寡核苷酸在治疗肿瘤中的用途

技术领域

本发明涉及使用寡核苷酸直接在手术干预期间在不同阶段特异性治疗肿瘤疾病的用途。

背景技术

称为寡核苷酸的短单链或双链寡核苷酸可以通过现有技术中建立的化学方法合成(Herdewijn 2005，Surhone et al.2010)。目前，可以有效合成长达约200个碱基或碱基对的DNA寡核苷酸，其中，由于许多技术原因，与RNA相比，可以更容易地合成DNA以及更长的片段。从技术上讲，更长的合成是可能的，但酶促或体内制备更简单以及更有效。不过，预计将来还会合成长度增加的寡核苷酸。到目前为止，合成过程中使用的是机器，其自动执行合成的重复步骤。

化学合成寡核苷酸的优势之一在于其可修饰性。此类修饰可包括例如非天然核苷酸构件(例如肌苷)或天然修饰(例如胞嘧啶甲基化)。此外，可以在碱基残基、糖残基或磷酸残基处修饰核苷酸，如本发明的实施方案中存在的。修饰包括例如用烷基、烷氧基、氨基、脱氮(Deaza)、卤素、羟基、硫醇基团或其组合取代。核苷酸也可以用稳定性更高的类似物替代，例如，核糖核苷酸可以用脱氧核糖核苷酸替代或其糖部分的2'OH基团可以用2'氨基、2'O-甲基、2'甲氧基乙基或2'-O、4'-C亚甲基桥替代。核苷酸的嘌呤或嘧啶类似物的示例包括黄嘌呤、次黄嘌呤、Azapurin、甲硫腺苷、7-脱氮腺苷和O-或N-修饰的核苷酸。核苷酸的磷酸残基可以通过用氮或用硫(硫代磷酸酯)取代磷酸基团的一个或多个氧原子来修饰。进一步的修饰包括锁核酸LNA(W09914226A2)、解锁核酸UNA、2'OMe-甲氧基和2'F氟修饰。单链的3'和5'末端还允许添加其他分子残基，例如简单或糖基化的肽和蛋白质以及脂质、壳聚糖和其他壳聚糖衍生物、聚合物或染料。这种类型的修饰可以直接或通过间隔子与寡核苷酸连接，例如一个或多个甘氨酸残基。这些修饰的开发具有多种目的，例如影响寡核苷酸的稳定性或双链的解链温度、改变与其他分子或表面的亲和力或体内的生物利用度或活性。修饰也用于例如改善寡核苷酸的功能、其稳定性或其转移特性，或用于控制寡核苷酸的定位或靶向。在下文中，术语寡核苷酸包括所有这些修饰。

许多类型的寡核苷酸天然存在于人类和动物中，或者通常存在于生物或病毒中，或者从那些中衍生出来。寡核苷酸具有非常不同的功能，例如调节蛋白质表达、干扰所述表达或细胞之间的通讯。寡核苷酸可以以各种形式存在，例如双链、具有单链突出端的双链、发夹状、环状或单链。天然存在的寡核苷酸的例子是微小RNA(miRNA)或长链非编码RNA(lnRNA)；天然衍生或人工的寡核苷酸的例子是短干扰RNA(siRNA)、短激活RNA(saRNA)、CRISPR-Cas寡核苷酸或反义DNA，其中一些适合作为治疗活性物质。首次申请批准的物质是用于治疗纯合子遗传性高胆固醇血症的反义DNA(Mipomersen

狭义的术语“肿瘤”被理解为是指由细胞生长失调引起的身体组织的良性或恶性肿瘤(瘤变)(DocCheck,https://flexikon.doccheck.com/de/Tumor)。通俗地讲，恶性肿瘤被称为癌症。时至今日，许多形式的恶性肿瘤，尤其是实体瘤，仍无法治愈。例如，在诊断后存活时间非常短的肿瘤中，有胰腺、肾上腺、间皮、脑和肺的肿瘤，尽管近几十年来已经进行了巨大的努力以改善或发展这些肿瘤的诊断、个体化治疗和治疗方法。这些努力的示例包括手术切除肿瘤、药物治疗或放射，以及其各种组合。较新的或实验性的治疗方法包括特定的基因或细胞治疗，特别是包括携带嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。

尽管有更好的诊断技术，以及尽管在治疗和肿瘤的早期检测方面做出了巨大努力，但迄今为止在治疗和生存方面取得的进步非常有限。对于这些肿瘤中的许多，患者仅在特殊情况下才能治愈。然而，许多治疗至少减缓疾病进展并延长患者的预期寿命。根据肿瘤的类型，获得的平均寿命介于数年和仅数月之间。对新治疗方法有相当大的需求，特别是对于那些迄今为止接受治疗的患者几乎没有获得任何额外的预期寿命的肿瘤。

许多实体瘤是在早期和第一步中使用手术进行治疗的。然而，并不总是能够完全切除原发性肿瘤。即使出现完全切除的肿瘤块，也很可能肿瘤床或手术腔洞的边缘仍然含有肿瘤细胞，由此可能出现复发。即使使用敏感的病理程序，也可能无法检测到这些肿瘤细胞。转移也可能发生在距离原发性肿瘤的短距离处(俗称直接种植性转移瘤。在某些类型的肿瘤中，几乎不可能完全切除，例如晚期的胶质母细胞瘤。胶质母细胞瘤表现出浸润性生长，然后经常影响不可或缺的大脑区域。在某些类型的肿瘤中，甚至整个受影响的器官都会被手术切除，例如肾上腺皮质癌中的肾上腺。在这种情况下，器官功能的药物替代是必要的，也是可能的。即使进行根治性切除，这种肿瘤的复发也很常见并且几乎总是致命的。尽管有这些限制，但肿瘤的手术切除通常是有效的肿瘤治疗的重要组成部分，无可替代。肿瘤切除通常与辅助或新辅助治疗有关。然后以新辅助的方式使用药物治疗和放射，即在手术前，如果原发性肿瘤的肿瘤块和手术风险均要降低，例如在大肿瘤或难以触及的肿瘤的情况下。

