多价肺炎球菌多糖-蛋白缀合的疫苗

文献发布时间：2023-06-19 12:02:28

技术领域

本发明涉及多价肺炎球菌多糖-蛋白缀合的疫苗组合物，其包含与一种或多种载体蛋白缀合的一种或多种肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型的肺炎球菌荚膜多糖。

背景技术

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，“肺炎球菌”)是一种革兰氏阳性细菌，可引起侵袭性疾病，如肺炎、菌血症和脑膜炎，以及与定植有关的疾病，如急性中耳炎(如在中耳中的定植)。这些肺炎球菌引起的疾病导致尤其在小于24个月和大于60岁的人群中的发病率和死亡率。在美国，60岁以上的人患肺炎球菌肺炎的发病率约为每10万人中有3-8人。在20％的病例中，肺炎球菌肺炎导致菌血症和脑膜炎，尽管进行了抗生素治疗，但总的死亡率接近30％。

肺炎球菌疫苗可以用来预防感染。目前的疫苗包括多价肺炎球菌多糖疫苗(包括来自两种或两种以上血清型的肺炎球菌多糖)和肺炎球菌缀合的疫苗。已知肺炎球菌多糖疫苗的保护效力与针对荚膜多糖产生的抗体浓度有关。肺炎球菌细胞被多糖包裹，产生90多种不同的肺炎球菌血清型。荚膜是肺炎球菌的主要毒力决定因子，它不仅保护细胞内表面免受补体介导的细胞溶解，而且免疫原性较差。

默克的

美国专利No.5,360,897公开了肺炎球菌疫苗，其中免疫原性缀合物包含细菌病原体肺炎链球菌的完整荚膜聚合物的还原胺化产物，所述完整荚膜聚合物具有至少两个羰基和细菌毒素或类毒素，所述缀合物包含交联缀合物，其中所述荚膜聚合物与所述毒素或类毒素之间存在直接共价连接。

美国专利No.5,693,326提供一种制备缀合疫苗的通用方法，其中，为了激活病毒、真菌或细菌多糖，使用选自由1-氰基-4-(二甲氨基)-四氟硼酸吡啶、N-氰基三乙基-四氟硼酸铵和对硝基苯氰酸盐组成的组的有机氰基化剂，以形成活化的碳水化合物，随后与蛋白或载体蛋白偶联。

美国专利No.5,854,416公开了肺炎链球菌的37kDa蛋白的氨基酸和DNA序列，称为PsaA(肺炎球菌表面粘附A)。

美国专利No.7,862,823公开了一种包含肺炎球菌荚膜多糖和至少两种不同载体蛋白(例如DT和TT)的多价缀合疫苗组合物。

美国专利No.8,192,746公开了一种15价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，该疫苗组合物具有与CRM

美国专利No.8,557,250B2公开了一种方法，该方法包括将多种氰酸盐活化的免疫原性独特多糖的混合物与至少一种酰肼活化蛋白质接触。

美国专利No.8,808,708和美国专利No.8,603,484描述了由多糖-蛋白缀合物组成的13价免疫原性组合物，其中血清型包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，以及载体蛋白CRM

美国专利公开号2010/0074922A1公开了一种含有10种或10种以上血清型的免疫原性组合物，其中19F荚膜糖与DT缀合，血清型18C荚膜糖与破伤风类毒素缀合，并且血清型1、4、5、6B、7F、9V，14和23F荚膜糖与从流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)分离的蛋白D缀合。

美国专利公开号2010/0239604描述了一种免疫原性组合物，其包含来自血清型19A和19F的多价肺炎链球菌荚膜糖缀合物，其中血清型19A与第一细菌类毒素缀合，19F与第二细菌类毒素缀合，并且肺炎链球菌荚膜的糖类2-9与蛋白质D缀合。

美国专利公开号2012/321658A1公开了一种免疫原性组合物，其中血清型1、3、19A和19F通过还原胺化以外的化学直接或间接地连接到蛋白载体，并且一种或多种不同的糖选自第二组，该第二组由血清型4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C和23F组成，并通过还原胺化与蛋白载体相连。

在140/DEL/2011中提供了一种肺炎链球菌疫苗，其包含(a)7种或更多(b)10种或更多来自血清型的多糖，所述多糖与选自包含DT、白喉类毒素、CRM

WO公开号2013/191459A1公开了一种15价肺炎球菌缀合组合物，其包含不同血清型的肺炎链球菌，所述血清型衍生自与CRM

WO公开号2014/092377A1公开了一种13价肺炎球菌缀合组合物，其中12个血清型选自1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，并且最后一个血清型是与CRM

WO公开号2014/092378A1描述了免疫原性肺炎球菌缀合物组合物，其中12个血清型选自1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，其余一个选自与CRM

WO公开号2016/207905A2公开了一种多价肺炎球菌缀合疫苗(PCV)组合物，其包含：1)选自经CDAP活化且与载体蛋白CRM

本申请人的WO 2018/064444A1描述了一种肺炎球菌疫苗组合物，该组合物包含两种或更多种荚膜肺炎球菌多糖血清型，每种血清型分别与载体蛋白肺炎球菌表面粘附蛋白A(PsaA)或PsaA与CRM

中国专利申请公开号CN 101590224描述了一种14价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗，其含有与CRM

中国专利申请公开号CN 103623401公开了一种14价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合组合物，其中所述14种不同血清型为与CRM

中国专利申请公开号CN 103656631提供了一种多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合组合物及其制备方法。所述缀合组合物由24种不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖和载体蛋白共价连接而成，其中24种不同血清型为与CRM

中国专利申请公开号CN 103656632公开了一种多价肺炎球菌荚膜多糖组合物，其含有血清型6A和至少一种选自与CRM

中国专利申请公开号CN 104069488公开了一种14种不同血清型和载体蛋白的多价肺炎球菌荚膜多糖疫苗，所述14种血清型包括与CRM

Anderson P等人(2003,Vaccine；21(13-14):1554-9)公开了一种四价肺炎球菌缀合疫苗的比较研究，其中每种多糖类型6A、14、19F和23F分别与破伤风类毒素或白喉CRM

