包含活微生物的局部组合物

技术领域

本发明涉及包含微生物的局部组合物。特别是本发明涉及一种包含活微生物的局部组合物，其组成是稳定的，在皮肤上应用时可以激活。

背景技术

人们对益生菌的使用存在着相当大的兴趣。益生菌是活微生物，在适当水平下施用时，为宿主带来健康益处。然而，为了发挥这些益处，微生物必须在产品的加工和储存过程中保持活力。为稳定益生菌以在用于口服时确保对胃肠道液体的耐药性，已经进行了大量研究。由于益生菌对多种因素敏感，包括氧气和酸性介质的存在，因此研究了微胶囊化作为提高益生菌细胞活力的方法。

益生菌的微胶囊化是这样的过程，其中益生微生物被保护它们的聚合物膜包围，在某些情况下，允许它们在特定条件下释放。通常用于益生菌胶囊化的技术是挤出、雾化或喷雾干燥、乳化、凝聚和固定在脂肪、多糖或淀粉颗粒中。藻酸盐、结冷胶、K-卡拉胶和淀粉等多糖是双歧杆菌和乳杆菌微胶囊化中最常用的材料。

因此，微生物的微胶囊化在本领域中是众所周知的，然而，这些技术不是为局部使用而开发的，并且传统上生产的微胶囊被设计成溶解在肠道中，从而在肠道而不是在皮肤上释放微生物。当现有技术的微胶囊应用于皮肤时，皮肤上的状况不会溶解胶囊并释放活的微生物。

WO18002248公开了在两室系统中配制微生物的概念，一旦两个室的内容物结合，保护内室的微生物免受外室中的成分的影响，这种微胶囊化是局部使用的，然而，这种封装仍然包括可与皮肤接触的大小的微胶囊，需要将其揉入皮肤以破坏胶囊。未因摩擦而破裂的胶囊不会将活微生物释放到皮肤表面。

局部应用活益生菌的使用非常有限，大多数产品基于益生菌菌株的裂解物(灭活的死细菌)(WO8200093)，以克服维持局部组合物中微生物活力的问题。

因此，期望解决上述现有技术问题的改进制剂，该制剂包含油、乳液、洗剂等中的活益生菌菌株，用于局部施用到哺乳动物的皮肤上。特别地，包含活益生菌菌株的改进的制剂将是有利的，该制剂是稳定的并且当施用于皮肤时能够被激活。

本发明涉及包含微生物的局部组合物。特别地，本发明涉及包含活微生物的局部组合物，该组合物具有长的保质期，是稳定的并且当施用于皮肤时可以被活化。

发明内容

因此，本发明的目的涉及包含活微生物的局部组合物。

特别地，本发明的目的是提供局部组合物，其解决了现有技术的上述问题，具有活微生物的存在、长的保质期和高稳定性以及当施用于哺乳动物的皮肤时被激活的效果。

因此，本发明的一个方面涉及包含围绕组合物的脂肪基包衣的微胶囊，所述微胶囊提供包封的组合物，包封的组合物包含活微生物和含量低于5％(w/w)的水。

本发明的另一方面涉及包含根据本发明的微胶囊的局部组合物。

本发明的另一方面涉及用作药物的包含根据本发明的微胶囊或根据本发明的局部组合物的组合物。

本发明的又一方面涉及包含根据本发明的微胶囊或根据本发明的局部组合物的组合物，用于治疗、缓解和/或预防皮肤病。

本发明的又一方面涉及提供根据本发明的微胶囊的方法，其中该方法包括以下步骤：

(i)提供包含活微生物的组合物；

(ii)向包含活微生物的组合物中添加脂肪，提供脂肪混合微生物；

(iii)混合脂肪混合微生物，提供根据本发明的微胶囊。

附图说明

图1示出了具有中心(1)的颗粒的特写图，该中心包含被脂肪基包衣(2)包围的活冻干乳酸菌，

图2示出了储存3个月后的根据本发明的脂肪包封的冻干乳酸菌(LAB)。

下面将更详细地描述本发明。

具体实施方式

本发明的发明人发现，如果可以在制剂中保持微生物的成活力(viability)，那么益生菌在局部制剂中的使用可能具有巨大的潜力。然而，发现局部制剂(如霜剂、洗剂、喷雾剂)本身含有高含量的水，即为了适当地配制成霜剂、泡沫、洗剂、软膏等。显然，在这些配方中如此高含量的水的存在，对处于代谢不活跃状态下的益生菌的储存带来了问题。在此类水性局部制剂中出现的第二个问题可能是这些制剂通常含有与微生物存活不相容的试剂；例如防腐剂、表面活性剂、乳化剂和其他成分，以保护此类制剂免受不需要的微生物的生长的影响以及形成稳定的乳液。然而，这些试剂当然也会在有益微生物的配制中形成主要问题。

因此，开发用于药物或化妆品目的的局部制剂和产品以具有长保质期并且对微生物引起的污染和腐败保持稳定是非常需要的。

因此，本发明的目的是提供一种允许微生物，特别是活微生物长期储存的系统或制剂，其在使用时基本上不会伤害这些微生物，并且当施加于皮肤上时确实释放活微生物。

本发明的优选方面涉及包含围绕组合物的脂肪基包衣的微胶囊，所述微胶囊提供包封组合物，包封组合物包含活微生物和含量低于5％(w/w)的水。

令人惊讶地发现，用脂肪，例如乳脂包覆微生物，乳脂在储存温度下是固体，但在皮肤温度下会融化(当应用于皮肤时)，这既保证了活微生物的稳定性，又保证了微生物在应用于皮肤时立即释放和活化。

在本发明的上下文中，术语“立即”涉及在将包封的微生物施用于皮肤时微生物从脂肪基包衣释放并活化。熔化可能是由将包封的微生物应用于皮肤时的皮肤温度和摩擦产生的热量引起的。

在本发明的上下文中，术语“包衣”涉及围绕活微生物的脂肪层。根据本发明的包衣围绕着活微生物，将包衣内部的活微生物与包衣外部的外部环境完全分开。根据本发明的包衣，其特征在于，在室温下为固体或部分固体并且当施用于哺乳动物的皮肤时溶解。

在上下文中，可互换使用的术语“包埋(embedding)”或“包埋(embedded)”涉及根据本发明的被包覆的微生物在疏水相和/或亲水相中的分散。

在本发明的一个实施方案中，包封的组合物可包含低于5％(w/w)的水；例如低于4％(w/w)；例如低于3％(w/w)；例如低于2％(w/w)；例如低于1％(w/w)；例如低于0.5％(w/w)；例如低于0.1％(w/w)；例如低于0.05％(w/w)；例如低于0.01％(w/w)。

水含量可以通过本领域技术人员已知的Karl Fisher分析来测量。

根据本发明的微胶囊和/或组合物可以制成具有长期稳定性的美味，因为低水分活度(Aw)脂肪基包衣保护干燥的有活力的培养物免受水分影响。一个额外的优势是，脂肪(例如乳脂)用于脂肪基的包衣可能对皮肤有软化作用。

在本发明的另一个实施方案中，微胶囊包含至少10

为了在应用于皮肤时实现适当分布并提供活微生物的快速活化和释放，微胶囊的粒度可能是重要的。

如前所述，根据本发明的脂肪基的包衣的特征在于在室温下为固体或部分固体并且当施用于哺乳动物的皮肤时溶解。因此，在本发明的一个实施方案中，脂肪基包衣具有在25-37℃范围内的熔化温度；例如在28-36℃范围内的熔化温度；例如在29-35℃的范围内的熔化温度；例如在31-34℃范围内的熔化温度。

