一种提取石蜡切片中细菌DNA的试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，具体涉及一种提取石蜡切片中细菌DNA的试剂盒、提取方法和应用。

背景技术

宿主微生物群不仅与正常生理功能相关，同时微生物群落内环境平衡紊乱(失调)与病理状况也密不可分[1]，在癌症发生发展中，一些微生物群可能通过促进黏膜炎症或引起全身失调直接致癌，但某些微生物群在调节癌症免疫治疗反应中起作用[2]，肿瘤微环境中微生物群落显著影响治疗效果[3]。利用宏基因组技术研究发现，与癌旁组织或患者健康组织相比，多种癌症中发现了新的含量丰富的病原菌。另外，传统上被认为是无菌的肿瘤生长部位也有细菌DNA指征并发现细菌多样性与肿瘤患者生存期相关。已在多处鉴定出肿瘤特异的细菌群落，如结肠、喉部、胰腺和前列腺等[4]。

石蜡切片法(paraffin section)是组织学中一种常规的制片技术。石蜡切片不仅可以用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的一种方法。同时，也是医疗机构保存病理组织的一种方法。而医院或科研机构中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。由于新鲜标本难以得到，对已有病例进行回顾性研究时，只能从石蜡包埋组织中进行DNA提取。而石蜡包埋组织中由于DNA含量少，DNA与蛋白质、石蜡相互交联，使得从石蜡切片样本中提取DNA的难度增大，细菌DNA的提取就更加困难，且市面上现无相关提取切片组织中细菌DNA的试剂盒。

试剂盒作为一种简单快捷的生物技术工具收到科研人员的欢迎，目前提取石蜡切片组织中微生物的DNA试剂盒比较少，主要生产厂家有Qiagen、Biog、Tiangen等，以柱式提取为主。但是柱式提取影响因素较多，通过柱式提取石蜡包埋组织DNA的提取量主要取决于离心柱对DNA的吸附能力、洗脱液对DNA的洗脱能力以及裂解液的裂解消化能力，同时还与石蜡样本量、脱蜡时间、消化时间有关。如果离心柱对DNA的吸附能力太弱，则起不到分离纯化的目的，如果离心柱对DNA或部分DNA片段吸附能力太强，则得到的样品DNA可能不完整，影响后续的分析实验。而且整个过程中还要注意，提取时脱蜡应彻底，消化应充分，否则都会降低DNA提取的得率。

中国专利CN 104164418 A公开了一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒，所述试剂盒包括：脱蜡剂二甲苯、由95％乙醇和75％乙醇配制的脱蜡清洗剂、由SDS、Tris-HCl、EDTA及蛋白酶K与水配制的消化液、蛋白沉淀剂4M NH

参考文献

[1]Zitvogel L,Daillère R,Roberti MP,Routy B,Kroemer G.Anticancereffects of the microbiome and its products.Nat Rev Microbiol.2017；15(8):465-478.

[2]Gopalakrishnan V,Spencer CN,Nezi L,et al.Gut microbiome modulatesresponse to anti-PD-1immunotherapy in melanoma patients.Science.2018；359(6371):97-103.

[3]Geller LT,Barzily-Rokni M,Danino T,et al.Potential role ofintratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeuticdrug gemcitabine.Science.2017；357(6356):1156-1160.[4]Nejman D,Livyatan I,FuksG,et al.The human tumor microbiome is composed of tumor type-specificintracellular bacteria.Science.2020；368(6494):973-980.