Nurkka等人(2004,Ped.Inf.Dis.J.,23:1008-1014)公开了一项关于11价肺炎球菌蛋白D缀合疫苗免疫原性和安全性的研究，其中，在接受三剂疫苗后再增加同一疫苗或肺炎球菌多糖疫苗剂量的婴儿中，未观察到血清型3的启动效应。

上述参考文献在其它组合物、方法等中公开了包含来自一个或多个血清型的多糖的多价肺炎球菌缀合疫苗以及这些多糖与载体蛋白的缀合。鉴于在不同地区流行的不同血清型，需要额外的多价肺炎球菌疫苗，包括具有改善的免疫应答的多糖血清型的新缀合物，以及开发其简单而有效的生产。

令人惊讶的是，本发明的多价肺炎球菌缀合疫苗组合物提供了比原始多价肺炎球菌疫苗和现有肺炎球菌缀合疫苗更好的免疫应答。

本发明提供一种24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合的疫苗组合物，其包含与一种或多种载体蛋白缀合的一种或多种肺炎链球菌血清型。

在另一实施方案中，本发明提供一种肺炎球菌缀合疫苗组合物，其包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述血清型包含1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F，33F和35B。

在又一实施方案中，本发明还提供一种肺炎球菌缀合疫苗组合物，其包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述血清型包含1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B，23F、24F、33F和35B，所述载体蛋白选自CRM

在一个实施方案中，本发明提供一种肺炎球菌缀合疫苗组合物，其包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述血清型包括1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F，所述载体蛋白为CRM

在一个实施方案中，本发明提供一种肺炎球菌缀合疫苗组合物，其包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述血清型包括1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F，33F和35B，所述载体蛋白为PsaA。

在一个实施方案中，本发明提供一种肺炎球菌缀合疫苗组合物，其包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述血清型包括1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F，33F和35B，所述载体蛋白为CRM

在一个实施方案中，本发明提供一种肺炎球菌缀合疫苗组合物，其包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述血清型包括1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F，所述载体蛋白为CRM

附图说明

图1表明(A)血清型3和(B)血清型6B与PsaA缀合反应动力学的SEC-HPLC色谱图。

图2表明(A)血清型6A-CRM

图3表明(A)血清型8-CRM

图4表明(A)血清型10A-CRM

图5表明(A)血清型11A-CRM

图6表明(A)血清型12F-CRM

图7表明(A)血清型15A-CRM

图8表明(A)血清型23A-CRM

图9表明(A)血清型23B-CRM

图10表明(A)血清型24F-CRM

图11表明(A)血清型35B-CRM

图12A：用配方I免疫的家兔的血清抗体滴度。

图12B：用配方II免疫的家兔的血清抗体滴度。

在本发明中，除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一个”包括复数指代。同样，除非“或”一词明确限定为仅指两个或两个以上项目的列表中排除在其他项目之外的单个项目，否则在此类列表中使用“或”应解释为包括(a)列表中的任何单个项目，(b)列表中的所有项目，或(c)列表中项目的任何组合。另外，在本发明中，术语“包括”等用于表示至少包括所述特征，使得不排除任何更多数量的相同特征和/或一个或多个附加类型的特征。本文中对“一个实施方案”或类似形式的引用意味着结合实施例描述的一种组合物、方法或特性可以包括在本技术的至少一个实施例中。因此，本文中的这些短语或形式的出现不一定都指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，可以以任何合适的方式组合各种特定特征、组合物、方法或特性。

本发明并不旨在穷尽或将本技术限制于本文公开的精确形式。尽管本文出于说明目的公开了特定实施方案，但是如相关领域的普通技术人员将认识到的，在不偏离本技术的情况下，各种等效修改是可能的。在一些情况下，未详细示出和/或描述众所周知的结构和功能，以避免不必要地模糊对本技术的实施方案的描述。尽管方法的步骤可在本文中以特定顺序呈现，但在替代实施方案中，这些步骤可具有另一适当顺序。类似地，在特定实施方案的上下文中公开的本技术的某些实施方案可以在其他实施方案中组合或消除。此外，虽然与某些实施方案相关联的优点可以在这些实施方案的上下文中公开，但是其他实施方案也可以展示这些优点，并且并非所有实施方案都需要展示本文公开的这些优点或其他优点以落在本技术的范围内。因此，本发明和相关技术可以包括本文未明确示出和/或描述的其他实施方案。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管任何免疫原性组合物、疫苗组合物或类似于或等效于本文所述的那些的方法也可用于本发明实施方案的实践或测试中，但现在描述了代表性说明性方法和组合物。

在提供值的范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该所述范围内的任何其他所述或中间值都包含在方法和组合物中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也由所述方法和组合物包含在所述范围中，受制于所述范围中的任何具体排除的限制。如果所述范围包括一个或两个限值，则不包括其中一个或两个限值的范围也包括在所述方法、组合物和组合中。

如本文所用，术语“荚膜多糖”指在血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B的肺炎链球菌的细胞壁外部但与其相连的一层多糖。

本文所使用的术语“定尺寸的”是指通过各种方法减小天然多糖的尺寸。这些方法可以包括机械方法，例如均匀化。减小天然多糖的尺寸或“定尺寸的”提供各种优点，包括：(1)与天然多糖相比赋予高免疫原性(2)可改变缀合物中多糖与蛋白的比率(3)定尺寸的多糖可提供更大的组合物稳定性。

本文所使用的术语多糖的“分子量”或“分子大小”或“平均分子大小”或“平均分子量”是指通过MALLS(多角度激光光散射)测量的多糖的重量平均分子量(Mw)。

如本文所用，术语“免疫原性组合物”和“疫苗组合物”可互换使用。

如本文所使用的，术语“载体蛋白”是指与半抗原(弱抗原)偶联、附着或缀合的任何蛋白质或其片段，通常是为了增强或促进免疫系统对抗原的检测。载体蛋白的实例包括但不限于CRM