在本发明的另一个实施方案中，脂肪基的包衣可包含具有至少30％油酸(C18:1)和至少30％硬脂酸(C18:0)的脂肪酸组成的甘油三酯。

优选地，脂肪基的包衣可包含选自乳木果油脂肪、雾冰草(illipe)脂肪、芒果油脂肪、kanya脂和可可油脂肪或其任何组合的脂肪。

甚至更优选地，脂肪基包衣可以是乳木果油脂肪。

根据本发明的包封组合物可以包埋在疏水相中。

在本发明的一个实施方案中，疏水相可以是油。油可以是两种或更多种油的组合，例如三种或更多种油、例如4种或更多油、例如5种或更多油。

在本发明的一个实施方案中，包封的组合物和/或包埋在疏水相中的包封的组合物可以在亲水相中乳化。

大多数微生物的结构和功能可能取决于它们的水性环境。因此，冷冻和/或干燥过程引起的水性环境变化通常会对生物材料产生巨大的影响。

此外，冷冻干燥结合了由于冷冻和干燥引起的应力。该过程的冷冻步骤可能会产生不良副作用，例如蛋白质和酶的变性以及细胞的破裂。这些影响是由这些材料中的冰结晶引起的机械、化学和渗透应力造成的。因此，微生物在再水合时的成活力完全丧失，或达到微生物不再有活性的显著程度。

为了提高包封组合物的稳定性并保持活微生物的稳定性，可以干燥活微生物。

活微生物的干燥可以通过各种方法进行，例如通过冷冻干燥、环境空气干燥、真空干燥或喷雾干燥。优选地，活微生物被冷冻干燥。

为了防止或减少复溶或再水化时的不利影响，可以使用保护剂，例如冷冻保护剂或冻干保护剂(冷冻干燥)。为了在本发明中有效，此类保护剂必须在保存期间的浓度下对微生物无毒，并且它们必须与水和微生物有利地相互作用。本领域中已经使用了各种保护剂，并取得了不同程度的成功。

在本发明的一个实施方案中，包封的组合物可以包含保护剂。保护剂可以是冷冻保护剂、冻干保护剂或其组合。

在本发明的一个实施方案中，包封的组合物包含选自由以下组成的组的保护剂：蛋白质(例如鱼蛋白)；聚合物；脱脂牛奶；甘油；二甲基亚砜；和多羟基化合物。包封的组合物包含保护剂，优选地为多羟基化合物。

在本发明的另一个实施方案中，多羟基化合物可以选自糖或碳水化合物。

在本发明的另一个实施方案中，多羟基化合物可以选自单糖、二糖或多糖。

在本发明的又一个实施方案中，多羟基化合物可以选自麦芽糖；乳糖；蔗糖；海藻糖；脱脂奶粉；葡聚糖；葡萄糖；蛋白胨；谷氨酸盐；聚乙二醇(PEG)；或其任何组合。优选地，多羟基化合物的组合包括蔗糖和海藻糖的组合。

根据本发明的包封组合物包含相对于包封组合物在10-95％(w/w)范围内的保护剂，例如在20-80％(w/w)范围内；例如在30-70％(w/w)的范围内；例如在40-60％(w/w)的范围内；例如在45-55％(w/w)的范围内。

保护剂(例如多羟基化合物)的量可以根据保护剂中存在的量和/或包含活微生物的组合物中存在的量来确定。或者，包封组合物中保护剂(例如多羟基化合物)的量可以通过本领域已知的分析方法例如柱色谱法确定。

在本发明的一个实施方案中，包封的组合物还可包含盐，例如磷酸盐(例如磷酸钠)。磷酸钠可优选为磷酸氢钠；磷酸氢二钠；或两者的结合。

本发明的一个优选方面涉及包含根据本发明的微胶囊的局部组合物。

在本发明的一个实施方案中，局部组合物可以是包含亲水相和疏水相的乳液。疏水相包含根据本发明的微胶囊。

亲水相可占局部组合物的5-75％(w/w)；例如10-50％(w/w)；例如15-40％(w/w)；例如20-30％(w/w)。

在本发明的又一个实施方案中，局部组合物包含5-75％(w/w)水；例如10-50％(w/w)水；例如15-40％(w/w)水；例如20-30％(w/w)水。

本发明的局部组合物包含防腐剂；表面活性剂和/或乳化剂。优选地，防腐剂；表面活性剂和/或乳化剂存在于油或亲水相中，优选地存在于亲水相中。

在本发明的上下文中，术语“脂肪基包衣”和“脂肪”涉及主要包含碳和氢原子的物质，其是疏水的并且可溶于有机溶剂且不溶于水。

根据本发明的脂肪基包衣可以优选地在室温下基本上是固体并且刚好在体温下在皮肤上熔化。如本文所用，“室温”通常是指室内温度，通常接近约20℃。典型的包衣脂肪将具有约25℃至约37℃的熔点。

在一个优选的实施方案中，脂肪在低于25℃的温度下是固体或部分固体。

在一个实施方案中，脂肪基包衣或脂肪可以选自乳木果油脂肪、雾冰草脂肪、可可油脂肪、芒果油脂肪、kanya油脂肪。优选地，脂肪基包衣或脂肪的特征可以在于构成基本上连续的脂肪相。

优选地，微生物可以是益生菌培养产品。进一步优选的是，本文公开的益生菌培养产品基本上保持干燥，并且它们包含不超过痕量的水。在加工中使用大量的水通常与包衣脂肪和产品稳定性不相容。

包含活微生物的脂肪包封组合物可作为脂肪组合物直接用于局部应用。

包含活微生物的脂肪包封组合物可进一步加工(包埋)到液体油中，其中包含微生物的脂肪包封组合物的浓度为包埋组合物的0.1至95％。

包含活益生菌的脂肪包封组合物可进一步加工到乳液中，该乳液包含乳液的0.1至95％的亲水相。

可以将包含活益生菌的包含脂肪包封组合物(所述包埋组合物)的油进一步加工到乳液中，该乳液包含乳液的0.1至95％的亲水相。

在本发明的一个优选实施方案中，局部组合物是由亲水相和疏水相组成的乳液，其中疏水相包含脂肪包封的组合物，该组合物包含活微生物。

乳化剂可用于稳定局部组合物和/或局部乳液，用于局部乳液的乳化剂是本领域已知的并且可以选自富含磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺或两者的分级卵磷脂；其甘油单酯和甘油二酯；食用脂肪或油的甘油单酯和甘油二酯的磷酸一钠衍生物；甘油和丙二醇的乳酸化脂肪酸酯；羟基化卵磷脂；脂肪酸的聚甘油酯；丙二醇；脂肪和脂肪酸的单酯和二酯；DATEM(甘油单酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯)；PGPR(聚甘油聚蓖麻油酸酯)；聚山梨醇酯20、40、60、65和80；脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；脱水山梨糖醇三硬脂酸酯；燕麦提取物等。乳化剂不受此列表的限制。

本发明可以涉及活的或活性微生物，包括任何细菌、古生菌、噬菌体、病毒、酵母或真菌或其任何组合。

在本发明的一个实施例中，活微生物可以是益生微生物。

合适的益生微生物的实例可以包括酵母菌(例如酿酒酵母菌、德巴利酵母菌、假丝酵母菌、毕赤酵母菌和球拟酵母)、霉菌(例如曲霉菌、根霉菌、毛霉菌、和青霉菌和球拟酵母菌)以及细菌(例如以下属：双歧杆菌、类杆菌、梭状芽孢杆菌、梭形杆菌、蜜蜂球菌、丙酸杆菌、链球菌、肠球菌、乳球菌、葡萄球菌、消化链球菌、芽孢杆菌、片球菌、微球菌、明串珠菌、魏斯氏菌、气球菌、酒球菌和乳杆菌)。合适的益生微生物的具体例子是：酿酒酵母、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、消化乳杆菌、干酪乳杆菌亚种、干酪乳杆菌代田株、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、香肠乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(乳杆菌GG)、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、变异微球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、嗜盐片球菌、粪链球菌、嗜热链球菌、肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌。

根据本发明的益生微生物可优选为粉末形式、干燥形式或孢子形式(用于形成孢子的微生物)。在本发明的一个实施方案中，益生微生物或活微生物可以是乳酸菌(LAB)的菌株。特别地，益生微生物或活微生物可以是乳酸菌(LAB)菌株，其选自以下属：乳杆菌、明串珠菌、双歧杆菌、片球菌、乳球菌、链球菌、气球菌、肉食杆菌、肠球菌、酒球菌、芽孢乳杆菌、四联球菌、漫游球菌和魏斯氏菌。