当作为辅助使用，即在手术后，药物治疗和放射治疗旨在防止复发的发生并作用于无法进行手术或仅怀疑其存在的远处转移瘤。术后的放射主要用于防止复发或治疗已知的局部转移瘤，因为目前其几乎只在局部应用。在大多数情况下全身应用药物，尤其是怀疑有转移瘤但无法检测到的情况下。

在上述应用中，药物可以是主要对增殖细胞发挥细胞毒性作用的化学治疗剂，也可以是靶向治疗剂，例如抗体或载有细胞毒素的抗体，用于通过肿瘤特异性受体攻击肿瘤细胞。因为关于转移瘤，受体的组成通常是未知的，靶向治疗剂很少作为佐剂使用。

对于不适合手术的肿瘤，只有放射治疗和药物治疗可用。为了减少药物治疗的不良反应，现在局部应用药物。如果在直接注射期间要避免肿瘤细胞的假定扩散，这通常通过直接注射到肿瘤或周围组织中来实现。

较少情况下，药物在手术期间局部给药。假设通过这种给药途径，与辅助的全身应用相比，远处转移瘤的靶向没有更好地实现。关于胶质母细胞瘤，通常只能部分切除，因此更经常地采用此类治疗策略，旨在攻击不可切除的肿瘤块。

为此，使用化学治疗的药物，在手术后将其插入手术腔洞中。对于胶质母瘤细胞，也考虑局部给药，因为许多药物不能穿过血脑屏障-即使血脑屏障在胶质母瘤细胞中可能不完全完整。此外，还使用聚合物载体，目的是通过缓慢释放储存在仓库中的药物来实现更容易的应用和更长时间的可用性，此外还能够显著提高药物剂量而不会发生全身毒性作用。

Gliadel

然而，Gliadel

已开发出另一种形式的纳米颗粒，能够在酸性pH(<5)下膨胀。据推测，这些纳米颗粒在内体的酸性环境中释放其物质。这些膨胀的颗粒还提供有紫杉醇用于治疗肺癌(Griset et al 2009)、间皮瘤(Schulz et al 2011)和腹膜癌(Colson et al2011)。在小鼠模型中切除原发性肿瘤后，这些颗粒通过静脉或腹膜内给药。明显地，这些颗粒还没有经过临床测试。

基于壳聚糖的水凝胶：壳聚糖是通过脱乙酰甲壳质获得的，甲壳质是昆虫和甲壳类的壳的主要材料。因为其优秀的生物可降解性，壳聚糖进入生物医学应用已有一段时间，例如伤口愈合材料(Kim IY et al,2008)。建议了使用载有紫杉醇的、基于壳聚糖的水凝胶来治疗肿瘤切除后的伤口愈合边缘。因此，为了模拟这种情况，在肿瘤接种后数天在体内注射该组合(Ruel-Gariépy et al,2004)。在另一项研究中使用了喜树碱(Campthotecin)，但没有针对切除期间的应用(Berrada M et al 2005)。

关于射频或热消融，注射有阿霉素的微米棒作为佐剂。关于消融，复发最常发现于治疗区域的边缘和血管周围。在动物实验中，肝脏消融后注射棒(Qian et al 2003)并注射到预先穿刺的异种移植肝肿瘤中(Weinberg et al,2007)。通过同时施用地塞米松(与羟丙基-β-环糊精复合)(Blanco et al,2006)减少棒周围的纤维囊的形成。在另一个实验中，将5-FU应用到棒(Haaga et al,2005)。

其他可能的载体是柔性薄膜，其比刚性载体更好地适应伤口边缘的表面，使得物质可以从较大的区域扩散到组织中。在切除后，将具有紫杉醇的聚(甘油单硬脂酸酯co-ε-己内酯)薄膜植入在肺癌模型中(Liu et al.,2010)；将含有羟基喜树碱的薄膜植入在类似的模型中(Wolinski et al-2,2010)以及再一次将具有紫杉醇的薄膜植入到在肉瘤模型中(Liu et al,2012)。

这些策略的成功通常是有限的，这导致了局部给药的进一步改进，例如，使用脂质体来应用细胞生长抑制剂(Yang et al 2016)，或将靶向分子与纳米颗粒偶联或通过各种外部刺激例如磁场或光(Rosenblum et al,2018)，诱导药物的控制释放。

一种新型的术中应用形式称为腹腔热灌注化疗(HIPEC)(Glehen et al 2008)，旨在实现在腹膜内细胞生长抑制剂的高局部浓度和上层细胞层中的物质吸收，以减少全身毒性。附加的热疗法被认为是通过改善组织渗透来提高所应用的细胞生长抑制剂的治疗潜力。然而，热疗法也产生了其自身的直接细胞毒性作用(Ceelen et al 2010)。

对于HIPEC的应用，在手术结束时在腹部的不同区域放置了几条引流管。使用具有换热器的滚子泵系统并检查温度曲线。目标温度为42-43℃，并且灌注时间在30和120分钟之间，取决于所使用的方案。迄今为止，丝裂霉素C是最常用的细胞生长抑制剂。标准全身治疗中使用的奥沙利铂和伊立替康药物在HIPEC中的使用(Piso et al 2011)越来越多。