本文所用术语“缀合的”用于表示肺炎链球菌荚膜多糖共价结合到载体蛋白。

如本文所用，术语“佐剂”是指疫苗的非抗原成分，其通过影响针对抗原产生的免疫应答的类型和质量来促进抗原与免疫系统之间的接触，从而增强疫苗抗原的免疫应答。所述佐剂引起针对所述抗原的长时间免疫应答，并且还可用于降低某些抗原的毒性或提供对某些抗原的溶解性。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可添加到疫苗制剂中用于施用抗原和/或病毒的一个或多个可选组分，其本身不会诱导产生对接受所述组合物的个体有害的抗体，并且施用时不会产生过度毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。该术语包括一种或多种赋形剂、稳定剂、稀释剂、缓冲剂或表面活性剂、冻干赋形剂或其组合。所述药学上可接受或药理学上可接受是指在生物学上或其它方面不需要的材料，即可将该材料以制剂或组合物施用于个体，而不会引起任何不良生物效应或以有害方式与含有该材料的组合物的任何组分相互作用。

本发明提供一种24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，其包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自24种不同血清型肺炎链球菌的多糖。

在一个实施方案中，本发明还提供一种肺炎球菌缀合疫苗组合物，其包含与载体蛋白缀合的来自24种不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖，其中所述血清型包括1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F，33F和35B，其中载体蛋白选自CRM

在一个实施方案中，本发明提供一种24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，所述组合物选自肺炎链球菌1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B的血清型，其中至少13个血清型与CRM

在优选实施方案中，本发明提供一种24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，其包含来自肺炎链球菌1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B血清型的荚膜多糖，其中1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、33F血清型荚膜多糖与CRM

在一个实施方案中，本发明提供一种24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，其包含与CRM

在一个实施方案中，本发明提供一种24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，其包含与PsaA载体蛋白缀合、来自不同的选自肺炎链球菌1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B血清型的荚膜多糖。

在优选实施方案中，本发明提供一种24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，其包含来自肺炎链球菌1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B血清型的荚膜多糖，其中来自血清型3、6A、8、10A、11A、12F、15A、23A、23B、24F和35B的荚膜多糖与PsaA缀合，来自1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F血清型的荚膜多糖与CRM

在一个实施方案中，本发明提供一种包含肺炎球菌多糖的肺炎球菌疫苗组合物，其中一个或多个肺炎球菌多糖为天然肺炎球菌多糖。

在另一实施方案中，本发明提供包含肺炎球菌多糖的肺炎球菌疫苗组合物，其中一个或多个肺炎球菌多糖为片段化的，每个片段化的肺炎球菌多糖的平均分子量小于天然肺炎球菌多糖的平均分子量，并且可以在50-1000kDa范围内。

在又一实施方案中，本发明提供从肺炎链球菌1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B血清型中分离和纯化的荚膜多糖，其中每种多糖的分子量在约50至1000kDa之间，优选地，其平均分子量(Mw)在100-1000、200-800、250-600或300-400、70-150或75-125kDa之间。

在其它实施方案中，本发明提供肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，其包含来自24种不同肺炎链球菌1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B血清型的多糖，其与选自CRM

在又一较佳实施方案中，本发明提供一种24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，其包含肺炎链球菌1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B血清型的每种荚膜多糖，其中每种约2.2-2.4μg，以及约4.4μg的6B，其中来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的每种荚膜多糖与约30-35μg的CRM

在又一较佳实施方案中，本发明提供一种24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，其包含肺炎链球菌1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B血清型的每种荚膜多糖，其中每种荚膜多糖约2.2-2.4μg，以及约4.4μg的6B，其中每种荚膜多糖与约40-80μg的PsaA缀合。

在另一方面，本发明提供一种分离的肺炎链球菌血清型15A，其平均分子量在50-1000kDa之间，且甘油含量在5-18％范围内。

用氢氟酸(HF)处理多糖释放甘油后，用高效阴离子交换色谱脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定甘油磷酸侧链的存在。

在另一方面，本发明提供分离的肺炎链球菌血清型35B荚膜多糖，其平均分子量在50-1000kDa之间，且醋酸盐含量在2-10％，优选2-8％的范围。

在另一实施方案中，本发明提供包含肺炎球菌多糖的肺炎球菌缀合疫苗组合物，其中每种肺炎球菌多糖在与载体蛋白缀合之前使用1-氰基-4-二甲氨基-四氟硼酸吡啶(CDAP)活化以形成氰酸酯。

在另一实施方案中，本发明提供包含肺炎球菌多糖的肺炎球菌缀合疫苗组合物，其中一个或多个肺炎球菌多糖直接偶联到载体蛋白的氨基或通过间隔基偶联到氨基。

在另一实施方案中，本发明提供包含肺炎球菌多糖的肺炎球菌缀合疫苗组合物，其中间隔基为胱胺、半胱胺、己二胺、己二酸二酰肼(ADH)、EDAC或EDC。

根据本发明的PsaA载体蛋白为经修饰的PsaA并且不包括野生型疏水性N末端先导肽。

本发明提供一种肺炎球菌缀合疫苗组合物，其包含一种或多种血清型肺炎球菌多糖和载体蛋白，其中PsaA载体蛋白包含290个氨基酸。

肺炎球菌缀合疫苗组合物包含荚膜肺炎球菌多糖血清型，每个血清型单独缀合到载体蛋白，本文称为多糖-蛋白缀合物和/或缀合物。当其包含在本文所述肺炎球菌疫苗组合物中时，为多价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗(本文也称为多价缀合疫苗、缀合疫苗和/或多糖-蛋白缀合疫苗)。除了多价缀合疫苗之外，本发明还提供了一种制备和/或向有需要的受试者施用所述多价缀合疫苗的方法。

载体蛋白是一种无毒、无反应的蛋白，其具有足够的量和纯度。在一些实施方案中，本发明提供一种肺炎球菌缀合疫苗组合物，其包含一种或多种与一种或多种肺炎链球菌多糖(在本文中也称为“肺炎球菌多糖”)缀合的载体蛋白。通过将肺炎球菌多糖与载体蛋白缀合，肺炎球菌多糖比未缀合的肺炎球菌多糖具有更高的免疫原性。