益生微生物或活微生物可包括乳杆菌科、气球菌科、肉食杆菌科、肠球菌科、明串珠菌科和链球菌科。该微生物家族被认为是非致病性的，通常用作益生菌以一般改善胃肠道菌群和治疗胃肠道症状。乳杆菌在食品工业中尤其重要，它们在“功能性食品”领域发挥着重要作用。过去，两歧双歧杆菌种被归入乳杆菌(双歧杆菌)，但根据今天的理解，该物种在亲缘关系上与该目没有密切关系。然而，就新陈代谢而言，它仍然被认为是一种乳酸菌。乳酸菌被归类为非致病菌。

乳酸菌在局部皮肤护理和局部药物产品中也有潜在用途，并且在现有技术中用作死的失活细胞或不稳定的制剂。

本发明涉及在局部组合物中稳定任何活的微生物，例如细菌。细菌优选选自以下属：乳杆菌、明串珠菌、双歧杆菌、片球菌、乳球菌、链球菌、气球菌、肉食杆菌、肠球菌、酒球菌、孢子乳杆菌、四联球菌、漫游球菌和魏斯氏菌。可以优选地是乳杆菌。

优选的微生物可以是细菌。优选地，细菌可以是益生菌。在本发明的一个实施方案中，益生菌可以优选地选自由以下组成的组：乳酸乳球菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、噬淀粉乳杆菌、解淀粉乳杆菌、消化乳杆菌、鸟类乳杆菌、德氏乳杆菌、食二酸乳杆菌、香肠乳杆菌、母鸡乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、希氏乳杆菌、产马乳酒乳杆菌、高加索酸奶乳杆菌、粘膜乳杆菌、面包乳杆菌、类植物乳杆菌、桥乳杆菌、清酒乳杆菌、唾液乳杆菌、旧金山乳杆菌、类干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、丘状菌落乳杆菌、棒状乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、希氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、果囊乳杆菌(Lactobacillus ingluviei)、绿色魏斯氏菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、广布肉杆菌(Carnobacterium divergens)、谷氨酸棒杆菌、柠檬明串珠菌、乳酸明串珠菌、肠膜明串珠菌、假肠膜明串珠菌、酒类酒球菌、Pasteuria nishizawae、乳酸片球菌、糊精乳杆菌、小片球菌、戊糖片球菌、费氏丙酸杆菌、产酸丙酸杆菌、嗜热链球菌、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、摩加夫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、史氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、死亡谷芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或其突变体。

在本发明的另一方面，益生微生物可选自与天然健康皮肤微生物组相关的属，包括丙酸杆菌属、Cutibacterium属、葡萄球菌属、棒状杆菌属、马拉色菌属、曲霉属、隐球菌属、红酵母属和/或黑附菌(Epicoccum)属。

在本发明的一个实施方案中，益生菌菌株可以是表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes,Propionibacterium acnes)或其任意组合。

在本发明的一个实施方案中，益生菌菌株可以是革兰氏阴性菌。

在本发明的另一个实施方案中，益生菌菌株可以是氨氧化细菌。

在本发明的又一个实施方案中，益生菌菌株是亚硝化单胞菌。

在本发明的一个优选实施方案中，包封的组合物包含至少一种选自由以下组成的组的菌株(优选活菌株)：绿色魏斯氏菌(Weissella viridescens)LB10G(DSM 32906)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LB113R(DSM 32907)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LB244R(DSM 32996)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LB116R(DSM32908)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LB28R(DSM 32994)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)LB152G(DSM 32995)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LB316R(DSM 33091)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteriodes)LB349R(DSM 33093)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LB356R(DSM 33094)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LB312R(DSM 33098)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroide)LB276R(DSM32997)或突变株。

在本发明的一个优选实施方案中，脂肪包封的组合物包含选自以下列表但不限于其的活微生物：乳双歧杆菌DSM10140、乳双歧杆菌LKM512、乳双歧杆菌DSM 20451、两歧双歧杆菌BB-225、青春双歧杆菌BB-102、短双歧杆菌BB-308、来自Zaidanhojin NihonBifizusukin Senta(日本双歧杆菌中心(Japan Bifidus Bacteria Center))的长双歧杆菌BB-536、EP2823822中描述的双歧杆菌NCIMB 41675、两歧双歧杆菌BB-225、青春双歧杆菌BB-102、短双歧杆菌BB-308、可从杜邦营养生物科技有限公司(DuPont NutritionBiosciences ApS)获得的乳双歧杆菌HN019(Howaru)、可从达能集团(Groupe Danone)获得的乳双歧杆菌DN 173 010、可从科汉森公司(Chr.Hansen A/S)获得的乳双歧杆菌Bb-12、可从杜邦营养生物科技有限公司获得的乳双歧杆菌420、短双歧杆菌Bb-03、乳双歧杆菌HN019、乳双歧杆菌BI-04、可从杜邦营养生物科技有限公司获得的乳双歧杆菌Bi-07、两歧双歧杆菌Bb-02、两歧双歧杆菌Bb-06、长双歧杆菌KC-1和长双歧杆菌913(杜邦营养生物科技有限公司)、短双歧杆菌M-16V(森永(Morinaga))和/或具有益生作用的乳杆菌，并且可以是以下任何菌株；鼠李糖乳杆菌LGG(科汉森)、嗜酸乳杆菌NCFM(杜邦营养生物科技有限公司)、保加利亚乳杆菌1260(杜邦营养生物科技有限公司)、类干酪乳杆菌Lpc-37(杜邦营养生物科技有限公司)、可从杜邦营养生物科技有限公司获得的鼠李糖乳杆菌HN001(Howaru)、可从杜邦营养生物科技有限公司获得的嗜热链球菌715和嗜热链球菌ST21、类干酪乳杆菌类干酪亚种CRL431(ATCC 55544)、来自医药股份有限公司(Medipharm,Inc.)的类干酪乳杆菌菌株F-19、类干酪乳杆菌LAFTI 126(DSM Food Specialties，荷兰)和类干酪乳杆菌CRL 431(科汉森)、嗜热乳杆菌PTA-4797、唾液乳杆菌Ls-33和弯曲乳杆菌853(杜邦营养生物科技有限公司)。芬兰专利92498,Valio Oy中描述了类干酪乳杆菌鼠李糖亚种LC705。鼠李糖乳杆菌GG(LGG)(ATCC 53103)描述于美国专利5,032,399和鼠李糖乳杆菌LC705(DSM 7061)，丙酸细菌(例如费氏丙酸杆菌谢氏亚种)PJS(DSM 7067)在芬兰专利92498,Valio Oy中有更详细的描述、亚硝化单胞菌D23(ABiome)、人葡萄球菌A9、C2、AMT2、AMT3、AMT4-C2、AMT4-Gl和/或AMT4-D12菌株(均来自Matrisys Bioscience)、表皮葡萄球菌M034、M038、All、AMT1、AMT5-C5和/或AMT5-G6菌株(均来自Matrisys Bioscience)、植物乳杆菌YUN-V2.0(BCCM LMG P-29456)、戊糖乳杆菌YUN-V1.0(BCCN LMG P-29455)、鼠李糖乳杆菌YUN-S1.0(BCCM LMG P-2961)和/或其任何组合。

目前，活益生菌用于局部应用非常有限，产品要么不稳定，要么基于灭活益生菌菌株的裂解物，以克服维持局部组合物中微生物的稳定性和成活力的问题。当在油、血清、乳液、洗剂等中配制用于哺乳动物皮肤局部应用的活益生菌菌株时，从传统制剂观察到的问题是缺乏成活力和稳定性。

