一种胸膜肺炎放线杆菌及其应用

文献发布时间：2023-06-19 12:04:09

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其涉及一种胸膜肺炎放线杆菌及其应用。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎又称坏死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种高度接触传染性、致死性呼吸道传染病。各年龄的猪对本病均易感，常见于育成猪和成年猪，以急性出血性纤维素肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜炎为主要特征。随着猪养殖业规模化、集约化的发展，本病的发生呈爆发趋势，急性型发病率和死亡率均为50％左右，最急性型的死亡率可达80％～100％，对养殖业的危害日益严重。近些年APP的临床分离率在逐年增长，常与其它病原如副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、大肠杆菌、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸系统综合征病毒等混合感染并引起猪呼吸道综合症(PRDC)，使猪肺部防御功能减弱、增加了治疗难度。此外，该病在许多养猪国家流行，已成为世界性工业化养猪的五大疫病之一，因此猪传染性胸膜肺炎的防治对于养猪业的健康发展具有重大的意义。

近年来，人们开始关注使用具有特殊生物特性的菌株作为载体表达各种外源抗原或对其进行改造以预防重大人、畜传染病，特别针对多糖的免疫原性特点来进行研究。由于APP血清型众多，现已报道的血清型已达18种，且不同血清型之间无有效的交叉免疫保护作用，因而严重制约了多价疫苗的开发研究，使得本病的预防变得非常困难。应用基因工程方法构建减毒株和利用其作为活载体表达外源抗原研制多价疫苗等已成为该领域的研究热点。现如今市场上预防APP感染的疫苗主要以三价灭活苗为主，对多种流行株的交叉保护效果较差。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种胸膜肺炎放线杆菌，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种胸膜肺炎放线杆菌，其命名为胸膜肺炎放线杆菌SDHG-1，其保藏号为CCTCC NO:M 2021204，于2021年3月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏地址为：中国湖北省武汉市武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述胸膜肺炎放线杆菌在表达细胞外基质多糖中的应用。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述细胞外基质多糖为葡萄糖类聚合物。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述细胞外基质多糖为聚1,6-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖(poly-1,6-N-acetyl-D-glucosamine，PGA)。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述胸膜肺炎放线杆菌用于提高细胞外基质多糖的合成相关基因的转录水平。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述细胞外基质多糖的合成相关基因包括pgaA、pgaB、pgaC和pgaD；所述pgaA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示；所述pgaB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；所述pgaC的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；所述pgaD的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述胸膜肺炎放线杆菌在制备用于防治猪传染性胸膜肺炎的药物中的应用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述胸膜肺炎放线杆菌在制备用于免疫胸膜肺炎放线杆菌的疫苗中的应用。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述疫苗对不同血清型胸膜肺炎放线杆菌具有交叉免疫保护作用。

研究表明APP外毒素在其致病和免疫中扮演重要角色，其中外毒素ApxⅠ和 ApxⅡ在APP毒力方面起着关键作用，ApxⅣ具有高度的保守性。

本发明实施例提供的胸膜肺炎放线杆菌SDHG-1为血清12型的粘性胸膜肺炎放线杆菌菌株，其能同时分泌ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅣ，且表面多糖较丰富，可提高细胞外基质多糖的合成相关基因的转录水平，是一个较好的多糖表达系统候选株和疫苗候选株，具有很好的应用潜力，可以成为有效防控猪传染性胸膜肺炎病的重要工具之一。

附图说明

图1为SDHG-1在BHI培养基中生长特性图；

图2为SDHG-1的革兰氏染色结果图；

图3为SDHG-1的PCR鉴定结果图；

图4为SDHG-1血清型鉴定结果图；

图5为SDHG-1相对L20中PGA合成相关基因pgaA、pgaC、rpoE和hns 的转录水平结果图；

图6为小鼠存活率结果图；

图7为小鼠血清抗体效价结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明的一个实施例中，提供了一种胸膜肺炎放线杆菌，其命名为胸膜肺炎放线杆菌SDHG-1，其保藏号为CCTCC NO:M 2021204，于2021年3月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏地址为：中国湖北省武汉市武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)。

在本发明的另一个实施例中，提供一种上述胸膜肺炎放线杆菌在表达细胞外基质多糖中的应用。

具体的，胸膜肺炎放线杆菌SDHG-1可用作为表达细胞外基质多糖的载体。

在本发明的一个优选实施例中，所述细胞外基质多糖为聚1,6-N-乙酰基-D- 氨基葡萄糖(poly-1,6-N-acetyl-D-glucosamine，PGA)。