在本发明的一些实施方案中，所使用的载体蛋白的组合包括两种或多种载体蛋白，例如PsaA、CRM

在另一实施方案中，本发明的肺炎球菌多糖-蛋白缀合组合物进一步包含以下一种或多种：药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂、缓冲液、防腐剂、稳定剂、佐剂、表面活性剂、溶剂和/或冻干赋形剂。合适的缓冲剂包括但不限于Tris(氨基丁酰醇)、磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸和琥珀酸盐等。合适的表面活性剂包括但不限于聚山梨酯-20、聚山梨酯-40、聚山梨酯-60(吐温60)、聚山梨酯-80(吐温80)、环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或氧化丁烯(B0)的共聚物、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407、辛醇、山梨醇酐三油酸酯(Span85)，以及山梨醇酐单月桂酸酯等，其浓度为约0.001％至约2％。

本发明的组合物配制于pH为5.0-8.0的缓冲盐水溶液。

在一些实施方案中，肺炎球菌多糖可根据常规方法从一种或多种微生物(例如肺炎链球菌)中提取。例如，肺炎球菌多糖可根据已知程序制备。此外，肺炎球菌多糖的纯化可根据PCT出版物WO 2016/174683 A1中所述的步骤进行。

提取的肺炎球菌多糖可根据常规方法纯化，并可以其天然形式使用。在其他实施方案中，提取和纯化的肺炎球菌多糖可被粉碎以获得肺炎球菌多糖的一个或多个部分，肺炎球菌多糖的每一部分的平均分子量小于提取和纯化的肺炎球菌多糖的平均分子量。

在其他实施方案中，提取和纯化的肺炎球菌多糖可在与一个或多个载体蛋白缀合之前被活化。例如，提取和纯化的肺炎球菌多糖可可在与一个或多个载体蛋白缀合之前被活化(例如，以化学方法)。每个活化的肺炎球菌多糖可各自单独地与形成多糖-蛋白缀合物(例如，糖缀合物)的载体蛋白缀合。在其它实施方案中，一个或多个活化的肺炎球菌多糖可与单个载体蛋白缀合。所述缀合物可通过已知技术制备。

在一些实施方案中，肺炎球菌多糖可经化学活化并随后根据已知技术(例如美国专利4365170、4673574和4902506中所述的技术)缀合到载体蛋白。例如，肺炎球菌多糖可通过使用氧化剂例如高碘酸盐(例如高碘酸钠、高碘酸钾、或高碘酸)将末端羟基氧化为醛来活化，具体通过随机氧化裂解糖类的一个或多个邻羟基和形成一个或多个活性醛基。

肺炎球菌多糖也可经CDAP(1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐)活化，并且随后与一种或多种载体蛋白(例如PsaA、CRM

与本发明的多糖-蛋白缀合物和疫苗组合物一起使用的其他合适的活化和/或偶联技术包括使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、去甲硼烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU，以及PCT出版物WO 98/42721中描述的其他方法。例如，组合物可涉及羰基连接子，其可由糖的游离羟基与CDI反应形成(参见Bethell等人1979,J.Biol.Chem.254:2572-4；Hearn等人,1981,J.Chromatogr.218:509-18)，然后与蛋白偶联形成氨基甲酸酯键。在一些实施方案中，异位末端可还原为伯羟基、伯羟基的可选保护/脱保护、伯羟基与CDI的反应以形成CDI氨基甲酸酯中间体并将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上的氨基偶联。

例如，与本发明的多糖-蛋白组合物和疫苗组合物一起使用的另一合适活化和/或偶联技术包括以下方法：定尺寸的肺炎球菌多糖(例如，浓度约为10mg/mL的约6mL定尺寸的多糖)和CDAP(例如约100mg/mL的乙腈(w/v))可在玻璃瓶中以约1:1的比例混合(例如，通过搅拌约1分钟)。可根据需要调节多糖溶液的pH值(例如，使用约0.2M三乙胺将其调节至约9.25，并在室温下搅拌3分钟)。此外，可将PsaA(例如，约4mL浓度约为15mg/mL的溶液)缓慢添加至活化肺炎球菌多糖(例如，以约1:1(Ps:载体蛋白)的比例)。可调节反应的pH值(例如，使用0.2M三甲胺调节至约9.05)，并可继续反应(例如，通过在室温下搅拌5小时)。反应混合物可经淬火(例如，通过添加过量浓度的甘氨酸)。

在一些实施方案中，可使用膜(例如，100K的MWCO膜)对反应混合物进行二次过滤，并可通过尺寸排除色谱法纯化。超滤和纯化的级分可使用SEC-MALLS和蒽酮法进行分析。所分析的含有缀合物的级分可合并并无菌过滤(例如，使用0.2μm过滤器)。

在肺炎球菌多糖与一种或多种载体蛋白缀合后，可通过多种技术纯化多糖-蛋白缀合物(例如，关于多糖-蛋白缀合物的量的富集)。这些技术包括但不限于浓缩/渗滤操作、沉淀/洗脱、柱层析和深度过滤。例如，在纯化缀合物之后，可将缀合物复合以形成本发明的肺炎球菌多糖-蛋白缀合组合物，其可用作疫苗。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于制备本文所述肺炎球菌疫苗组合物的多糖-蛋白组合物的方法，其中所述方法还包括将所述多糖-蛋白组合物配制成包括佐剂、赋形剂和缓冲液的肺炎球菌疫苗组合物。

在一些实施方案中，本发明提供制备本文所述肺炎球菌疫苗组合物的多糖-蛋白缀合物的方法，其中佐剂为磷酸铝。

在一些实施方案中，本发明提供一种预防或治疗有需要的受试者的方法，包括向有需要的受试者施用本文所述肺炎球菌疫苗组合物。

在一些实施方案中，受试者具有由肺炎链球菌介导的疾病，例如侵袭性肺炎球菌病(IPD)。

在一个实施方案中，受试者为人类，例如婴儿(小于约1岁)、幼儿(约12个月至约24个月大)、儿童(约2岁至约5岁)、大龄儿童(约5岁至约13岁)、青少年(约13岁至约18岁)，成年人(约18岁至65岁)或老年人(约65岁以上)。