用于局部应用的组合物通常在室温下稳定约一个月，这是维持护肤产品中活益生菌的成活力的主要问题。

在本发明的一个实施方案中，局部组合物在25℃下储存时可以稳定至少2个月；例如在25℃下储存稳定至少3个月；例如在25℃下储存稳定至少4个月；例如25℃下储存稳定至少5个月；例如在25℃下储存稳定至少6个月；例如在25℃下储存稳定至少7个月；例如在25℃下储存稳定至少8个月；例如在25℃下储存稳定至少9个月；例如在25℃下储存稳定至少10个月；例如在25℃下储存稳定至少11个月。

观察到的另一个问题可能是当应用于哺乳动物皮肤时益生菌菌株的活化。如果益生菌菌株是微胶囊化的，例如通过遵循用于稳定口服益生菌的程序，微胶囊被设计为保护胃肠液中的活益生菌菌株，因此不会溶解在皮肤表面。因此，益生菌菌株不会从封装中释放，从而不能在皮肤表面上建立益生菌菌株的结合、代谢或定植。

本发明通过将活益生菌菌株封装在固体脂肪基包衣中解决了稳定性问题，该活益生菌菌株可用于局部使用的组合物中。

本发明涉及用于局部施用于哺乳动物皮肤的活微生物。皮肤可能是身体的外层，是外皮系统最大的器官。皮肤有多达七层的外胚层组织，保护着下面的肌肉、骨骼、韧带和内脏。

本发明的发明人惊奇地发现，将活微生物封装在根据本发明的脂肪基包衣中维持了成活力并且促进了对皮肤表面的益生作用。

应当理解，在下文中，与本发明的一个广义方面相关的优选实施例同样适用于上述本发明的其他广义方面中的每一个。将进一步理解的是，除非上下文另有说明，否则可以组合以下描述的优选实施例。当在本文中使用时，术语局部包括指适用于身体表面(特别是皮肤或粘膜)的制剂。在这方面可以提及的粘膜包括阴道、阴茎、尿道、膀胱、肛门、鼻子和耳朵的粘膜。

本发明进一步提供了用于治疗或预防皮肤病的治疗组合物，其包含在适合施用于哺乳动物的皮肤的和/或局部施用在哺乳动物的皮肤或粘膜上的药学上可接受的载体内的治疗有效浓度的一种或多种活物种或菌株，其中所述益生菌菌株具有在室温下在组合物中保持活性并且当施用于皮肤表面时被释放的能力。

在另一方面，本发明涉及包含药学或美容学可接受的载体或赋形剂的组合物。

本发明的组合物可以固体、液体、粘性形式或作为护肤霜存在。该组合物优选为乳液形式。更优选的组合物是霜剂或洗剂。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于人或动物皮肤的局部组合物。

在本发明的一个实施方案中，组合物是包含脂肪包封微生物的洗剂、血清、油或乳液。

根据本发明的组合物可有利地进一步包含其他益生菌、益生元、抗微生物剂、抗生素或其他活性抗菌物质和/或还可优选包含以下物质中的一种或多种：抗氧化剂、维生素、辅酶、脂肪酸、氨基酸和辅助因子。

在本发明的一个实施方案中，组合物是局部药物、兽医用、美容或皮肤护理产品。

所述组合物可优选包含一种或多种增稠剂，其中所述增稠剂可选自纤维素醚、多糖，选自包括以下的组：黄原胶、明胶、高度分散的二氧化硅、淀粉、卡拉胶、藻酸盐、黄芪胶、琼脂、阿拉伯胶、果胶或聚乙烯酯。

此外，该组合物还可包含助洗剂、酶、电解质、pH调节剂、增稠剂、抗氧化剂、益生元、荧光增白剂、灰化抑制剂、泡沫调节剂和/或着色剂。

组合物可包含一种或多种益生元来源，用于益生菌菌株以恢复皮肤表面的新陈代谢。

在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含至少一种用于治疗皮肤病的活益生菌菌株。

本发明的另一个优选方面涉及用作药物的包含根据本发明的微胶囊或根据本发明的局部组合物的组合物。

本发明的另一个优选方面涉及包含根据本发明的微胶囊或根据本发明的任一项的局部组合物的组合物，用于治疗、缓解和/或预防皮肤病。

在本发明的上下文中，术语“皮肤失调”和“皮肤病”可以互换使用并且在症状和严重性方面有很大差异。皮肤失调和皮肤病可能是暂时的或永久性的，可能是无痛的或痛苦的。有些是环境原因，而另一些可能是遗传原因。有些皮肤病症是轻微的，有些则可能危及生命。

如本文所用，并且如本领域所熟知，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果，包括临床结果的方法。出于本主题的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓和或改善、疾病程度的减轻、疾病的稳定(即，不恶化)状态、疾病的预防、延迟或减缓疾病进展、和/或改善或缓解疾病状态。降低可以是并发症或症状的严重程度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。

此外，本发明涉及含有包含微生物的脂肪包封组合物的组合物，特别是用于治疗皮肤失调或皮肤病，用于局部使用的产品中。

在本发明的一个实施方案中，皮肤病可以选自包括以下皮肤病的组：牛皮癣、特应性皮炎、干性皮肤、敏感皮肤、易长粉刺的皮肤、色素沉着过度的皮肤、老化皮肤、过敏、湿疹、皮疹、受紫外线刺激的皮肤、光损伤皮肤、受洗涤剂刺激的皮肤(包括洗涤剂中使用的酶和十二烷基硫酸钠引起的刺激)、红斑痤疮和变薄的皮肤(例如老人和儿童的皮肤)。

在另一个实施方案中，根据本发明的组合物可用于美容护肤。

在本发明的另一个实施方案中，包含脂肪包封组合物的组合物可用于患有炎性皮肤病的患者的皮肤，所述脂肪包封组合物包含至少一种根据本发明的益生微生物。

在本发明的又一个实施方案中，包含含有至少一种益生微生物的脂肪包封组合物的组合物可用于患有炎性皮肤病的患者的皮肤，其中脂肪包衣是对皮肤具有抗炎作用的脂肪。

在本发明的一个实施方案中，包含含有至少一种益生微生物的脂肪包封组合物的组合物可用于患有炎性皮肤病的患者的皮肤，其中脂肪涂层是乳木果(非洲酪脂树种子)油脂肪。

在本发明的另一个实施方案中，皮肤病可能与特应性皮炎、湿疹、脓疱疮、痤疮、烧伤、尿布疹、伤口有关。

本发明的组合物可缓解性、治疗性或预防性使用，例如，作为皮肤或粘膜的益生治疗。

在本发明的一个实施方案中，组合物可以是局部组合物。本发明的组合物的pH值可以在约3和约8之间。更优选的pH值在4-7之间，甚至更优选的pH值在4.5-6.5之间。

天然乳脂包含天然抗氧化剂，在本发明的一个实施方案中，可以将另外的抗氧化剂加入到组合物中。抗氧化剂可以优选为维生素E(0.25至2.5重量％)和/或迷迭香提取物(0.1至0.75重量％)。

与配制组合物时测定的成活力相比，成活力的“降低”可以是“统计学显著的”。成活力的降低可以测量为对数降低并且可以包括5或更少的对数降低；例如4.5或更少；例如4或更少；例如3.5或更少；例如3或更少；例如2.5或更少；例如2或更少；例如1.5或更少；例如1或更少；例如0.5或更少；例如0.1或更少。

微生物的“成活力”以菌落形成单位CFU/ml来衡量。

微生物成活力的“降低”可以确定为与配制组合物时的CFU/ml相比CFU/ml的差异。

本发明的微生物可以是分离的或纯化的形式。在本文中，术语“分离的”是指微生物可以源自它们的培养基，例如，包括它们的天然培养基。术语“纯化”不限于绝对纯度。

微生物可以有利地以活的喷雾干燥和/或冻干形式存在。

优选地，益生菌菌株可以以干燥形式用作活的分离微生物。先前已经描述了用于冷冻保护的合适方法。

在本发明的上下文中，术语“活”和“活性的”可以互换使用。

在本发明的优选实施方案中，微生物可用作活的分离的冻干微生物。

微生物可以按重量计0.001％(w/w)至20％(w/w)，优选地0.005％(w/w)至10％(w/w)，特别优选地0.01％(w/w)到5％(w/w)的量存在于组合物中。