发明内容

本发明解决的第一个问题为从石蜡切片中提高细菌DNA提取量的问题。

本发明为了解决相关技术中存在的有毒试剂的使用和从石蜡切片中提取DNA步骤复杂的问题，本发明提供了一种使用无毒脱蜡剂且使用方法简单的石蜡切片组织DNA提取试剂盒。

本发明的一个目的在于提供一种石蜡切片组织细菌DNA提取试剂盒，所述试剂盒包括脱蜡剂、漂洗剂、消解剂和沉淀剂。

进一步地，所述脱蜡剂为烷烃化合物。

进一步地，所述脱蜡剂取自MagPure FFPE DNA KF Kit，型号：D5117试剂盒。

进一步地，所述漂洗剂包括漂洗剂1、漂洗剂2、漂洗剂3。

进一步地，所述漂洗剂1为含水量≤0.5％的无水乙醇。

进一步地，所述漂洗剂2为含量≥99％的氯仿。

进一步地，所述漂洗剂3为70-80％乙醇。

进一步地，所述漂洗剂3为75％乙醇

进一步地，所述消解剂包括消解剂1、消解剂2、消解剂3、消解剂4。

进一步地，所述消解剂1为裂解液。

进一步地，所述裂解液，成分包括:Tris-HCl,EDTA,SDS,NaCl。

进一步地，所述裂解液成分包括:1M Tris-HCl,0.4-0.6M EDTA,10-15％SDS,1-2MNaCl，pH＝7-8。

进一步地，所述消解剂2为溶菌酶20-100mg/ml。

进一步地，所述消解剂3为RNase A 100mg/ml。

进一步地，所述消解剂4为蛋白酶K 20mg/ml。

进一步地，所述沉淀剂为含量≥99.5％的异丙醇。

本发明另一个目的在于提供一种石蜡切片组织DNA的提取方法，包括以下步骤：

1)将石蜡切片加入脱蜡剂中，振荡、离心后弃去上清液；

2)加入无水乙醇，振荡、离心，弃去上清液，挥发去除残留的无水乙醇；

3)加入裂解液、溶菌酶、RNase A进行预消解；

4)加入裂解液和蛋白酶K经过消解、解交联，随后进行瞬时离心；

5)取部分经步骤4)瞬时离心后的溶液，加入氯仿，振荡、离心，回收上层液体，弃去下层液体；

6)加入沉淀剂进行沉淀，沉淀后进行离心，弃去上清液；

7)加入70-80％乙醇进行漂洗，漂洗后进行离心，弃去上清液；

8)重复步骤7)；

9)干燥得DNA。

进一步地，所述步骤1)中，所述脱蜡剂为无毒脱蜡剂；所述振荡是在10000rpm振荡10s，65℃孵育3min；所述离心是在12000rpm下离心2min。

进一步地，所述步骤1)中，石蜡切片的用量为8-10片8-10μm的石蜡切片，脱蜡剂的用量为1mL。

进一步地，所述步骤2)中，所述无水乙醇为99.5％的无水乙醇；所述振荡是在10000rpm、室温下振荡3-5s；所述离心是在10000-12000rpm下离心2min；所述挥发是37℃下进行。

进一步地，所述步骤2)中，无水乙醇的用量为1mL。

进一步地，所述步骤3)中，所述溶菌酶的浓度为20mg/mL、RNase A的浓度为100mg/mL；所述预消解在37℃下进行1-1.5h。

进一步地，所述步骤3)中，所述裂解液的用量为80μL、溶菌酶的用量为20μL、RNaseA的用量为2μL。

进一步地，所述步骤4)中，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL；所述瞬时离心为3s，把管盖上液滴收回管中。