在一些实施方案中，本发明提供诱导免疫应答的方法，包括向受试者施用免疫上有效量的本文所述肺炎球菌缀合疫苗组合物。

在一个实施方案中，诱导免疫应答的方法包括向受试者全身、皮下和/或粘膜施用本文所述肺炎球菌缀合疫苗组合物。

在一些实施方案中，本发明疫苗组合物剂量中的每种缀合物的量为足以诱导免疫保护反应的量，例如无显著不良反应的免疫保护反应。尽管每种缀合物的量可根据肺炎球菌血清型而变化，但每剂量疫苗组合物可包含约0.1μg至约50μg每种肺炎球菌多糖，约0.1μg至约10μg、或约1μg至约5μg的每种肺炎球菌多糖，其与包含约1.5μg到约5μg的载体蛋白的每种载体蛋白缀合。

在另一实施方案中，本发明提供包含肺炎球菌多糖和载体蛋白的肺炎球菌缀合疫苗组合物，其具有约0.3的蛋白比多糖(蛋白/PS)至约2.0的蛋白/PS的百分比比率，优选为0.5-1.5。

在一些实施方案中，接合前的纯化多糖具有10kDa-2000kDa之间的分子量。在其它此类实施方案中，多糖具有50kDa-2000kDa之间；50kDa到2000kDa之间；在50kDa-1750kDa之间；在50kDa-1500kDa之间；50kDa-1250kDa之间；50kDa-1000kDa之间；50kDa-750kDa之间；50kDa-500kDa之间；100kDa-2000kDa之间；100kDa-2000kDa之间；100kDa-1750kDa之间；在100kDa-1500kDa之间；在100kDa-1250kDa之间；在100kDa-1000kDa之间；在100kDa-750kDa之间；在100kDa-500kDa之间的分子量。

在其它实施方案中，本发明提供肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物，其包含一种或多种多糖-蛋白缀合物，其分子量在约1000kDa至约10000kDa、约1500kDa至约15000kDa、约2000kDa至约20000kDa、约2500kDa至约25000kDa，或约3000kDa至约30000kDa之间。

本发明的肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物可使用已知方法制备。例如，肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物可以用药学上可接受的稀释剂或载体(例如水或盐溶液)配制。此外，肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物可进一步包括以下一种或多种：缓冲剂、防腐剂或稳定剂、聚山梨酯、如铝化合物(例如氢氧化铝、磷酸铝或羟基磷酸铝)的佐剂，和/或冻干辅料。在本发明的肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗组合物中包含上述化合物中的任何一种可作为对有需要的受试者的给药方式和途径的功能而选择，并且可进一步基于标准医药实践。

在又一优选实施方案中，本发明提供一种24价免疫原性组合物，其包含分别与CRM

在又一优选实施方案中，本发明提供一种24价免疫原性组合物，其包含与CRM

在又一优选实施方案中，本发明提供一种24价免疫原性组合物，其包含分别与PsaA缀合的来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、14、18C、19A、19F、23F、11A、12F、15A、22F、23A、23B、24F、33F和35B的肺炎球菌荚膜多糖，其中，所述组合物的pH值为4至7，并且包含：约4.4μg/0.5mL的6B；约2.2-4μg/0.5mL的所有其他多糖；约40-80μg/0.5mL的PsaA；0.2-2mg/0.5mL的磷酸铝；约1-10mM的琥珀酸缓冲液；约0.5-25％的氯化钠；0.002-0.2％聚山梨酯80；以及4mg/mL和10mg/0.5mL的2-苯氧基乙醇。

在一些实施方案中，本发明提供一种制备24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合组合物的方法，所述组合物包含选自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、14、18C、19A、19F、23F、11A、12F、15A、22F、23A、23B、24F、33F和35B的肺炎球菌多糖，其中所述载体蛋白为CRM

(a)将24种活化的肺炎球菌多糖分别与CRM

(b)使用尺寸排除色谱法过滤和纯化缀合物，

(c)使用SEC-MALLS分析纯化的级分，汇集包含每一种24种缀合物中的级分，并且过滤消毒单价缀合物级分，以及

(d)配制步骤(c)中获得的24种缀合物、佐剂、一种或多种赋形剂和缓冲液以制备24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供一种制备24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合组合物的方法，所述组合物包含选自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B的肺炎球菌多糖，其中来自血清型3、6A、8、10A、11A、12F、15A、23A、23B、24F和35B的荚膜多糖与PsaA缀合，来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的荚膜多糖与CRM

(a)分别将血清型3、6A、8、10A、11A、12F、15A、23A、23B、24F和35B的多糖与PsaA缀合，并将血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的荚膜多糖与CRM

(b)使用尺寸排除色谱法过滤和纯化缀合物，

(c)使用SEC-MALLS分析纯化的级分，汇集包含每一种24种缀合物中的级分，并且过滤消毒单价缀合物的级分，以及

(d)配制步骤(a)中获得的24种缀合物、佐剂、一种或多种赋形剂和缓冲液以制备成24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合组合物。

在一些实施方案中，可过滤(例如，无菌地)24价肺炎球菌多糖-蛋白缀合组合物。

在一个实施方案中，利用CDAP活化肺炎球菌多糖。在另一实施例中，所使用的佐剂为磷酸铝。

24价的每种缀合物可作为混合物单独或共同吸附到铝盐上，例如氢氧化铝、磷酸铝等或氢氧化铝和磷酸铝的混合物。吸附剂可原位制备或在制造过程中添加。24价缀合物的制备可通过将每种缀合物依次添加到器皿或容器中进行，或通过制备含有CRM

本发明的组合物可配制成单位剂量(例如，单位剂量小瓶)、多剂量(例如，多剂量小瓶)或预填充注射器。本发明的组合物可进一步包含选自硫柳汞、2-苯氧基乙醇等的一种或多种防腐剂，其量可在约4mg/mL至约20mg/mL范围内。

在一些实施方案中，本发明还提供免疫原性组合物(例如疫苗)，例如肺炎球菌多糖-蛋白缀合组合物，以单剂量施用约0.5mL，配制成至少含有以下物质：约2.2-4.4μg两种或两种以上肺炎球菌多糖血清型，约1μg至约10μg每PsaA血清型，约2μg至约5μg每种CRM