在本发明的一个优选实施例中，所述胸膜肺炎放线杆菌用于提高细胞外基质多糖的合成相关基因的转录水平。

具体的，所述细胞外基质多糖的合成相关基因包括pgaA、pgaB、pgaC和p gaD；所述pgaA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述pgaB的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:2所示；所述pgaC的核苷酸序列如序列表SEQ I D NO:3所示；所述pgaD的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。

在本发明的另一个实施例中，提供了一种上述胸膜肺炎放线杆菌在制备用于免疫胸膜肺炎放线杆菌的疫苗中的应用。

具体的，所述疫苗对不同血清型胸膜肺炎放线杆菌具有交叉免疫保护作用，譬如，该疫苗对血清12型APP具有免疫保护效果，且对血清1型APP等菌种也具有良好的交叉免疫保护效果。

此外，上述技术方案的实际应用情况可参考如下实验例，但不限于此。

实验例

一、实验方法

1、细菌的分离纯化：将无菌采集的新鲜肺脏病料用接种环于含NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的BHI(脑心浸液琼脂)平板上进行划线培养，置于37℃恒温培养箱中培养24h。挑取形态特点差异较大的单个菌落，分离培养并再次纯化后进行后续鉴定。将上述纯化后细菌进行革兰氏染色，显微镜下观察其形态。

2、细菌的生化鉴定：按照VTTEK2 Compact细菌鉴定仪的操作说明，制备 1mL的菌液(OD

3、细菌的PCR和血清型鉴定：按照细菌DNA提取试剂盒的操作步骤提取 APP分离株SDHG-1的DNA并以其为模板，用16s rRNA通用引物进行PCR扩增。PCR扩增条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火56℃30s，延伸7 2℃90s，30个循环，72℃15min，4℃保存。取10μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR产物于吉林省库美生物科技有限公司进行测序，测序的结果在NCBI的数据库上进行BLAST比对，进行同源性分析。

4、参照上述方法，用血清12型APP特异性鉴定引物(如表1所示)进行扩增，电泳后PCR产物进行测序比对，确定其血清型。

表1引物序列信息

4、APP SDHG-1和L20(现有的非粘性APP)中PGA合成相关基因pgaA、 pgaC、rpoE和hns的转录水平检测细菌的表面多糖包含LPS(脂多糖)、CPS(荚膜多糖)和PGA(poly-1,6-N-acetyl-D-glucosamine，细胞外基质多糖)，其中L PS多与细菌的粘附能力及毒力相关；CPS具有较好的抗原性且常用于血清型鉴定，亦是细菌的重要毒力因子；PGA是构成APP生物膜基质的主要成分和必要元素，是导致细菌形成“粘附型”菌落的关键物质。其中基因pgaA、pgaC在PGA 的合成中起着主要作用，pgaA有利于PGA的聚合，pgaC包含一个胞质糖基转移酶结构域，负责转运。rpoE、hns分别为pgaA、pgaB、pgaC、pgaD转录激活因子和生物膜形成的抑制因子。从SDHG-1和L20菌液中提取总RNA，反转录为c DNA后以其为模板，采用表1相应引物(以重组酶F，recF为管家基因)，通过qRT-PCR的方法检测pgaA、pgaC、rpoE和hns的转录水平。

5、免疫原的制备

(1)灭活疫苗：将胸膜肺炎放线杆菌分离株SDHG-1置于BHI液体培养基中并于37℃摇床培养至对数期(OD

(2)弱毒株：SDHG-1高表达胞外多糖，免疫原性较好，多糖也可多为免疫佐剂提供保护作用；致病力较弱，对昆明小鼠的LD50为7.1×10

6、动物免疫与攻毒：将20只18-22g ICR小鼠随机分为4组，每组5只。分别在0、14、28d将SDHG-1灭活疫苗对各组小鼠进行背部皮下多点免疫。第1、 3组每只小鼠免疫0.2mL灭活的SDHG-1免疫原(含2×10

7、疫苗的保护效力试验

在免疫后0、14、28、35d对各组小鼠尾静脉采血，析出血清后-80℃保存。分别以血清1型APP、APP分离株SDHG-1作为包被抗原，通过间接ELISA检测各组小鼠血清抗体效价的变化。

二、实验结果：

1、细菌的分离鉴定结果：

BHI固体培养基在37℃培养箱中培养14h后长出大小一致、半透明、光滑湿润的直径约1mm的白色圆形菌落(APP SDHG-1)，其粘性较强，如图1所示。革兰氏染色镜下观察如图2，呈革兰氏阴性短杆状，液体培养基中常成团状。

2、生化鉴定结果：

该APP SDHG-1可发酵分解包括葡萄糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、麦芽糖、蔗糖等多种糖醇类物质，产生酸性物质和气体，且呈尿素酶、磷酸酶阳性，符合 APP的特点，具体结果如表2所示。