进一步地，所述步骤4)中，所述裂解液的用量为100μL；所述蛋白酶K的用量为20μL。

进一步地，所述步骤3)和步骤4)中的裂解液成分包括:Tris-HCl,EDTA,SDS,NaCl。

进一步地，所述裂解液成分包括:1M Tris-HCl,0.4-0.6M EDTA,10-15％SDS,1-2MNaCl，pH＝7-8。

进一步地，所述步骤4)中，所述消解是在50-60℃下反应1-1.5h，所述解交联是在80-100℃下反应1-1.5h。

进一步地，所述步骤5)中，所述氯仿的含量≥99％；所述振荡是在10000rpm、5-10s；所述离心是在10000-12000rpm下离心5min。

进一步地，所述步骤5)中，所述部分经步骤4)瞬时离心后的溶液的体积为150μL；所述氯仿的用量为150μL。

进一步地，所述步骤6)中，所述沉淀剂为异丙醇；所述沉淀是在-20℃下沉淀10min；所述离心是在10000-12000rpm下离心5min。

进一步地，所述步骤6)中，所述异丙醇的用量为300μL。

进一步地，所述步骤7)中，所述75％乙醇用量为1mL，漂洗时间为2min，所述离心是在10000-12000rpm下离心3min。

进一步地，所述步骤9)中，所述干躁在室温下进行。

本发明中所使用的术语“瞬时离心”或“瞬离”是指将离心管置于离心机中，短时间离心，目的是将管壁或管盖上的物料离心至离心管底部。

本发明具有以下优势：

1)由于人体组织中细菌含量低，从人体组织石蜡切片中将细菌DNA同时提取出来的难度也会相对于单纯提取人体组织DNA的难度进一步增加。本发明在消解前使用溶菌酶，可以消解细菌细胞壁，使细菌内容物溶出，提高样品细菌DNA的回收量。

2)本发明的提供的脱蜡剂采用无毒物质配制而成，避免了相关技术中有毒物质二甲苯的使用。

3)本发明在消解前使用RNase A，可以将组织中存在的RNA水解，可以排除最终产品用于后续试验时RNA存在对实验结果的影响。

4)本发明采用沉淀法进行DNA纯化，试验操作简单，影响因素少，可以提高样品DNA回收率。

5)本发明使用多种消解剂联用对样品进行充分消解，再结合沉淀法进行DNA纯化，取得了提取后的DNA中细菌DNA菌属种类更多的效果，在提取之后使用生物信息学分析方法进行分析，验证了此结论。

附图说明

图1使用实施例1的方法提取的DNA的生信分析结果；

图2使用对比例3的方法提取的DNA的生信分析结果。

具体实施方式

如无特殊说明，本发明对实验物料来源不做特殊限定，采用市售符合国家标准或行业标准的产品即可。

脱蜡剂：无毒脱蜡剂，取自试剂盒MagPure FFPE DNA KF Kit，型号：D5117，Magen公司生产的组分相同的产品可等同替代。

无水乙醇，水含量≤0.5％，对来源不做特殊限定。

异丙醇，含量≥99.5％，对来源不做特殊限定。

氯仿，含量≥99％，对来源不做特殊限定。

溶菌酶：对来源不做特殊限定。以下实施例和对比例使用的溶菌酶购买自厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司；型号：A610308