本发明的组合物可通过疫苗领域中使用的任何数量的常规途径施用需要该组合物的受试者。例如，本发明的组合物可全身施用，例如经肠外(例如皮下、肌肉内、皮内和/或静脉内)或经粘膜(例如经口和/或经鼻)施用。

在一些实施方案中，本发明还提供在有需要的个体中诱导对与一种或多种载体蛋白缀合的一种或多种肺炎链球菌荚膜多糖的免疫应答的方法。诱导免疫应答的方法包括向需要的受试者施用免疫上有效量的本文所述组合物。

根据本发明的方法，本文所述组合物所针对的对象为人类，例如婴儿(小于约1岁)、幼儿(约12个月至约24个月大)、儿童(约2岁至约5岁)、大龄儿童(约5岁至约13岁)，青少年(约13岁至约18岁)、成年人(约18岁至约65岁)或老年人(约65岁以上)。

如本文所用，本发明所述组合物的“有效量”是指在施用该组合物的受试者中诱导免疫应答所需的量。免疫反应的特征是在宿主中存在一种或多种肺炎链球菌抗原特异性抗体，其在随后的激发期间显著降低肺炎链球菌感染的可能性或严重性。

具体实施方式

提供以下实施例以说明本发明，并且仅用于说明目的，不应被解释为限制本发明的范围。

肺炎球菌血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的肺炎球菌荚膜多糖-CRM

按照下述步骤制备用于肺炎球菌血清型6A、8、10A、11A、12F、15A、23A、23B、24F和35B的多糖CRM

a)肺炎球菌多糖血清型6A与CRM

将1000mg(浓度为14.6mg/mL的68.5mL)机械磨碎的多糖血清型6A和5.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0：0.5(PS：CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1分钟。用8.0mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将1000mg的CRM

用1.0mL的0.2M三乙胺将反应的pH调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图2的A)。

反应混合物用100kDa的MWCO TFF膜进行超滤(diafiltered)和浓缩。浓缩物用尺寸排阻色谱法纯化。采用SEC-MALLS法、蒽酮法对各组分进行分析，并将含有缀合物的级分混合，用0.2μm无菌过滤器过滤。

b)肺炎球菌多糖血清型8与CRM

将1000mg(浓度为5.0mg/mL的200.0mL)机械磨碎的多糖血清型8和4.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0：0.4(PS：CDAP)的比例混合于玻璃瓶中搅拌1分钟。用7.7mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将800mg的CRM

用1.5mL的0.2M三乙胺将反应的pH调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图3的A)。

反应混合物用100kDa的MWCO TFF膜进行重滤和浓缩。浓缩物用尺寸排阻色谱法纯化。采用SEC-MALLS法、蒽酮法对各组分进行分析，并将含有缀合物的级分混合，用0.2μm无菌过滤器过滤。

c)肺炎球菌多糖血清型10A与CRM

将1000mg(142.8mL，浓度为7.0mg/mL)机械磨碎的10A型多糖和8.0mL CDAP(100mg/mL，乙腈(w/v))以1.0：0.8(PS：CDAP)的比例混合于玻璃瓶中，搅拌1min。用13.0mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，室温下(RT)搅拌1分钟。将900mg的CRM

用2.5mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图4的A)。

反应混合物用100kDa的MWCO TFF膜进行超滤和浓缩。浓缩物用尺寸排阻色谱法纯化。采用SEC-MALLS法、蒽酮法对各组分进行分析，并将含有缀合物的级分混合，用0.2μm无菌过滤器过滤。

d)肺炎球菌多糖血清型11A与CRM

将1000mg(125.0mL，浓度为8.0mg/mL)机械磨碎的多糖血清型11A和5.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0：0.5(PS：CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1分钟。用10.0mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将1000mg的CRM

用2.5mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图5的A)。

e)肺炎球菌多糖血清型12F与CRM

将1000mg(浓度为10.0mg/mL，100.0mL)机械磨碎的多糖血清型12F和5.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0：0.5(PS：CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1分钟。用10.6mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将800mg的CRM

用1.0mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图6的A)。

f)肺炎球菌多糖血清型15A与CRM

将1000mg(浓度为15.0mg/mL的66.7mL)机械磨碎的多糖血清型15A和10.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0：1.0(PS：CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1分钟。用18.0mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将1000mg的CRM

用1.0mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图7的A)。

反应混合物用100kDa的MWCO TFF膜进行超滤和浓缩。浓缩物用尺寸排阻色谱法纯化。采用SEC-MALLS法、蒽酮法对各组分进行分析，将含有缀合物的级分混合，用0.2μm无菌过滤器过滤。

g)肺炎球菌多糖血清型23A与CRM

将1000mg(浓度为15.0mg/mL的83.3mL)机械磨碎的多糖血清型23A和10.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0：1.0(PS：CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1分钟。用14.9mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将800mg的CRM

用1.7mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，并在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图8的A)。

h)肺炎球菌多糖血清型23B与CRM

将1000mg(10.0mg/mL浓度的100.0mL)机械磨碎的多糖血清型23B和2.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0：0.2(PS：CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1min。用3.5mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0并搅拌1min室温(RT)下分钟。将1000mg的CRM

用2.2mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图9的A)。

i)肺炎球菌多糖血清型24F与CRM

将1000mg(10.0mg/mL浓度的100.0mL)机械磨碎的多糖血清型24F和5.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0：0.5(PS：CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1min。用10.6mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将800mg的CRM

用1.0mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图10的A)。

j)肺炎球菌多糖血清型35B与CRM

将1000mg(10.0mg/mL浓度的100.0mL)机械磨碎的35B型多糖和5.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0:0.5(PS:CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1分钟。用5.0mL0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将1000mg的CRM

用1.6mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图11的A)。

反应混合物用100kDa的MWCO TFF膜进行超滤和浓缩。浓缩物用尺寸排阻色谱法纯化。采用SEC-MALLS法、蒽酮法分析各组分，将含有缀合物的级分混合，用0.2μm无菌过滤器过滤。