压力型气溶胶化疗(加压腹腔内气溶胶化疗，PIPAC)是另一种应用形式。在压力下使用气溶胶会导致药物在体腔(例如腹部或胸部)中的分布特别有效。在PIPAC期间，使用顺铂、阿霉素、奥沙利铂、紫杉醇等药物。直接在肿瘤部位局部给药意味着消除了腹腔内化疗的其他存在的药理学局限性，例如在体腔内分布不均和进入组织的低扩散程度。细胞生长抑制剂的局部剂量可以减少10倍，而不会失去对肿瘤组织的功效。因此，腹腔内化疗的剂量依赖性局部毒性得到了更好的控制，并且显著降低了治疗的器官毒性和全身副作用。

在PIPAC中，应用12mmHg的CO

一种辅助基因治疗策略Sitimagene ceradenovec(Cerepro)已发表(EP 1 135513B2)。肿瘤切除后，将腺病毒注射到邻近手术腔洞的组织中，其中病毒携带功能性胸苷激酶基因，例如单纯疱疹病毒的功能性胸苷激酶基因。在转染的细胞中，该基因导致胸苷激酶表达。当更昔洛韦在手术后应用并被转染的细胞吸收时，优选在这些细胞中被磷酸化，从而形成能够干扰基因合成的活性物质。通过使用这些步骤，更昔洛韦的作用被局部限制在手术腔洞周围的区域。然而，临床试验结果并未导致该疗法获得批准；在人用医药产品委员会(CHMP)的根据欧洲药品管理局(EMA)高级治疗委员会(CAT)的评估的负面建议中，认为观察到的有效性低且存在严重副作用的显著风险(EMA网站撤回批准申请：Cerepro)。后来，由于所观察到的协同效应(EP 2 665489B1)，该方法通过额外施用细胞生长抑制性替莫唑胺(作为胶质母细胞瘤标准治疗的一部分)而得到进一步发展。

此外，提出了针对间皮瘤和卵巢癌的基因治疗(WO 2015/002861 A1)，其中使用了载有人干扰素α2b基因的腺病毒。作为佐剂的应用没有明确的意图。

最近，已经尝试在肿瘤切除期间使用染料标记的抗体，特别是荧光染料，以便在手术期间观察肿瘤阳性切除边缘。在乳腺癌模型中，染料IRDye800CW与抗体贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗和托珠单抗偶联，并研究了其局部分布(Korb et al 2014)。在另一项研究中，一种抗PD-1的单克隆抗体用相同的染料标记，并在手术后作为无染料的佐剂进行腹腔注射(Du et al 2017)。此外，已提议在术中在肿瘤床中切除肿瘤期间使用光免疫疗法，即基于抗体的光动力疗法，以同时观察和对抗残留的肿瘤细胞(de Boer 2016)。

然而，在其他研究中，通过在肿瘤切除后应用多次全身注射，抗体也被用作肿瘤治疗的佐剂。例如，对于结肠癌的治疗，手术后的辅助化疗已成为最先进的技术，并经常用于医疗实践。使用5-FU和奥沙利铂。在其他研究中，替代地，血管生成抑制的单克隆抗体Avastin

免疫检查点靶向单克隆抗体(ICT mAb)，例如PD-1抗体，在第一临床试验中进行了肿瘤内给药。与全身使用相比，对ICT mAb的耐药性似乎有所降低(Maraballe etal.2017)。

已经开发了几种用于治疗肿瘤的寡核苷酸。通常，寡核苷酸针对特定的细胞靶标，例如纺锤体驱动蛋白(KSP)、Polo样激酶1(PLK)、蛋白激酶N3(PKN3)、核糖核苷酸还原酶(RRM2)或张力蛋白2等细胞周期蛋白。还包括来自WO 2010/102615的前药，其中缀合的蛋白酶底物抑制siRNA的有效性，直到底物被蛋白酶切割。

然而，就寡核苷酸而言，目前的发展主要集中在纳米颗粒或凝胶形式的制剂和递送(Kim et al 2012)，两者都旨在通过注射进行全身或腹膜内应用。siRNA也可以应用，例如，“裸”在盐水中，或与聚阳离子、阳离子脂质/脂质转染试剂或阳离子肽复合，作为确定的分子偶联物的组分(例如，胆固醇修饰的siRNA、TAT-DRBD/siRNA复合物)，或作为脂质体的成分。对于再生医学中的应用，使用由多孔聚酯聚氨酯制成的基质作为皮下植入物进行了测试，从二嵌段共聚物中释放结合siRNA的纳米颗粒(Nelson et al 2013)，因此需要两个载体系统，这意味着额外的复杂性。在藻酸盐或胶原蛋白中同时包含细胞和siRNA也已被描述(Krebs et al 2009)，并且已被提议用于可以注射以水凝胶形式存在的负载藻酸盐或胶原蛋白的应用。

寡核苷酸的局部应用已经并且正在被开发为用于针对肿瘤的各种治疗方法的肿瘤内注射。Han等人使用与siRNA配制的壳聚糖颗粒降低乳腺癌和黑色素瘤中谷氨酰胺转胺酶的体内表达(Hat et al,2012)。将胶凝温度为40℃的水凝胶与含金的纳米壳结合，通过使用光辐射进行肿瘤内注射以诱导siRNA的局部效应(Strong et al,2014)。聚乙烯亚胺缀合的有机磷腈也表现出热反应，并与针对VEGF和细胞周期蛋白B1的siRNA进行肿瘤内注射(Kim et al 2012)。这些方法未在围手术期使用或作为辅助使用；重点仅在于实现高局部浓度并因此对原发性肿瘤具有高效率，以及与小分子相比，降低寡核苷酸从作用部位扩散的速度。这同样适用于胰腺导管腺癌(PDA)的研究，其中要降低Kirsten大鼠肉瘤病毒(KRAS)基因的突变形式的表达。在这种方法中，还使用了聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)基质。由于广泛接触，基质元素甚至被缝合到肿瘤上，以优化对抗原发性肿瘤的效率。免疫刺激性RNA(CPG 1826，Coley Pharmaceuticals)在动物实验中作为佐剂进行肿瘤内给药；在这里，小鼠接受了针对OX40、CTLA4、GITR和FR4的抗体治疗，但没有进行手术。作者做出了改善效果的报告，然而，这种方法并未临床应用(Houot R et al 2009)。