RNase A：对来源不做特殊限定。以下实施例和对比例使用的RNase A购买自厂家：北京全式金生物技术有限公司；型号：GE101-01

蛋白酶K：对来源不做特殊限定。以下实施例和对比例使用的蛋白酶K购买自厂家：Qiagen；型号19133

生工柱：取自生工DNA提取试剂盒：型号B518255-0100，生工(sangon)公司生产的相同的提取住可等同替代。

qiagen柱：取自Qiagen DNA提取试剂盒：型号56404，Qiagen公司生产的相同的提取住可等同替代。

ATE：取自Qiagen DNA提取试剂盒：型号56404，Qiagen公司生产的组分相同的产品可等同替代。

裂解液：成分包括:1M Tris-HCl,0.4-0.6M EDTA,10-15％SDS,1-2M NaCl，pH＝7-8。

AW1：Qiagen buffer AW1型号：19081，Qiagen公司生产的组分相同的产品可等同替代。

AW2：Qiagen buffer AW1型号：19072，Qiagen公司生产的组分相同的产品可等同替代。

NF water：Qiagen Nuclease-Free Water型号：129114，Qiagen公司生产的组分相同的产品可等同替代。

实验方法：

1.提取后DNA浓度及纯度检测

使用市售Thermofisher Qubit4.0荧光计及相应的试剂盒对提取后的DNA进行浓度测定。

2.提取后DNA菌属检测

使用生物信息学分析方法对提取后的DNA进行生物信息学分析，确定提取得到的DNA的细菌菌属种类及数量。

为了保证实验的可对比性，以下实施例和对比例所使用的石蜡切片为相同病理状态之下的石蜡切片。

实施例1

一种提取石蜡切片中细菌DNA的试剂盒，包括：

脱蜡剂

漂洗剂1：无水乙醇；

漂洗剂2：氯仿；

漂洗剂3：75％乙醇；

消解剂1：裂解液，成分包括:1M Tris-HCl,0.4M EDTA,15％SDS,1M NaCl，pH＝7。

消解剂2：溶菌酶20mg/mL；

消解剂3：RNase A 100mg/mL；

消解剂4：蛋白酶K 20mg/mL；

沉淀剂：异丙醇。

一种石蜡切片组织中细菌DNA的提取方法，包括以下步骤：

1)将10片10μm石蜡切片加入1mL脱蜡剂中，在10000rpm振荡10s、65℃下孵育3min；随后在12000rpm下离心3min；弃去上清液；

2)加入1mL无水乙醇，在10000rpm、振荡10s；随后在10000下离心2min；弃去上清液；在37℃下挥发去除残留的无水乙醇；

3)加入80μL裂解液、20μL溶菌酶(20mg/mL)、2μL RNase A(100mg/mL)在37℃下预消解1h；

4)加入100μL裂解液和20μL蛋白酶K在56℃下消解1h；消解后，置于90℃下解交联1h，随后进行瞬时离心；

5)取经步骤4)瞬时离心后的溶液150μL，加入150μL氯仿，在10000rpm、振荡10s；随后在12000rpm、4℃下离心3min；回收上清液，弃去沉淀；

6)加入300μL异丙醇在-20℃沉淀10min，沉淀后在12000rpm,4℃下离心5min，弃去上清液；

7)加入1mL 75％乙醇漂洗2min，漂洗后在12000rpm下离心3min，弃去上清液；

8)重复步骤7)；

9)干燥得DNA。

10)加入50μL NF water溶解DNA，即得DNA溶液，检测DNA浓度为116ng/μL。

实施例2

一种提取石蜡切片中细菌DNA的试剂盒，包括：

脱蜡剂

漂洗剂1：无水乙醇；

漂洗剂2：氯仿；

漂洗剂3：75％乙醇；

消解剂1：裂解液，成分包括:1M Tris-HCl,0.6M EDTA,10％SDS,2M NaCl，pH＝8。

消解剂2：溶菌酶100mg/mL；

消解剂3：RNase A 100mg/mL；

消解剂4：蛋白酶K 20mg/mL；

沉淀剂：异丙醇。

一种石蜡切片组织中细菌DNA的提取方法，包括以下步骤：

1)将10片10μm石蜡切片加入1mL脱蜡剂中，在10000rpm振荡10s、65℃下孵育3min；随后在10000rpm下离心3min；弃去上清液；

2)加入1mL无水乙醇，在10000rpm、振荡10s；随后在10000rpm下离心2min；弃去上清液；在37℃下挥发去除残留的无水乙醇；

3)加入80μL裂解液、20μL溶菌酶(100mg/mL)、2μL RNase A(100mg/mL)在37℃下预消解1.5h；

4)加入100μL裂解液和20μL蛋白酶K在56℃下消解1.5h；消解后，置于90℃下解交联1.5h，随后进行瞬时离心；

5)取经步骤4)瞬时离心后的溶液150μL，加入150μL氯仿，在10000rpm、振荡10s；随后在10000rpm、4℃下离心3min；回收上清液，弃去沉淀；

