellRanger将PCA降维后的数据传递到非线性降维方法t-SNE(t-随机邻近嵌入)中；CellRanger还支持使用UMAP(统一流形逼近与投影)进行可视化，UMAP估计高维数据的拓扑，并使用此信息来估计低维嵌入，以保留数据中存在的关系；相同类型的细胞一般具有相似的表达谱；因此可以通过表达相似性对细胞进行聚类，从而将各细胞类型的细胞分离成独特的细胞群；Cell Ranger使用Graph-based和K-means两种方法对细胞进行聚类，这两种方法均在PCA空间中进行；Graph-based是基于图的聚类算法，通过构建稀疏邻近的图，然后在图中寻找高度关联的模块；K-means是将数据构建k个子集，然后计算每个类的中心点，向中心点聚集直到聚类结果不再变化为止。

7.细胞亚群的鉴定；亚群分好后，需要借助标记基因来鉴定，Seurat软件对数据降维聚类分析，并对结果进行可视化展示；但是聚类出来的细胞类型并不清楚，因此需要对细胞进行注释，用于后续分析；SingleR是用于单细胞转录组测序数据对细胞类型自动注释的方法；通过给定的具有已知类型标签的细胞样本作为参考数据集，对测试数据集中与参考集相似的细胞进行标记注释，以鉴别细胞类型。