表2 SDHG-1生化鉴定结果

3、胸膜肺炎放线杆菌分离株PCR鉴定和血清型鉴定结果：

通过16s rRNA通用引物进行PCR扩增，发现在约1400bp处出现目的条带，符合预期大小(如图3所示)。PCR产物测序结果经BLAST比对显示为APP，同源性高达99.98％。用血清12型APP特异性引物对cps12基因进行扩增，出现 347bp大小的条带(如图4所示)，符合预期；其测序结果与血清12型APP菌株1096有100％同源性。上述结果证明SDHG-1为12型APP。

4、APP SDHG-1和L20中PGA合成相关基因pgaA、pgaC、rpoE和hns的转录水平结果如图5所示。结果显示SDHG-1中pgaA、pgaC和rpoE的转录水平显著高于非粘性菌株APPL20，生物膜形成抑制因子hns的转录水平则无明显变化。这些结果表明SDHG-1菌体PGA合成的相关基因mRNA的表达量显著高于L20，提示该菌株高表达细胞外基质多糖并适合作为基因工程表达系统候选株。

5、各组小鼠的存活率结果如图6所示。图6中，IBPBS-C1：PBS免疫-血清 1型APP感染；IBSDHG-1-CSDHG-1：SDHG-1灭活疫苗免疫-SDHG-1感染。

图6的结果显示SDHG-1灭活免疫组与PBS免疫组有明显的差异。攻毒24 h内第2组小鼠全部死亡，而第1组仅有1只小鼠死亡；第3组在48h内有1只小鼠死亡，而第4组死亡3只。这些结果表明SDHG-1灭活疫苗免疫小鼠后可以对自身提供较强的保护，并对血清1型APP提供一定的交叉免疫保护效果，具体的灭活疫苗保护效力结果如表3所示。

表3灭活疫苗保护效力结果

6、血清抗体效价检测结果如图7所示。其中，IBSDHG-1-APP1：经SDHG- 1灭活疫苗免疫的小鼠血清中产生针对APP1的抗体；IBSDHG-1-SDHG-1：经S DHG-1灭活疫苗免疫的小鼠血清中产生针对SDHG-1的抗体。图7的结果显示， SDHG-1灭活免疫组小鼠均可同时检测到针对血清1型APP和SDHG-1的抗体，第35d抗体效价达到峰值，且未免疫小鼠无针对血清1型APP和SDHG-1的抗体。

综上所述，APP菌株SDHG-1胞外多糖PGA合成相关基因pgaA、pgaC、r poE的转录水平显著高于“非粘性”菌株L20，提示该菌体表面多糖PGA表达丰富，适合应用于基因工程表达系统作为载体对其进行改造。另外，SDHG-1灭活疫苗免疫小鼠可保护小鼠免受血清12型APP的感染，并对血清1型APP感染提供良好的交叉免疫保护效果。

需要说明的是，PGA是构成APP生物膜基质的主要成分和必要元素，由pg aA、pgaB、pgaC、pgaD操纵子共同编码，其中pgaA和pgaC在PGA的合成中起着主要作用。上述结果表明SDHG-1中pgaA、pgaC的转录水平较L20株显著升高，虽未检测pgaB、pgaD的转录水平，由于pgaABCD的整体性及其发挥功能的相互配合的必要性，故pgaA、pgaB、pgaC和pgaD均为本发明专利的保护范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种胸膜肺炎放线杆菌及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2429

<212> DNA

<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<400> 1

atggagataa aatttaattc tttagcgctt tgtctattat ctacaacgtt cctcaatact 60

gctttggcca atgcatcgcc gatagatata aagcgggaag aaattgtgat tttttctcgt 120

caaggagaca gccaattaac acaagcgatt tctcaactat ctgatttata taaaaaaaca 180

ggtgatagaa aagttagaga cgatttaatc gcattaatga tgcgaaaagg cgaatttaag 240

catgcgatta atgtttgtgc agattgtaat attaatcatt tttccgaaag tgaattggaa 300

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aaattaagtc aaaaatatcc taataatccg aacggtttat taggaagcag cttggttgaa 420

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ttaaaacttt atcgtctggc aacgaaatta aatgtacttc ccattcaatc cgaattagtt 660

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tattatttaa attcggcaaa aactaccgaa gggcattacg cttatgtgca ttattcggag 1680

gataaagtac cgaccgaagg ggaagtgctt aagcaacgta gaatcggtgc cggtagttat 1740

ctgaatttct ttccgtttaa ccttacgctt gaagcgggta aggggattaa attaaatgaa 1800

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tcgtattctt tttaatttag gtaataaca 2429

<210> 2

<211> 1781

<212> DNA

<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<400> 2

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<212> DNA

<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<400> 3

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<213> 胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

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