本发明的一个实施方案涉及每克组合物施用大约1x10

在本发明的又一个实施方案中，组合物中活益生微生物的剂量可以高于每克组合物约1x10

令人惊讶地发现，尽管皮肤微生物组中存在其他微生物种类，但根据本发明的微生物可能能够在皮肤上活化并重新建立代谢活性。

本领域技术人员将清楚，这里以及在本发明中给出的范围的所有陈述中，以诸如“大约”或“约”等术语为特征，不需要用诸如“大约”或“大致”或“接近”之类的表达方式指明精确的数值范围，但相反，即使是关于所指示的数字的向上或向下的微小偏差仍然在本发明的范围内。在本上下文中，微小偏差涉及5％或更少的偏差；例如4％或更少的偏差；例如3％或更少的偏差；例如2％或更少的偏差；例如1％或更少的偏差；例如0.5％或更少的偏差；例如偏差为0.1％或更小。

“哺乳动物”包括但不限于人类、灵长类动物、农场动物、运动动物(sportanimal)、啮齿动物和宠物。非人类动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、兔子、狗、猫、羊、猪、仔猪、母猪、家禽、火鸡、肉鸡、貂、山羊、牛、马、以及非人类灵长类动物(例如猿和猴子)。

优选地，该组合物可以局部用于人类皮肤。

“有效量”取决于其应用的上下文。在施用根据本发明的组合物的情况下，有效量可以是添加以CFU/克确定的对皮肤具有益生作用的许多活微生物。

在本发明的一个实施方案中，微胶囊和/或包含含有微生物的包封组合物的组合物可包含益生化合物。“益生化合物”或“益生元”是促进特定微生物生长的成分。“合生元”是包含至少一种益生菌和至少一种益生化合物的组合物。此类组合物被理解为促进有益微生物(例如益生菌)的生长。因此，强大的合生元是基于益生微生物的特定菌株与精心挑选的益生元的组合。它们可以为哺乳动物带来重要的健康益处。

益生元是指诱导共生皮肤微生物(例如细菌和真菌)生长和/或活性的化学产品，这些微生物有助于宿主的健康。益生元刺激在皮肤上定植的有益细菌的生长和/或活性。因此，益生元可以作为益生菌的食物来源。益生元是本领域众所周知的。

在本发明的一个实施方案中，益生元可以选自碳水化合物、葡聚糖、α-葡聚糖、β-葡聚糖、甘露寡糖、菊粉、低聚果糖、人乳低聚糖(HMO)、低聚半乳糖(GOS)、乳果糖、低聚乳果糖、半乳三糖、低聚果糖(FOS)、纤维二糖、纤维糊精、环糊精、麦芽糖醇、乳糖醇、葡糖基蔗糖(glycosilsucrose)、甜菜碱、维生素E或其变体(其中变体选自α、β、γ、δ生育酚、生育三烯酚和生育单烯酚)。任选地，可以优选甘露寡糖和/或菊粉。

HMO可能包括乳-N-四糖、乳-N-岩藻五糖、乳-N-丙糖、3'-唾液酸乳糖、乳-N-新岩藻糖五糖、唾液酸、L-岩藻糖、2-岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸乳糖、乳-N-新四糖和3-岩藻糖基乳糖。

在本发明的一个实施方案中，至少一种以下益生化合物用于本发明的局部组合物中：乳糖、β-葡聚糖、甘露寡糖、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖(GOS)、乳果糖、低聚乳果糖、半乳三糖、低聚果糖(FOS)、纤维二糖、纤维糊精、环糊精、麦芽糖醇、乳糖醇、葡糖基蔗糖、甜菜碱、维生素E或其变体(其中变体选自α、β、γ、δ生育酚、生育三烯酚和生育单烯酚)、乳-N-四糖、乳-N-岩藻糖五糖、乳-N-丙糖、3'-唾液酸乳糖、乳-N-新岩藻糖五糖、唾液酸、2-岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸乳糖、乳-N-新四糖和3-岩藻糖基乳糖。任选地，可以优选乳糖和/或甘露寡糖和/或菊粉。

岩藻糖，特别是L-岩藻糖，可能是优选的，因为该化合物被认为加强皮肤的天然防御、刺激表皮免疫防御和/或预防和/或治疗皮肤自身免疫疾病。在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含L-岩藻糖和/或D-岩藻糖。

在本发明的一个实施方案中，组合物进一步包含在组合物中浓度为10mM至500mM的L-岩藻糖和/或D-岩藻糖。

根据本发明的包含本发明包封微生物的组合物可以进一步包含至少一种选自细菌、古生菌、噬菌体、病毒、酵母或霉菌的另外的益生微生物。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含本发明的包封微生物和至少一种其他菌株，其中至少一种其他微生物可以选自：

双歧杆菌可以是具有益生作用的任何双歧杆菌，通常使用属于以下种的菌株：动物双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌和青春双歧杆菌。一种或多种活乳双歧杆菌活菌株选自但不限于乳双歧杆菌BI-04、乳双歧杆菌Bi-07、乳双歧杆菌420、乳双歧杆菌DN 173 010、乳双歧杆菌Hn019、乳双歧杆菌Bb-12、乳双歧杆菌DR10、乳双歧杆菌DSM10140、乳双歧杆菌LKM512、乳双歧杆菌DSM 20451、两歧双歧杆菌BB-225、青春双歧杆菌BB-102、短双歧杆菌BB-308、来自Zaidanhojin Nihon BifizusukinSenta(日本双歧杆菌中心)的长双歧杆菌BB-536、EP2823822中描述的双歧杆菌NCIMB41675。两歧双歧杆菌BB-225、青春双歧杆菌BB-102、短双歧杆菌BB-308、可从杜邦营养生物科技有限公司获得的乳双歧杆菌HN019(Howaru)，可从达能集团获得的乳双歧杆菌DN 173010，可从科汉森公司获得的乳双歧杆菌Bb-12、可从杜邦营养生物科技有限公司获得的乳双歧杆菌420、可从杜邦营养生物科技有限公司获得的短双歧杆菌Bb-03、两歧双歧杆菌Bb-02、两歧双歧杆菌Bb-06、长双歧杆菌KC-1和长双歧杆菌913(杜邦营养生物科技有限公司)、短双歧杆菌M-16V(森永)和/或具有益生作用的乳杆菌，并且可以是以下任何菌株:鼠李糖乳杆菌LGG(科汉森)、嗜酸乳杆菌NCFM(杜邦营养生物科技有限公司)、保加利亚乳杆菌1260(杜邦营养生物科技有限公司)、类干酪乳杆菌Lpc-37(杜邦营养生物科技有限公司)、可从杜邦营养生物科技有限公司获得的鼠李糖乳杆菌HN001(Howaru)、可从杜邦营养生物科技有限公司获得的嗜热链球菌715和嗜热链球菌ST21、类干酪乳杆菌类干酪亚种CRL431(ATCC55544)、来自医药股份有限公司的类干酪乳杆菌F-19菌株、类干酪乳酸菌LAFTI L26(DSMFood Specialties，荷兰)和类干酪乳酸菌CRL 431(科汉森)、嗜酸乳杆菌PTA-4797、唾液乳杆菌Ls-33和弯曲乳杆菌853(杜邦营养生物科技有限公司)。干酪乳杆菌鼠李糖亚种LC705描述于芬兰专利92498,Valio Oy。鼠李糖乳杆菌GG(LGG)(ATCC 53103)描述于美国专利5,032,399和鼠李糖乳杆菌LC705(DSM 7061)，丙酸细菌(例如费氏丙酸杆菌谢氏亚种PJS(DSM7067))在芬兰专利92498，Valio Oy中有更详细的描述，亚硝化单胞菌D23(ABiome))、人葡萄球菌A9、C2、AMT2、AMT3、AMT4-C2、AMT4-Gl和/或AMT4-D12菌株(均来自MatrisysBioscience))、表皮葡萄球菌M034、M038、All、AMT1、AMT5-C5和/或AMT5-G6菌株(均来自Matrisys Bioscience)、植物乳杆菌YUN-V2.0(Yun NV，BCCM LMG P-29456)、戊糖乳杆菌YUN-V1.0(BCCN LMG P-29455)、鼠李糖乳杆菌YUN-S1.0(BCCM LMG P-2961)及其任何混合物。