质粒和寡核苷酸也已在局部应用以促进伤口愈合，例如聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA纳米颗粒中的血小板衍生生长因子的质粒(pPDGF)或血管内皮生长因子(pVEGF)的质粒(Tokatlian et al 2014)或脱细胞真皮基质中的作为植入物(Vandegrift et al2015)或p53(Nguyen et al 2010)的脯氨酰羟化酶结构域酶2(PHD2)-siRNA。然而，在这些应用中，重点是受伤后的伤口愈合，与肿瘤没有任何关系。这些方法的潜在风险在于，解决伤口愈合的靶基因可能会增加肿瘤形成的风险。这种情况阻碍了在肿瘤治疗中使用这些局部方法。

根据现有技术，在肿瘤切除后，细胞生长抑制剂特别用作佐剂。事实上，局部应用的细胞生长抑制剂有望在全身应用方面表现出许多优势：

-这些物质通常是疏水的，可以更直接地到达切除的肿瘤块附近的预期作用部位。

-小分子细胞生长抑制剂的快速分解被它们通过载体的应用所抵消，分子在较长的时间内从载体洗脱。因此，药物可以覆盖增殖细胞的更多细胞周期。

-肿瘤外的副作用对许多细胞生长抑制剂是剂量限制性的，仅限于手术腔洞周围的区域，并且明显较低。

到目前为止，此类佐剂系统有限成功的原因尚不清楚。迄今为止，Gliadel

预期小分子的局部佐剂应用的优势对于大分子是不可预期的。大分子通常很容易溶解，并且比小分子排泄得更慢。此外，局部应用大分子可获得的浓度增益低于小分子。与那些小分子相比，大分子的扩散路径也更短，即大分子不会深入到肿瘤床及其周围。如果在手术腔洞的愈合过程中围绕载体形成纤维囊，则穿透深度变得特别小。

因此在肿瘤切除术中，大分子用于其他目的。在Sitimagene ceradenovec后采用了一种精心设计的方法，该方法涉及手术后全身注射的前药的转化，而这种前药又是一种小分子。然而，这种转化仅发生在先前手术过程中用编码单纯疱疹胸苷激酶的基因转染的细胞中，该基因的长度为数百个核苷酸。该基因被包装在无法复制的腺病毒中，用于感染细胞。该基因在细胞转染后表达，并导致单纯疱疹胸苷激酶的表达，进而将Ganciclovir

然而，抗体用于外科手术，主要是因为抗体可能在手术过程中用作荧光标记的标记物。经常使用此类抗体，否则用作全身性肿瘤治疗剂。这些抗体与肿瘤特异性受体结合的能力使其能够作为肿瘤细胞特异性标志物。在荧光激发后，标记的肿瘤细胞会因此发光，并为外科医生提供有关肿瘤扩散的信息。抗体可以局部注射到肿瘤中用于治疗，即不进行肿瘤切除。作为肿瘤切除过程中的佐剂，抗体仅全身应用。

对于辅助的、局部肿瘤治疗，主要有可用的小分子，到目前为止仅显示出有限的治疗成功。因此，需要改进的辅助治疗以提高肿瘤切除后治愈的机会。

发明内容

发明目的

因此，本发明的目的是提供一种简单的辅助治疗，可在手术腔洞内局部应用，通过该治疗破坏那些在至少部分肿瘤切除后保留并且在切除后出现在肿瘤床内及其附近的肿瘤细胞，或通过该疗法破坏原发性肿瘤附近或周围的种植性转移瘤。

根据本发明的方案

本发明的目的通过使用对肿瘤有效的寡核苷酸出乎意料地实现，该寡核苷酸在肿瘤切除后直接应用于肿瘤床。寡核苷酸优选与可吸收、凝胶状或弹性载体或固体载体(例如纱布材料或颗粒)一起施用。此外，如果手术腔洞对于其他形式的应用来说太复杂，则可能优选液体制剂以到达所有可能存在肿瘤细胞的位置。反过来，液体形式可包含颗粒或凝胶状颗粒载体。当使用液体制剂时，优选选择的待应用的体积是使其填充手术腔洞的一半以上，或者特别是完全填充。如果手术后需要引流，液体应用形式也可以多次或连续较长时间灌注。此外，也可以优选气溶胶应用形式，其中配制的或未配制的寡核苷酸从液体溶液气雾化并引入到手术腔洞中。

这种效果令人惊讶，因为与其他类别的分子相比，尤其是小分子，预期寡核苷酸更不适合这种应用，这是因为其电荷、大小、不稳定性、低细胞摄取率以及由于其快速降解。根据预期，配制的寡核苷酸有时明显更大且扩散更慢，使得其更不适合这种用途。

另一方面，预计小分子在局部应用后不仅会到达细胞层的顶部，还会到达邻近组织的更深层。优选这种深度到达的作用，因为预计那里也有肿瘤细胞。

本发明意义上的简单治疗形式的特征在于使用至少一种类型的寡核苷酸作为活性成分组分，其已经单独实现了抗肿瘤作用。优选这种简单的治疗形式，以保持不良反应的低风险。

具体实施方式

优选实施例

考虑到用于肿瘤手术的腹腔镜手术技术的快速发展，因为进入手术腔洞的时间是有限的，因此优选仅使用一种应用的治疗，并且目前理想情况下不超过30分钟。随后每次打开手术腔洞也会增加传播肿瘤细胞的风险。