A)PsaA准备：

从肺炎链球菌血清型4中PCR扩增PsaA基因，不含其疏水先导肽序列。该基因序列已被证实且利用构建的载体(pBE66)克隆到大肠杆菌中进行高效表达。

编码PSaA基因的甘油原液培养物在含有1mL甘油原液的20mL的LB培养基上于150mL锥形瓶中复苏。培养物在在200转/分的转速下、37℃培养约6小时，最终OD

PsaA纯化过程与Larentis等人2011(Protein expression and Purification 78(2011)38)中描述的过程相似。在DEAE后的通过混合模式色谱(Ceramic HydroxyapatiteType-II)进一步优化纯化，以获得更高纯度的PsaA。

阴离子交换色谱法：用XK16/20柱填充30ml的DEAE-凝胶(GE)树脂。用5柱体积的无菌蒸馏水清洗树脂，然后用10柱体积的20mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0(平衡缓冲液)清洗树脂。用平衡缓冲液将30mL上清液稀释至100mL，并将其装载到柱上并收集流经的液体。柱用5体积的平衡缓冲液洗涤。PsaA用12体积线性梯度的(0-100％B)洗脱。(缓冲液A含有20mMTris、1mM EDTA pH 8.0；缓冲液B-20mM Tris、1mM EDTA、250mM NaCl pH 8.0)，然后用20mMTris、1mM EDTA、1mM NaCl pH 8.0清洗色谱柱。

混合模式色谱法：25mlII型陶瓷羟基磷灰石(CHT-II)填充于柱内。用一定体积的无菌蒸馏水清洗树脂，然后用10体积的20mM Tris pH 6.8清洗树脂。汇集来自DEAE树脂的洗脱片段并装载到CHT-II树脂上，该洗脱片段在SDS-PAGE上显示出约37KD良好浓度PsaA的清晰主要可见带。收集流经液，用5柱体积的平衡缓冲液清洗柱。蛋白用5种柱体积的(15％B、20％B、50％B和100％B)梯度洗脱。缓冲液A含有20mM Tris、pH 6.8，而缓冲液B含有250mM磷酸盐缓冲液、pH 6.8。

将所有显示出预期PsaA大小的干净条带的洗脱级分汇集，用10kDa MWCO盒浓缩，并用pH 7.5的20mM磷酸盐缓冲液超滤。纯化后的蛋白加载在SDS-PAGE凝胶上进行纯度评估。

B)肺炎球菌多糖血清型3与PsaA的活化和缀合

在玻璃瓶中以1:0.5(PS:CDAP)的比例混合血清型3(浓度为5mg/mL)和1.5mL CDAP(100mg/mL存于乙腈(w/v))的尺寸减小的多糖，并搅拌1分钟。用3.5mL 0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将210mg的PsaA(14.0ml，浓度为15.0mg/mL)以1:0.7(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活化多糖中。

用0.7mL的0.2M三乙胺将反应的pH调节至约9.01，并在室温下搅拌反应5小时，随后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图1的A)。

C)肺炎球菌多糖血清型6A与PsaA的活化和缀合

6A型多糖(浓度为14.6mg/mL)和400μL的CDAP(1100mg/mL存于乙腈(w/v))以1:1(PS:CDAP)的比例混合在玻璃瓶中并搅拌1分钟。用800μL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将40mg的PsaA(3.78mL，浓度为11.0mg/mL)以1:1(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活化多糖中。

用0.7mL的0.2M三乙胺将反应的pH调节到约9.01，在室温下搅拌反应5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图2的B)。

D)肺炎球菌多糖血清型6Β与PsaA的活化和缀合。

将尺寸减小的多糖6Β型(浓度为14.97mg/mL)和4.0mL的CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1:2(PS:CDAP)的比例混合在玻璃瓶中并搅拌1分钟。用8.0mL 0.2Μ的三乙胺将多糖溶液的pH值调节至9.1，在室温(RT)下搅拌1分钟。将340mg的PsaA(22.66mL，浓度为15.0mg/mL)以1:1.7(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活化多糖中。

用0.7mL的0.2M三乙胺将反应的pH调节到约9.01，在室温下搅拌反应5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图1的B)。

E)肺炎球菌多糖血清型8与PsaA的活化和缀合。

在玻璃瓶中以1.0:0.4(PS:CDAP)的比例混合1000mg(5.0mg/mL浓度的200.0mL)机械磨碎的多糖血清型8和4.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))，并搅拌1分钟。用8.0ml的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将800mg的PsaA(53.33mL，浓度为15.0mg/mL)以1.0:0.8(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活化多糖中。

用0.1mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图3的B)。

F)肺炎球菌多糖血清型10A与PsaA的活化与缀合。

将1000mg(142.8mL，浓度请问7.0mg/mL)的机械磨碎的多糖血清型10A和6.0mLCDAP(乙腈中100mg/mL(w/v))混合在玻璃瓶中，搅拌1分钟。用8.0mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将800mg的PsaA(53.33mL，浓度为15.0mg/mL)以1.0:0.8(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活化多糖中。

用1.3mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图4的B)。

G)肺炎球菌多糖血清型11A与PsaA的活化与缀合。

在玻璃瓶中以1.0:0.8(PS:CDAP)的比例将1000mg(100.0mL，浓度为10.0mg/mL)机械磨碎的多糖血清型11A和8.0mL的CDAP(乙腈100mg/mL，w/v))混合，搅拌1min。用14.0mL0.2M三乙胺将多糖溶液pH调节至9.0，在室温(RT)下搅拌1分钟。将800mg的PsaA(53.3mL，浓度为15.0mg/mL)以1.0:0.8(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活性多糖中。

用1.1mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图5的B)。

H)肺炎球菌多糖血清型12F与PsaA的活化和缀合。

将1000mg(142.8mL，浓度为7.0mg/mL)机械磨碎的多糖血清型12F和4.0mL CDAP(100mg/mL，乙腈(w/v))以1.0:0.4(PS:CDAP)的比例混合于玻璃瓶中，搅拌1分钟。用9.0mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，室温(RT)下搅拌1分钟。将700mg的PsaA(46.6mL，浓度为15.0mg/mL)以1.0:0.7(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活化多糖中。