优选地，包含包封微生物的组合物还包含至少一种选自由以下组成的组的菌株：绿色魏斯氏菌LB10G(DSM 32906)、植物乳杆菌LB113R(DSM 32907)、植物乳杆菌LB244R(DSM32996)、类干酪乳杆菌LB 116R(DSM 32908)、类干酪乳杆菌LB28R(DSM 32994)、短乳杆菌LB152G(DSM 32995)、植物乳杆菌LB316R(DSM 33091)、肠膜明串珠菌LB349R(DSM 33093)、植物乳杆菌LB356R(DSM 33094)、植物乳杆菌LB312R(DSM 33098)和肠膜明串珠菌LB276R(DSM 32997)或突变株。

在本发明的一个实施方案中，组合物可以包含至少一种选自能够改善紧密连接完整性的乳酸菌的菌株，例如，嗜酸乳杆菌NCFM(杜邦)、唾液乳杆菌Ls-33(杜邦)、乳双歧杆菌420(杜邦)、嗜酸乳杆菌La-14(杜邦)或鼠李糖乳杆菌LGG(科汉森)。

为了获得既作用于皮肤表面上又通过真皮/表皮的产品，可能会提供乳液概念，并且可能需要整合乳液概念。乳液是两种或多种通常不混溶的液体(即油和水)的混合物。乳液是一种称为胶体的两相物质系统的更普遍分类的一部分。虽然术语“胶体”和“乳液”有时可以互换使用，但当分散相和连续相都是液体时使用乳液。在乳液中，一种液体(分散相)分散在另一种液体(连续相)中。

在本发明的一个优选实施方案中，将脂肪包封的微生物悬浮在液体油中并进一步掺入包含水相和油相的乳液中，其中油相包含包封在固体脂肪中的微生物。

本发明的“液体”油是在储存温度下为液体的油，因此液体油具有低于25℃的熔点，例如低于20℃，例如低于20℃，例如低于15℃。

在本发明的一个优选实施方案中，液体油是选自以下的植物油：杏仁油、大麻油(hemp oil)、CBD油、大麻月见草油(cannabis oil Evening prim rose)、琉璃苣油、杏仁甜油、玫瑰果油、荷荷巴金油(Jojoba Golden oil)、甘菊油、金盏花油、沙棘油、红花油和芝麻油。

植物油可以包括以下中的至少一种：巴西莓(acai)、巴西莓(acai berry)、杏仁甜、芦荟、酸渣树、杏仁、山金车、摩洛哥坚果、鳄梨、巴巴苏仁(babassu)、猴面包树、黑莓籽、黑孜然、黑醋栗籽、蓝莓、琉璃苣、巴西坚果、西兰花籽、布里奇果(buriti)、金盏花、山茶籽、大麻油(包括CBD和THC)、芥花(canola)、苦配巴香脂、角栗(Cape Chestnut)(yangu)、胡萝卜(daucus carta)、蓖麻、霞多丽葡萄、大风子(chaulmoogra)、樱桃仁、奇亚籽、繁缕(Chickweed)、椰子、椰子分馏、棉籽、聚合草、玉米、海甘蓝籽、蔓越莓籽、黄瓜籽、蓝蓟籽、鸡蛋、月见草、鸸鹋、亚麻籽、葡萄籽、榛子、大麻籽、七叶树籽、荷荷巴油、卡那其(karanj)籽、猕猴桃籽、夏威夷果、澳洲坚果、马鲁拉(Marula)、药蜀葵(marshmallow)、曼杰提树(manketti)、绣线菊、奶蓟籽、辣木、毛蕊花、芥菜籽、印度苦楝树、橄榄、棕榈、木瓜籽、西番莲籽、桃仁、花生、紫苏、石榴、大裂叶五桤木、南瓜籽、覆盆子籽、米糠、玫瑰果、圣约翰草油、红花、沙棘果肉、乳木果油、烤芝麻、芝麻籽、大豆、向日葵、琼崖海棠(CalophyllumInophyllum)、蓟、番茄、火鸡红、血竭(sangre de drago)、核桃、西瓜籽、小麦胚芽、阿比西尼亚(Abyssinian)、欧洲油菜(colza)、蜂蜡、羊毛脂、亚麻籽、被孢霉油、ongokea、石蜡液、豌豆、Pegui、罂粟籽、巴卡斯、油菜籽、大豆、妥尔(tall)、桐树、婆婆纳、小麦胚芽、角栗(yangu)籽及其任意组合。

用于包覆活微生物的固体脂肪的特征是在储存温度下为固体，在皮肤温度下熔化。

优选地，固体脂肪是天然植物脂肪或黄油。这些脂肪可以是甘油三酯，熔点取决于甘油三酯中脂肪酸的具体组合。因此，可以对脂肪进行化学改性或混合以获得具有本发明特性的混合脂肪组合物。

在本发明的一个实施方案中，混合脂肪或化学改性脂肪可用于包覆活微生物，其特征在于脂肪具有25℃至37℃之间的熔点。

根据另一个实施方案，提供了一种脂肪制剂，包括：固体脂肪油或半固体脂肪油；其中固体脂肪油或半固体脂肪油可包含选自由以下组成的组的补充剂：植物部分、树木、根、种子、仁、坚果、油、脂肪酸、活性成分、植物油、鳄梨、蜂蜡、动物副产品、capuagu、可可、可可黑(cocoa black)、椰子、咖啡、雾冰草、Kokum、芒果、Murumuru、棕榈仁、开心果、乳木果、shealoe、大豆、Tucuma、Ucuuba、Nilotica Shea、Sal(娑罗树)、动物油脂(纯化牛脂，adeps bovis)及其任何组合，导致脂肪组合物的熔点在25℃和37℃之间。

在本发明的一个实施方案中，固体脂肪可以是甘油三酯，其中甘油三酯的脂肪酸组合物包含油酸(C18:1)和硬脂酸(C18:0)。

甘油三酯的脂肪酸可以包含至少30％的油酸(C18:1)和至少30％的硬脂酸(C18:0)。

在本发明的一个实施方案中，固体脂肪可以选自可可油脂肪、雾冰草脂肪、芒果油脂肪、kanya脂肪和/或乳木果脂或其任何组合。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含至少10％的脂肪。

在本发明的另一个实施方案中，组合物包含至少20％的脂肪。

在本发明的又一个实施方案中，组合物包含至少50％的脂肪。

在本发明的另一个实施方案中，固体脂肪包含至少50％的乳木果油脂肪。

在本发明的另一个实施方案中，固体脂肪包含至少75％的乳木果油脂肪。

在本发明的又一个实施方案中，固体脂肪包含至少90％的乳木果油脂肪。

根据本发明的组合物可以是包含亲水相和疏水相的乳液，其中疏水相占组合物的至少50％并且其中疏水相包含脂肪包封的活微生物。

在本发明的一个实施方案中，组合物可以是包含亲水相和疏水相的乳液，其中疏水相包含油和脂肪，其中水:油:脂肪的比例为20-60:30-50:5-20。

在本发明的另一个实施方案中，组合物可以是由亲水相和疏水相组成的乳液，其中疏水相包含油和脂肪，其中水:油:脂肪的比例为5-20:5-30:50-90。

根据本发明的益生微生物能够在哺乳动物皮肤上和/或内增殖和定殖(colonizing)。

本发明成功地解决了目前已知的局部使用组合物的缺点。已知的局部使用组合物要么不能保持微生物的成活力，要么不能在皮肤表面激活微生物。

本发明提供了几个优点。特别地，即使在室温下储存，在组合物中也能保持微生物的成活力。被皮肤温度激活的微生物将微生物从包囊释放到皮肤。

根据另一个实施方案，提供了一种封装在熔点约为25-37℃的脂肪中的微生物。包封的微生物可进一步掺入组合物中。当应用于皮肤时，脂肪会融化并释放出活的微生物，其将通过皮肤的水分以及局部组合物中的水分和任何益生元进一步激活。