根据本发明，优选使用多效性寡核苷酸以作用于尽可能多的肿瘤细胞，而不管细胞当前所处的细胞周期阶段，特别是在单一应用的情况下。根据本发明，多效性寡核苷酸是在细胞中同时影响至少两个靶标的那些寡核苷酸，例如具有相同靶序列的编码不同蛋白质的两个mRNA。多效性寡核苷酸的例子是根据WO 2010102615的前药，其中优选的实施方案在肿瘤细胞中同时对几个生理靶标有效(WO 2012098234)。

根据本发明，生物可降解的载体材料优选表现出低免疫原性，其特征在于水凝胶样或弹性特性，并且寡核苷酸通过扩散或在体内降解过程中或通过环境参数如pH值的变化从其中洗脱。特别优选使用包含医学证明的材料(例如胶原蛋白、去端肽胶原、明胶、纤维蛋白、壳聚糖或透明质酸、其合成或重组变体及其合成修饰)的载体。

如果在临时连接的载体中使用根据本发明的寡核苷酸，则特别优选，使得大量的寡核苷酸在局部和延长的时间段内可用。根据本发明，“暂时连接”是指载体可以是坚固的、有弹性的甚至是可变形的，但是在几个小时或几天内构成一个单元。生物可降解的载体也被认为是暂时连接的，其中载体由于体内分解过程而变小，并在数小时或数天后分解成更小的单元，这些单元像纱布一样从载体上拆除，或者经过转变为液相。

如果在每次应用中大量使用根据本发明的寡核苷酸，则是特别优选的。所使用的寡核苷酸的总量取决于手术腔洞和周围组织的结构。对于连接的载体，这种关系描述为装填密度。优选地在载体中使用装填密度大于3微克寡核苷酸/毫升载体体积，特别优选分别大于12、50、250、1000或5000微克/毫升的寡核苷酸。

使用这样的载体可能是有利的：在延长的时间段内，特别是在几天内，从其中洗脱寡核苷酸。通过身体吸收的载体是特别有利的。能够进行简单的腹腔镜操作的载体，例如柔性箔或棒，是特别有利的。寡核苷酸和较小的颗粒载体可以应用在网中(例如由纱布材料制成的网)或在水凝胶中。优选使用初始洗脱速率大于每天1微克/平方厘米，特别是分别大于每天2、5、10、25或100微克/平方厘米的载体。

根据本发明，在肿瘤切除后局部使用寡核苷酸以防止复发或转移。因此，在手术过程中将其应用于完全或部分切除原发性肿瘤和周围组织之后产生的手术边缘。这还包括周围的结缔组织和脂肪组织。对于寡核苷酸的机械应用，凝胶状制剂是有利的，其可以用刷子或类似工具分布或喷洒到组织上。

用于使用寡核苷酸的合适载体材料是胶原蛋白，其可具有凝胶状或弹性特性。胶原蛋白被人体吸收并表现出低免疫原性。

如果寡核苷酸可以使用注射器分布在手术腔洞中，则在根据本发明的液体制剂中使用寡核苷酸是有利的。这种应用形式对于复杂形式的手术腔洞是有利的，因为制剂本身分布在手术腔洞内并且可能从其开口流出，就像种植性转移瘤一样。本发明意义上的“复合物”是指手术腔洞对腹膜等腔洞开放，使得肿瘤细胞能够扩散到腹膜的远端边缘。

通过使用具有相似大小的液体体积，特别优选具有相同大小或甚至是单独手术腔洞或包括与其相连的腔洞的体积的1、2、5倍大的液体体积，来确保特别合适的分布。例如，在切除肾上腺后，会产生大约25ml的手术腔洞，然而，其与更大的腹膜后间隙相连。大量的液体能够进行灌注，从而使对肿瘤有效的寡核苷酸持续供应到手术腔洞，并且可以在腔洞内各处实现寡核苷酸的高局部浓度。

还优选使用根据本发明的寡核苷酸作为气溶胶。针对这个目的，在手术腔洞或与其相邻的腔洞中产生超压。气溶胶通过套管针、软管或类似工具被引入到产生的腔洞中，或者甚至通过所插入的气溶胶生成器产生。气溶胶几乎均匀地分布在腔洞中，从而甚至可以到达腔洞的偏远区域。腔洞保持打开多于两个小时，特别是多于一个小时或半小时。如果进入腔洞是连续的或者可以快速且容易地重新建立，则根据本发明的寡核苷酸以气溶胶形式的使用也可以重复数次。

优选在气溶胶中使用的寡核苷酸量多于1微克/平方厘米腔洞体积，特别优选多于2、5、10、25、100微克。

根据本发明的寡核苷酸的用途包括与现有技术已知的方法和治疗的组合。这包括，例如，同时应用例如细胞生长抑制剂和寡核苷酸之类的药物，以及例如并行进行的放射治疗。

实施例：肾上腺皮质癌

肾上腺皮质癌很少发生，目前通常通过腹腔镜肾上腺切除术治疗，即微创手术切除完整的肾上腺。然而这样治疗的患者的预后很差，特别是在晚期确诊的原发性肿瘤的情况下，很可能发生复发或转移，通常会导致患者在几个月内死亡。

腹腔镜肾上腺切除术使用腹部/经腹膜或腹膜后通路进行。肾筋膜被刺穿并产生一个手术腔洞，在20-30mmHg正压下加压以稳定。正压还可以减少或防止任何血管损伤后出血进入手术腔洞。随后，进一步的切口用于调动周围的器官，切断供应肾上腺的动脉和静脉，并暴露肾上腺。理想情况下，将整个肾上腺与周围的脂肪组织一起解剖，转移到取物袋中，然后通过其中一个套管针将其从患者体内拉出。此外还可以进行淋巴结切除术。手术腔洞用蒸馏水和抗生素进行冲洗，在简单的情况下，关闭而不引流。