用1.7mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，并在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图6的B)。

I)肺炎球菌多糖血清型15A与PsaA的活化和缀合。

将1000mg(71.4mL，浓度为14.0mg/mL)机械磨碎的15A型多糖和10.0mL CDAP(100mg/mL，乙腈(w/v))以1.0:1.0(PS:CDAP)的比例混合于玻璃瓶中搅拌1min。用20.5mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，室温(RT)下搅拌1分钟。将1000mg的PsaA(66.6mL，浓度15.0mg/mL)以1.0:1.0(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活化多糖中。

用0.9mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，并在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图7的B)。

J)肺炎球菌多糖血清型23A与PsaA的活化和缀合。

将1000mg(83.3mL，浓度为12.0mg/mL)机械磨碎的多糖血清型23A和10.0mL CDAP(100mg/mL，乙腈(w/v))以1.0:1.0(PS:CDAP)的比例混合于玻璃瓶中，搅拌1min。用20.3mL额0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，室温(RT)下搅拌1分钟。将600mg的PsaA(40.0mL，浓度为15.0mg/mL)以1.0:0.6(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活化多糖中。

用1.1mL的0.2M三乙胺将反应的pH值调节到9.0，并在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图8的B)。

K)肺炎球菌多糖血清型23B与PsaA的活化和缀合。

将1000mg(10.0mg/mL浓度的100.0mL)机械磨碎的多糖血清型23B和2.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0:0.2(PS:CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1分钟。用3.0mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并室温(RT)下搅拌1分钟。将1000mg的PsaA(66.6mL，浓度为15.0mg/mL)以1.0:1.0(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活化多糖中。

用2.4mL的0.2M三乙胺将反应的pH调节至9.0，并在室温下搅拌反应3-5小时，随后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图9的B)。

L)肺炎球菌多糖血清型24F与PsaA的活化及缀合。

将1000mg(125.0mL 8.0mg/mL浓度)机械磨碎的多糖血清型24F和3.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0:0.3(PS:CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1分钟。用10.0mL的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0并室温(RT)搅拌1min。将600mg的PsaA(40.0mL，浓度为15.0mg/mL)以1.0:0.6(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加到活化多糖中。

用3.5mL的0.2M三乙胺将反应的pH调节到9.0，并在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图10的B)。

M)肺炎球菌多糖血清型35B与PsaA的活化和缀合。

将1000mg(浓度为7.0mg/mL的142.8ml)机械磨碎的多糖血清型35B和6.0mL CDAP(100mg/mL乙腈(w/v))以1.0:0.6(PS:CDAP)的比例混合于玻璃瓶中并搅拌1分钟。用7.0ml的0.2M三乙胺将多糖溶液的pH调节至9.0，并在室温(RT)下搅拌1分钟。将1000mg的PsaA(66.6mL，浓度15.0mg/mL)以1.0:1.0(PnPs:PsaA)的比例缓慢添加至活化多糖。

用2.2mL的0.2M三乙胺将反应的pH调节到9.0，并在室温下搅拌反应3-5小时，然后通过添加过量浓度的甘氨酸(100mM)使反应猝灭。反应中每小时使用SEC-HPLC监测反应的缀合动力学(图11的B)。

来自血清型1、4、5、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的肺炎球菌多糖，每种2.2μg，和4.4μg的6B血清型的24价缀合疫苗(0.5mL)与约35μg的CRM

表I：制剂(I)的表征

来自血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B的肺炎球菌多糖，每种2.2μg，和4.4μg的6B血清型的24价缀合疫苗(0.5mL)与60μg的CRM

表II：制剂(II)的表征

实施例5：携带不同载体蛋白的两种缀合疫苗免疫家兔的免疫应答

为了评估免疫原性，用配方I和II免疫家兔。研究设计包括两组，每组7只兔子。用每种制剂的三个剂量对动物进行免疫。采血和免疫计划以及分组详情见下表：

表III：家兔对常规和减少的抗原制剂的免疫反应评估

每隔一定时间采集免疫家兔血清。在ELISA中评估血清型特异性IgG滴度，该ELISA改编自WHO推荐的ELISA以评估人血清中的血清抗体滴度。抗体效价评估为高于临界值的OD

滴度估计为产生ELISA OD

发现用PCV24(制剂I)或PCV24(制剂II)接种的家兔的血清IgG滴度非常相似。与制剂II相比，制剂I免疫组中除血清型23A和23B外的GMFR反应略低。最重要的是，所有用含有一种载体蛋白(CRM

本发明并不旨在穷尽或将本技术限制于本文公开的精确形式。尽管本文出于说明目的公开了特定实施例，但正如相关领域的普通技术人员将认识到的，在不偏离本技术的情况下，各种等效修改是可能的。在一些情况下，未详细示出和/或描述众所周知的结构和功能，以避免不必要地模糊对本技术的实施例的描述。尽管方法的步骤可在本文中以特定顺序呈现，但在替代实施例中，这些步骤可具有另一适当顺序。类似地，在特定实施例的上下文中公开的本技术的某些实施例可以在其他实施例中被组合或消除。此外，虽然与某些实施例相关联的优点可以在这些实施例的上下文中公开，但是其他实施例也可以展示这些优点，并且并非所有实施例都需要展示本文公开的这些优点或其他优点以落在本技术的范围内。因此，本发明和相关技术可以包括本文未明确示出和/或描述的其他实施例。

依据上文，可以理解为了说明的目的，这里描述了本发明的具体实施例，但是可以在不偏离本发明的范围的情况下进行各种修改。

本发明的多价肺炎球菌缀合疫苗组合物提供了比原始多价肺炎球菌疫苗和现有肺炎球菌缀合疫苗更好的免疫应答。

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：R·布尔基;R·斯里拉曼;R·V·马图尔;N·D·曼特纳;M·达特拉;B·马西拉马尼;V·B·坎迪马拉;V·桑加雷迪;
专利申请人：生物E有限公司;

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