在另一方面，本发明提供了制备包含脂肪包封微生物的局部组合物的方法。

该方法可包括以下步骤：提供熔点高于25℃的熔融脂肪组合物；将融化的脂肪与干燥的活微生物均匀混合。可将脂肪组合物加热至其熔点或略高于其熔点以提供与干燥微生物的熔化脂肪混合物。在优选的变型中，微生物是冻干培养物。此外，优选地在与熔化的脂肪混合之前将微生物冷却至低于10℃。

重要的是，脂肪组合物的游离水分含量低(即，A

脂肪组合物在冷冻时会凝固，优选地脂肪组合物快速冷冻以避免脂肪结晶。脂肪组合物可以直接用作局部使用的组合物。可以进一步加工包含活微生物的脂肪组合物。

该方法还可包括以下步骤。将包含活微生物的熔化脂肪组合物冷却并在即将凝固之前均匀地混合在油中。然后油将含有脂肪包封的活微生物。包含脂肪包封微生物的油组合物可直接用作局部使用的组合物。

可以进一步加工包含脂肪包封微生物的油组合物。

该方法还可包括以下步骤。包含脂肪包封微生物的油组合物可以与允许乳化的亲水组合物混合，任选地与任何补充的可溶性成分一起混合。脂肪包封的微生物将留在油相中。油相可以是乳液的连续相或不连续相。该乳液将是本发明的局部组合物，其包含脂肪包封的活微生物，其特征在于脂肪包衣的熔点在32至37℃之间。

根据本发明的一个方面涉及提供根据本发明的微胶囊的方法，其中该方法包括以下步骤：

(i)提供包含活微生物的组合物；

(ii)向包含活微生物的组合物中添加脂肪，提供脂肪混合微生物；

(iii)混合脂肪混合微生物，提供根据本发明的微胶囊。

优选地，步骤(i)中提供的包含活微生物的组合物可以在与脂肪混合之前(步骤(ii))进行干燥步骤。干燥步骤可以通过冷冻干燥、环境空气干燥、真空干燥或喷雾干燥进行。优选地，干燥步骤可以通过冷冻干燥进行。

干燥步骤可以持续到包含活微生物的组合物包含低于5％(w/w)的水；例如低于4％(w/w)；例如低于3％(w/w)；例如低于2％(w/w)；例如低于1％(w/w)；例如低于0.5％(w/w)；例如低于0.1％(w/w)；例如低于0.05％(w/w)；例如低于0.01％(w/w)。

为了保护活微生物不被破坏，可以在包含活微生物的组合物进行干燥步骤之前将保护剂添加到包含活微生物的组合物中。

在步骤(ii)中添加的脂肪在被添加到包含活微生物的组合物中之前可以进行熔化。优选地，可以通过将脂肪加热到35-75℃范围内的温度(例如37-65℃、例如40-55℃)来熔化脂肪。

在本发明的一个实施方案中，可以进行脂肪混合微生物的混合(步骤(iii))以提供包含活微生物的包封组合物。脂肪混合微生物的混合(步骤(iii))可以通过搅拌和/或均匀化来进行。

在混合脂肪混合微生物(步骤(iii))之后，可以在混合脂肪混合物之后允许脂肪固化，优选通过冷却至低于37℃的温度(例如低于35℃的温度、例如低于30℃的温度、例如低于25℃的温度、例如低于20℃的温度、例如低于15℃的温度、例如低于10℃的温度、如低于5℃的温度、例如温度低于2℃)。

在本发明的一个实施方案中，可以将油添加到步骤(iii)中提供的微胶囊中，提供包含微胶囊的疏水相。油可以是多种油的混合物。

在本发明的另一个实施方案中，亲水相可以与疏水相混合，形成乳液。

下面提供的是生产用于局部使用的包含脂肪包封微生物的组合物的方法的实例。

方法1：

步骤1；熔化包衣脂肪

步骤2；冷却至脂肪凝固前的温度并添加益生微生物

步骤3；均匀化

步骤4；冷却至凝固

方法2：

步骤1；熔化包衣脂肪

步骤2；冷却至脂肪凝固前的温度，加入益生微生物并均匀化

步骤3；加入液态油并均匀化

步骤4；冷却至凝固

方法3：

步骤1；熔化包衣脂肪

步骤2；冷却至脂肪凝固前的温度，加入益生微生物并均匀化

步骤3；加入液态油并均匀化

步骤4；与亲水相混合以形成乳液

步骤5；冷却至凝固

方法4：

步骤1；熔化包衣脂肪

步骤2；冷却至约37℃的温度，加入冻干的益生微生物并均匀化

步骤3；加入液态油并均匀化

步骤4；与亲水相混合以形成乳液

步骤5；冷却至凝固

步骤6；存放在密封容器中

应当注意，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施例和特征也适用于本发明的其他方面。

本申请中引用的所有专利和非专利参考文献通过引用整体并入本文。

现在将在以下非限制性实施例中更详细地描述本发明。

示例

示例1

方法2：

步骤1；熔化脂肪

步骤2；冷却至约37℃的温度，加入冻干的益生微生物并均匀化

步骤3；加入液态油并均匀化

步骤4；与亲水相混合以形成乳液

步骤5；冷却至凝固

表1中给出了步骤1中使用的脂肪。

表1：脂肪和甘油三酯的主要脂肪酸组成。

示例中使用的微生物是鼠李糖乳杆菌LBB(科汉森)、绿色魏斯氏酸LB10G(DSM32906)、植物乳杆菌LB113R(DSM 32907)、植物乳杆菌LB244R(DSM 32996)、类干酪乳杆菌LB116R(DSM 32908)、类干酪乳杆菌LB28R(DSM 32994)、短乳杆菌LB152G(DSM 32995)和肠膜明串珠菌LB276R(DSM 32997)。微生物是冻干的活菌株，除了使用活的新鲜培养的肠膜明串珠菌LB276R(DSM 32997)和鼠李糖乳杆菌LBB(科汉森)菌株在MRS培养基中生长并通过离心收获并测试在不同脂肪中的成活力的一项实验之外。