这种外科手术小心地避免损坏肿瘤包膜以及在患者体内留下任何肿瘤组织。然而，通常会发生来源不明的局部复发。肿瘤细胞可能在手术前已从肾上腺转移到环境中。这包括在其他器官或器官的部分的体腔中发生转移，这是由于重力作用下分离的肿瘤细胞的尾部迁移引起的。围绕肾脏的肾筋膜向腹膜后间隙向内侧和尾部开口这一事实促进了这些过程。

根据本发明，在肿瘤切除后局部使用寡核苷酸以防止复发或转移并对抗残留的肿瘤细胞或转移瘤。为此，例如，在手术过程中，在切除肾上腺后将寡核苷酸应用到形成的手术边缘和周围组织。这还包括周围的结缔组织和脂肪组织，尤其是肾筋膜。特别适用于该目的的是凝胶状制剂，其可以使用工具(例如刷子)通过腹腔镜应用到伤口边缘。在肾上腺皮质癌的手术腔洞中，伤口边缘形成的表面积约为50平方厘米。凝胶以层厚度为0.2至1mm应用，相当于凝胶体积为1至5ml。该凝胶体积优选含有70微克寡核苷酸，特别优选多于250或1000微克，或5、25或100毫克。凝胶在几周内降解，寡核苷酸不断释放。

在另一个示例性实施例中，使用例如由胶原蛋白制成的弹性载体，其被引入到手术腔洞中。作为高弹性载体，以胶囊的形式通过套管针的孔被引入手术腔。去除包封层后，载体呈现出与所切除的器官对应的尺寸和形状，约为4*3*2cm，具有小于25ml的体积或部分体积。载体含有优选含量多于70微克，特别优选含量多于250或1000微克，或5、25或100毫克的寡核苷酸。载体在几周内降解，寡核苷酸不断释放。

凝胶和弹性载体的降解速率可以通过生产参数来控制，在胶原蛋白的情况下，例如通过胶原蛋白的交联度。优选大于1周的体内半衰期，特别优选2周、4周和3个月的半衰期。

在根据本发明的另一个实施例中，使用用于寡核苷酸的液体制剂。这里，例如，寡核苷酸通过注射器分布在手术腔洞中。这种应用形式的一个优点是制剂本身分布在手术腔洞内并可能从其开口流出，就像种植性转移一样。在具有上述肾筋膜扩张的肾上腺皮质癌中，液体应用形式比固体应用形式更好地达到其延伸部位。本实施例中的注射体积为20ml，优选包含多于70微克，特别优选多于250或1000微克，或5、25或100毫克的寡核苷酸。寡核苷酸可以包装在颗粒或脂质体中，使得其只有在载体被细胞降解或吸收时才缓慢释放。颗粒的降解速率可能受生产参数(例如交联度)的影响。优选大于1周的体内半衰期，特别优选2周、4周和3个月的半衰期。

使用表现出更简单几何形状的载体也可能是有利的，寡核苷酸经过较长一段时间，特别是经过几天，从该载体中洗脱。可通过身体吸收的载体是特别有利的。能够进行简单的腹腔镜操作的载体，例如柔性箔或棒，是特别有利的。较小的颗粒载体可以应用在网中(例如纱布网)或水凝胶中。

在肾上腺皮质癌情况下，可以优选使用气溶胶中的寡核苷酸，特别是含量为70微克，特别优选含量多于250或1000微克，或5、25或100毫克的寡核苷酸。

使用寡核苷酸作为佐剂与辅助治疗(例如米托坦(Mitotane))的组合以及与放射疗法的组合可能是优选的。

实施例：卵巢癌

目前，卵巢癌是女性第六大常见恶性肿瘤(Leitlinie Ovarialkarzinom 2013)。手术切除卵巢是治疗的重要组成部分。关于卵巢癌，诊断结果强烈影响组织切除的程度。除了卵巢本身，输卵管和淋巴结，以及在后期，其他器官也可能受到影响，特别是那些延伸到腹膜内或邻近腹膜的器官。尽可能进行肿瘤切除，但在这些情况下通常不可能完全切除，因为周围组织已经受到影响。与肾上腺皮质癌不同，不推荐腹腔镜手术。

大多数情况下建议进行辅助化疗；该建议的一个例外涉及在手术时非常早期阶段的病例。推荐全身应用卡铂，一种低分子量的细胞生长抑制剂，其通常与显著的副作用有关，例如血细胞计数变化、肝脏和神经功能障碍以及心血管功能受损。在分期阶段较高的情况下，还建议使用紫杉醇和贝伐珠单抗(一种针对VEGF的单克隆抗体)进行全身治疗。尽管如此，复发还是经常发生。

根据本发明，在肿瘤切除后局部使用寡核苷酸以防止复发或转移并对抗残留的肿瘤细胞或转移瘤。为此，例如，在手术过程中，在切除卵巢和其他组织后，将它们应用到产生的手术边缘和周围组织。这还包括周围的结缔组织和脂肪组织，尤其是腹膜的一部分。

成人卵巢的大小约为3.5*2*1cm，其体积约为3-6ml。类似于肾上腺皮质癌，各种制剂都是合适的，包括凝胶状制剂。尽管与肾上腺皮质相比，器官体积较小，但优选使用1-5ml的体积，因为卵巢周围的组织也应更大程度地包覆。凝胶体积优选包含70微克，特别优选多于250或1000微克，或5、25或100毫克。凝胶会在几周内降解，从而提供寡核苷酸的持续释放。寡核苷酸可以包装在颗粒或脂质体中，使得其仅在载体被细胞降解或吸收的情况下才缓慢释放。颗粒的降解速率可能受生产参数(例如交联度)的影响。优选大于1周的体内半衰期，特别优选2周、4周和3个月的半衰期。