6)加入300μL异丙醇在-20℃沉淀10min，沉淀后在10000rpm,4℃下离心5min，弃去上清液；

7)加入1mL 75％乙醇漂洗2min，漂洗后在10000rpm下离心3min，弃去上清液；

8)重复步骤7)；

9)干燥得DNA。

10)加入50μL NF water溶解DNA，即得DNA溶液，检测DNA浓度为103ng/μL。

对比例1

和实施例1的区别在于使用离心柱法提取DNA。

1)将10片10μm石蜡切片加入1mL脱蜡剂中，在10000rpm振荡10s、65℃下孵育3min；随后在12000rpm下离心2min；弃去上清液；

2)加入1mL无水乙醇，在10000rpm振荡10s、65℃下孵育3min；随后在12000rpm下离心2min；弃去上清液；在37℃下挥发去除残留的无水乙醇；

3)加入80μL裂解液、20μL溶菌酶(20mg/mL)、2μL RNase A(100mg/mL)在37℃下预消解1h；

4)加入100μL裂解液和20μL蛋白酶K在56℃下消解1h；消解后，置于90℃下保温1h，随后进行瞬时离心；

5)取经步骤4)瞬时离心后的溶液150μL，加入200μL AL和200μL无水乙醇，充分混合后，进行瞬时离心。

6)将经步骤5)瞬时离心后的溶液加入生工柱，在12000rpm下离心30s，弃去流分；

7)加入500μL AW1，在12000rpm下离心30s，弃去流分；

8)加入500μL AW2，在12000rpm下离心30s，弃去流分；

9)在12000rpm下离心3min，使柱膜干燥；

10)加入50μL ATE，反应1min，在12000rpm下离心5min，保留滤液，即得DNA溶液，检测DNA浓度为33.8ng/μL。

对比例2

和实施例1的区别在于使用离心柱法提取DNA。

1)将10片10μm石蜡切片加入1mL脱蜡剂中，在10000rpm、振荡10s,65℃下孵育3min；随后在12000rpm下离心2min；弃去上清液；

2)加入1mL无水乙醇，在10000rpm振荡10s、65℃下孵育3min；随后在12000rpm下离心2min；弃去上清液；在37℃下挥发去除残留的无水乙醇；

3)加入80μL裂解液、20μL溶菌酶(20mg/mL)、2μL RNase A(100mg/mL)在37℃下预消解1h；

4)加入100μL裂解液和20μL蛋白酶K在56℃下消解1h；消解后，置于90℃下保温1h，随后进行瞬时离心；

5)取经步骤4)瞬时离心后的溶液150μL，加入200μL AL和200μL无水乙醇，充分混合后，进行瞬时离心。

6)将经步骤5)瞬时离心后的溶液加入qiagen柱，在12000rpm下离心30s，弃去流分；

7)加入500μL AW1，在12000rpm下离心30s，弃去流分；

8)加入500μL AW2，在12000rpm下离心30s，弃去流分；

9)在12000rpm下离心3min，使柱膜干燥；

10)加入50μL ATE，反应1min，在12000rpm下离心5min，保留滤液，即得DNA

溶液，检测DNA浓度为46.8ng/μL。

对比例3

和实施例1的区别在于不使用溶菌酶。

1)将10片10μm石蜡切片加入1mL脱蜡剂中，在10000rpm、振荡10s,65℃下孵育3min，弃去上清液；

2)加入1mL无水乙醇，在10000rpm、振荡5s；随后在12000rpm下离心2min；弃去上清液；在37℃下挥发去除残留的无水乙醇；

3)加入2μL RNase A(100mg/mL)在37℃下预消解1h；

4)加入100μL裂解液和20μL蛋白酶K在56℃下消解1h；消解后，置于90℃下保温1h，随后进行瞬时离心；

5)取经步骤4)瞬时离心后的溶液150μL，加入150μL氯仿，在10000rpm、振荡10s；随后在12000rpm下离心3min；回收上清液，弃去沉淀；

6)加入300μL异丙醇在-20℃沉淀10min，沉淀后在12000rpm，4℃下离心5min，弃去上清液；

7)加入1mL 75％乙醇漂洗2min，漂洗后在12000rpm下离心3min，弃去上清液；

8)重复步骤7)；

9)干燥得DNA。

10)加入50μL NF water溶解DNA，即得DNA溶液，检测DNA浓度为85ng/μL。

本发明对多组样品分别使用实施例1和对比例3的方法提取得到的DNA进行了分析，结果如下：

相同的组成的实验样品分别经过实施例1和对比例3提取得到的DNA经生物信息学分析得到的菌属数量数据见表1。

表1实施例1和对比例3提取的DNA生物信息学分析数据

由于石蜡切片间的不同，相同提取方法提取出的DNA菌属数量也不相同。通过相同样品间使用不同试剂盒提取的结果对比，可以看出，本发明提供的试剂盒及其对应的提取方法可以得到更高的DNA提取量，且对细菌DNA的提取更加完全。

采用实施例1的方法提取的DNA生物信息学分析结果见图1，采用对比例3的方法提取的DNA生物信息学分析结果见图2，可以看出相同样本使用本发明的试剂盒提取到的DNA的细菌菌属数量更多。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。