步骤3中使用以下油；

样品1：杏仁油

样品2：琉璃苣油

样品3：甜杏仁油

样品4：玫瑰果油

样品5：荷荷巴金油

样品6：甘菊油

样品7：金盏花油

样品8：沙棘油

样品9：红花月见草油

样品10：芝麻油

使用以下添加剂：

三十烷基

蜂蜡

聚山梨酯40、60或80

卵磷脂

丙三醇

生育酚

菊粉

乳糖

L-岩藻糖

α-葡聚糖寡糖

可以在步骤1、3或4中添加添加剂。

在不同的脂肪和油中测定菌株的成活力。发现所有测试菌株在5种脂肪中都是稳定的，尤其是在乳木果油中，在25℃下测试3天后，没有任何冷冻干燥菌株失去成活力。

一些油(例如沙棘油和玫瑰果油)具有抗菌活性，为了保持在这些油中菌株的成活力，重要的是在混合到油中之前将有活力的菌株包埋到脂肪中。

示例2

以下组合物按照上述方法4制备。

组合物1：

乳木果油脂肪：10g

冷冻干燥的微生物：1g(对应于最终组合物的大约10

杏仁油：50g

蜂蜡：6g

丙三醇：3.48g

聚山梨酯80：1.16g

水：45.36g

组合物2：

乳木果油脂肪：30g

冷冻干燥的微生物：1g(对应于最终组合物的大约10

杏仁油：50g

蜂蜡：6g

丙三醇：3.48g

聚山梨酯80：1.16g

水：25.36g

组合物3：

乳木果油脂肪：80g

冷冻干燥的微生物：1g(对应于最终组合物的大约10

芝麻油：10g

蜂蜡：6g

丙三醇：3.48g

聚山梨酯80：1.16g

酸化的水(pH 5)10g

生育酚：0.1g

组合物4：

乳木果油脂肪：40g

冷冻干燥的微生物：1g(对应于最终组合物的大约10

杏仁油：10g

荷荷巴油：30g

蜂蜡：6g

丙三醇：3.48g

聚山梨酯80：1.16g

水：20g

菊粉：5g

组合物5：

Kanya油脂肪：50g

冷冻干燥的微生物：1g(对应于最终组合物的大约10

荷荷巴油：15g

三十烷基6g

丙三醇：3.48g

卵磷脂：1g

水：35g

乳糖：5g

α-葡聚糖寡糖：1g

组合物6：

乳木果油脂肪：50g

可可油脂肪：20g

冷冻干燥的微生物：1g(对应于最终组合物的大约10

甜杏仁油：15g

卵磷脂：1g

水：20g

乳糖：5g

L-岩藻糖

组合物7：

乳木果油脂肪：30g

活的收获的微生物：对应于最终组合物的大约10

杏仁油：50g

蜂蜡：6g

丙三醇：3.48g

聚山梨酯80：1.16g

水：25.36g

菊粉：5g

组合物在20℃和25℃下储存在气密瓶中。在1、2、5、7、14、30、60和90天后测定CFU/ml。

所有组合物都是稳定的，在整个测试期间对数减少小于0.5，并且菌株保持成活力。除了包含活的收获的菌株的组合物7在将菌株包覆在脂肪中之前未冷冻干燥。对于组合物7，成活力在1周后下降至约10

示例3

冷冻干燥/冻干微生物的水含量通过Karl Fischer滴定法测定，使用来自默克公司(Merck)的Karl Fischer Aquastar试剂，水标准欧文试剂盒(默克1.88054)并按照试剂盒提供的水测定标准分析在<0.1％至>5％(w/w)的间隔。使用多羟基化合物海藻糖(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)T9449)和蔗糖(西格玛奥德里奇84097)作为冷冻保护剂，通过冷冻干燥的活微生物的脂肪包封来评价冷冻干燥组合物中水含量的影响。植物乳杆菌LB244R在1L MRS中于37℃生长过夜，并通过离心收集产生浓缩的水性细胞团。冷冻保护剂用作植物乳杆菌LB244R(LAB)的含水浓缩细胞团的大约50％，保存介质包含200g的每种冷冻保护剂并且将3.5g NaH

使用前将进料悬浮液在冰浴中储存约30分钟。两个冻干瓶中的每一个都装有250mL的进料悬浮液。通过在干冰中旋转瓶子并连接到在950Pa和55℃下运行的冷冻干燥机(Lyph-Locke 6L，Labconco)，将进料悬浮液快速冷冻15分钟、45分钟、2小时、6小时和24小时(重复为双份)。之后立即分析冻干样品的含水量，并按照上述方法1进行脂肪包封。

用于封装的脂肪组合物为：

乳木果油脂肪(Natura-Tec软有机乳木果精制而成)：10g

冷冻干燥的LAB：1g

杏仁油(Natura-Tec甜杏仁油精制而成)：5g

荷荷巴油(Natura-Tec荷荷巴油精制而成)：5g

蜂蜡(KahlWax有机蜂蜡8139)：1g

丙三醇(默克1295607)1g

脂肪包封的冻干LAB在25℃下保存并在以下时间测试成活力：0、7、21天

脂肪包封前冻干LAB中的水含量越低，获得的储存稳定性越高。

在低含水量下，获得冻干LAB的结晶，并且结晶被封装在脂肪组合物中。

图1示出了脂肪包封的冷冻干燥LAB。

示例4：

在冻干材料的两种不同水含量下测试不同的冷冻保护剂。

微生物用脱脂奶粉(默克70166)

蛋白胨(蔬菜)(默克18332)

葡聚糖(西格玛奥德里奇S6022)

葡萄糖(西格玛奥德里奇G8270)

谷氨酸盐(西格玛奥德里奇G3291)

海藻糖(西格玛奥德里奇T9449)

蔗糖(西格玛奥德里奇84097)

聚乙二醇(PEG)(西格玛奥德里奇81260)

植物乳杆菌LB244R(LAB)在200ml MRS中在37℃下生长过夜，通过离心收获并重新悬浮在50ml磷酸盐缓冲盐水PBS中，与每种冷冻保护剂以1:1混合并且如示例3中所述的冷冻干燥至大约1％和5％(w/w)的水含量的两种不同的含水量，其并通过KF滴定分析确定。将冷冻保护剂与不含冷冻保护剂的对照的稳定性进行比较。

冷冻干燥后，将每个样品封装在脂肪组合物中：

乳木果油脂肪：10g

冷冻干燥的LAB：1g

杏仁油：10g

脂肪包封的冻干LAB的成活力在脂肪包封后立即和在25℃下储存14天后通过平板计数进行半定量确定，使用15％聚山梨醇酯80(吐温)水溶液稀释脂肪包封的冻干LAB。

使用以下量表半定量地确定成活力：

无成活力：-

多于10

多于10

冻干脂肪包封的LAB的成活力严重取决于冷冻保护剂，在没有冷冻保护剂的对照中，脂肪包封的冻干LAB在14天后无法生存(死亡)。在脂肪包封之前使用冷冻保护剂进行冷冻干燥被证明对成活力至关重要，然而，所有测试的冷冻保护剂都有显著的效果，只有少数冷冻保护剂在14天后显示出成活力下降，并且在含水量高(>5％)的冻干LAB观察到这种下降。

示例5：

按照示例3中描述的方法测定脂肪包封的冻干乳酸菌(LAB)的长期稳定性。

使用1:1葡萄糖和蔗糖作为冷冻保护剂将植物乳杆菌LB244R冷冻干燥。植物乳杆菌LB244R在1L MRS中于37℃生长过夜，并通过离心收集产生浓缩的水性细胞团。冷冻保护剂用作植物乳杆菌LB244R(LAB)的含水浓缩细胞团的大约50％，保存介质包含200g的每种冷冻保护剂并将3.5g NaH

使用前将进料悬浮液在冰浴中储存约30分钟。两个冻干瓶中的每一个都装有250mL的进料悬浮液。通过在干冰中旋转瓶子并连接到在950Pa和55℃下运行的冷冻干燥机(Lyph-Locke 6L，Labconco)，将进料悬浮液快速冷冻，并将LAB冷冻干燥至含水量约为0.1％和5％(重复为双份)。之后立即分析冻干样品的含水量，并按照上述方法1进行脂肪包封。

两种不同的脂肪成分用于封装：

脂肪组合物1：

乳木果油脂肪：10g

冷冻干燥的LAB：1g

杏仁油：5g

荷荷巴油：10g

脂肪组合物2：

乳木果油脂肪：5g

可可油脂肪：5g

荷荷巴油：10g

组合物在25℃下储存并且成活力随时间推移成倍。每个样品的成活力每月测定一次，持续9个月。

使用图像分析跟踪长期稳定性。将10μL脂肪包封的冻干LAB置于96微量滴定板的孔中，在37℃下熔化，在顶部加入10μL MRS生长培养基，然后在来自丹麦BioSensesolutions的oCelluScope中随时间推移对生长进行图像分析。1小时后，通过图像分析和检测相对于总数量的封装LAB的生长数量，就可以确定成活力。CFU/g通过使用标准曲线确定。

图2示出了储存3个月后的脂肪包封冻干LAB(脂肪组合物1)。

对于两种测试组合物的方面，冻干脂肪包封的LAB的成活力没有显著差异，但在取决于脂肪包封前冻干LAB的水含量方面，成活力方面看到显著差异。

低水含量(0.1％(w/w))导致脂肪包封的冻干LAB在整个9个月期间保持稳定。

以上描述的目的是为了教导本领域普通技术人员如何利用这里提供的公开内容。不打算详述在阅读说明书后对技术人员来说将变得显而易见的所有那些明显的修改和变型。然而，所有这些明显的修改和变型包括在以下权利要求的范围内。权利要求旨在以能有效实现预期目标的任何顺序覆盖所要求保护的部件和步骤其，除非上下文特别指出相反。