在另一个示例性实施例中，使用例如由胶原蛋白制成的弹性载体，其被引入手术腔洞中并且完全或部分膨胀至卵巢的体积。载体含有优选含量多于70微克，特别优选多于250或1000微克，或5、25或100毫克的寡核苷酸。载体会在几周内被身体降解，从而持续释放寡核苷酸。

凝胶和弹性载体的降解速率可以通过生产参数来控制，在胶原蛋白的情况下，例如通过胶原蛋白的交联度。优选大于1周的体内半衰期，特别优选2周、4周和3个月的半衰期。

在卵巢癌的情况下，寡核苷酸的液体制剂也可能是有利的，因为围绕卵巢的腹膜的特征在于大的延伸。本实施例中用于卵巢癌的注射量为20ml，优选包含多于70微克，特别优选多于250或1000微克，或5、25或100毫克的寡核苷酸。寡核苷酸可以包装在颗粒或脂质体中，使得其只有在载体被细胞降解或吸收时才缓慢释放。颗粒的降解速率可能受生产参数(例如交联度)的影响。优选大于1周的体内半衰期，特别优选2周、4周和3个月的半衰期。

使用表现出更简单几何形状的载体也可能是有利的，寡核苷酸经过较长一段时间，特别是经过几天，从该载体中洗脱。可通过身体吸收的载体，例如柔性箔或棒，是特别有利的。较小的颗粒载体可以应用在网中(例如纱布网)或水凝胶中。

在卵巢癌的情况下，可以优选使用气溶胶中的寡核苷酸，特别是20或70微克的量，特别优选多于250或1000微克，或5、25或100毫克寡核苷酸的量。

使用寡核苷酸作为佐剂与辅助细胞生长抑制剂(例如卡铂、顺铂、紫杉醇和贝伐珠单抗)的组合以及与放射疗法的组合可能是优选的。

示例性实施例：间皮瘤

弥漫性恶性间皮瘤是起源于胸膜、腹膜或心包膜的间皮或间皮下细胞的肿瘤。恶性胸膜间皮瘤患者的预后较差，中位生存期为4至12个月。目前还没有治愈性的治疗方法。

大多数(>80％)间皮瘤起源于胸膜。恶性间皮瘤相对罕见。最常见的是，它们表明之前接触过石棉(Neumann et al 2013)。还预计间皮瘤病例，例如，2001年9月11日纽约世贸中心遇袭后，在接下来的15年内，在当时暴露的人中将显著增加(Povtak 2016)。根据间皮瘤的亚型，超过50％的胸膜间皮瘤肿瘤细胞释放到相关的胸腔积液中。

没有治疗间皮瘤的标准疗法。建议的治疗概念包括从孤立的对症治疗到包括手术、化疗和放疗在内的积极的多模式治疗。目前，存在两种手术策略，即胸膜切除术/胸膜剥脱术或胸膜外全肺切除术，以尽可能实现完整的宏观肿瘤切除。这些切除不是通过腹腔镜进行的。然而，由于间皮瘤的弥漫性生长，通常不可能完全切除肿瘤。肿瘤的残留部分仍然存在，通常只能通过显微镜检测到，在这种情况下，建议进行辅助放疗和化疗(Rice 2011)。根据现有技术，建议腹膜内卡铂和培美曲塞的组合。关于患者存活率，检查点抑制剂的辅助使用取得了成功(Scherpereel et al 2017)。

与肾上腺皮质和卵巢相比，手术腔洞的大小差异很大；在胸膜间皮瘤中切除肺后，其可能达到几升的大小，面积可达数百平方厘米。在这些体积的情况下，也可以有利地使用凝胶并应用工具例如刷子；优选浓度为每毫升凝胶多于15或70微克，特别优选每毫升凝胶多于250或1000微克，或5、25或100毫克。

当保存受影响的肺时，液体制剂是合适的，优选浓度大于每毫升15或70微克，特别优选大于250或1000微克，或5、25或100毫克/毫升。

在大体积切除的情况下，总体积对应于所切除的器官的总体积的弹性载体不再有用。取而代之的是，优选使用扁平载体，例如薄膜、箔或纱布，直接携带寡核苷酸，包装在颗粒例如脂质体中，缀合或配制成凝胶。优选每平方厘米10微克的装填密度，特别优选每平方厘米50或200微克，或每平方厘米1、5或20毫克寡核苷酸的密度。优选将寡核苷酸应用于植入物，例如在横膈膜切除后使用的那些具有相同寡核苷酸密度的植入物。

同样在间皮瘤的情况下，可以优选使用具有更简单几何形状的支撑物，特别是如果寡核苷酸经过较长的一段时间，特别是几天，从这些支撑物上洗脱。通过身体吸收的载体，例如柔性箔或棒，是特别有利的。较小的颗粒载体可用于网(例如纱网)或用于水凝胶。

在间皮瘤中，可以优选使用气溶胶中的寡核苷酸，特别是含量为70微克，特别优选含量多于250或1000微克，或5、25或100毫克的寡核苷酸。

使用寡核苷酸作为佐剂与辅助疗法(例如卡铂和培美曲塞)的组合以及与放射疗法的组合可能是优选的。

实施例：胶质母细胞瘤

胶质母细胞瘤属于弥漫浸润性、高度恶性的神经胶质瘤，是最常见的脑肿瘤，占16％。根据WHO分类，胶质母细胞瘤被归类为与预后不良相关的IV级肿瘤。由于胶质母细胞瘤表现出明显的浸润性生长，因此不可能通过手术切除肿瘤来治愈。目标是尽可能完整地通过手术减少肿瘤块。因此，根据欧洲癌症研究和治疗组织和加拿大国家癌症研究所临床试验组(EORTC-NCIC)协议(Javamanne et al 2018)，建议使用放疗与化疗相结合的辅助治疗。然而，辅助治疗最早在手术后4周开始，当手术伤口愈合过程已经取得进展。目前的治疗标准是替莫唑胺(Davis 2016)，一种具有遗传毒性和致畸性的口服烷化化疗药物。如上所述，作为佐剂的Gliadel

然而，在胶质母细胞瘤中，手术腔洞的大小和形状因人而异。然而，手术腔洞的大小也只有几毫升，与肾上腺皮质癌和卵巢癌的大小相当。然而，形状是不同的，并且与大小一样个性化。此外，部分切除几乎只在胶质母细胞瘤的情况下进行。

对于根据本发明在胶质母细胞瘤的用途，使用工具例如刷子来应用到伤口边缘的凝胶状制剂也是特别合适的。1至5毫升的凝胶体积优选包含70微克，特别优选包含多于250或1000微克，或5、25或100毫克。凝胶在几周内降解，从而连续释放寡核苷酸。寡核苷酸可以包装在颗粒或脂质体中，使得其只有在载体被细胞降解或吸收时才缓慢释放。颗粒的降解速率可能受生产参数(例如交联度)的影响。优选大于1周的体内半衰期，特别优选2周、4周、3个月或全年的半衰期。

在另一个示例性实施例中，使用例如由胶原蛋白制成的弹性载体，其被引入到手术腔洞中并且完全或部分地膨胀到手术腔洞的体积。一种或多种载体含有优选含量多于70微克，特别优选含量多于250或1000微克，或5、25或100毫克的寡核苷酸。一种或多种载体会在几周内被身体降解，从而持续释放寡核苷酸。

凝胶或弹性载体的降解速率可以通过生产参数来控制，在胶原蛋白的情况下，例如通过胶原蛋白的交联度。优选大于1周的体内半衰期，特别优选2周、4周和3个月的半衰期。

在胶质母细胞瘤的情况下，寡核苷酸的液体制剂也可能是有利的，因为不知道胶质母细胞瘤是否也以浸润以外的方式扩散。在胶质母细胞瘤的情况下，注射体积例如为20ml，优选包含多于70微克，特别优选多于250或1000微克，或5、25或100毫克的寡核苷酸。寡核苷酸可以包装在颗粒或脂质体中，使得其只有在载体被细胞降解或吸收时才缓慢释放。颗粒的降解速率可能受生产参数(例如交联度)的影响。优选大于1周的体内半衰期，特别优选2周、4周和3个月的半衰期。

在胶质母细胞瘤的情况下，可以优选使用气溶胶中的寡核苷酸，特别是含量为25或70微克，特别优选含量多于250或1000微克，或5、25或100毫克的寡核苷酸。

使用表现出更简单几何形状的载体也可能是有利的，寡核苷酸经过较长一段时间，特别是经过几天，从该载体中洗脱。可通过身体吸收的载体，例如柔性箔或棒，是特别有利的。较小的颗粒载体可以应用在网中(例如纱布网)或水凝胶中。另一个例子是Gliadel中使用的晶片。

使用寡核苷酸作为佐剂与辅助细胞生长抑制剂(例如替莫唑胺)、与细胞疗法(例如DCVax)的组合以及与放射的组合可能是优选的。

实施例：腹膜癌

腹膜癌是指腹膜被多种恶性肿瘤细胞侵染。腹膜癌的病因通常不是腹膜本身的肿瘤，而是腹部其他器官的恶性肿瘤。最常见的是，如上所述，这是胃肠道、胰腺或卵巢的晚期转移性肿瘤。在某些情况下，无法识别原发性肿瘤(https://flexikon.doccheck.com/de/Peritonealkarzinose)。

每10万人15-20例，腹膜癌很少发生，但有增加趋势；在德国，每年约有35,000例新病例(Glockzin et al 2007)。腹膜癌的终生预后平均为诊断后约6个月。

除非是晚期，腹膜癌的治疗越来越多地采用多模式疗法，结合外科细胞减灭术和术中腹腔热灌注化疗(Piso et al.,2011)。如上所述，也使用PIPAC。

与肾上腺皮质癌和卵巢癌相比，由于受影响的器官的数量不同，手术腔洞的大小差异很大。然而，凝胶的使用对于这些体积是有利的，并且其中凝胶是使用工具例如刷子进行应用的；优选浓度为每毫升凝胶多于15或70微克，特别优选浓度为每毫升凝胶多于250或1000微克，或5、25或100毫克。

在大体积切除的情况下，总体积对应于所切除的器官的总体积的弹性载体不再有用。取而代之的是，优选使用扁平载体，例如薄膜、箔或纱布，直接携带寡核苷酸，包装在颗粒例如脂质体中，缀合或配制成凝胶。优选每平方厘米10微克的装填密度，特别优选每平方厘米50或200微克，或每平方厘米1、5或20毫克寡核苷酸的密度。优选将寡核苷酸应用于植入物，例如在横膈膜切除后使用的那些具有相同寡核苷酸密度的植入物。

同样在腹膜癌的情况下，可以优选使用具有更简单几何形状的支撑物，特别是如果寡核苷酸在较长的一段时间内，特别是几天，从这些支撑物中洗脱。通过身体吸收的载体，例如柔性箔或棒，是特别有利的。较小的颗粒载体可用于网(例如纱网)或用于水凝胶。

在腹膜癌中，可以优选使用气溶胶中的寡核苷酸，特别是含量为70微克，特别优选含量多于250或1000微克，或5、25、100或1000毫克的寡核苷酸。

使用寡核苷酸作为佐剂与辅助疗法(例如卡铂和培美曲塞)的组合以及与放射疗法的组合可能是优选的。

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