用于亲和纯化的免疫球蛋白结合蛋白

技术领域

本发明涉及包含一个或多个结构域的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白。本发明进一步涉及包含本发明的Ig结合蛋白的亲和基质。本发明还涉及这些Ig结合蛋白或亲和基质用于免疫球蛋白亲和纯化的用途，以及使用本发明的Ig结合蛋白进行亲和纯化的方法。

背景技术

许多生物技术和药物应用需要从含有抗体的样品中去除污染物。捕获和纯化抗体的既定程序是亲和层析，使用来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌细胞表面蛋白A作为免疫球蛋白的选择性配体(参见例如，review by Huse et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 51,2002:217-231)。野生型蛋白A以高亲和力和选择性结合IgG分子的Fc区。具有改进特性如碱性稳定性的蛋白A的变体可用于纯化抗体，并且包含蛋白A配体的各种层析基质可商购获得。然而，目前可用的基于蛋白A的层析基质在暴露于碱性条件后会失去对免疫球蛋白的结合能力。

本发明的技术问题

大多数抗体或含Fc的融合蛋白的大规模生产过程使用蛋白A进行亲和纯化。然而，由于蛋白A在亲和层析中的应用的限制，本领域需要提供具有改进的特性的新Ig结合蛋白，其特异性结合免疫球蛋白以促进免疫球蛋白的亲和纯化。为了最大限度地利用包含Ig结合蛋白的层析基质的价值，需要多次使用亲和配体基质。在层析循环之间，需要进行彻底的清洁程序以消毒和去除基质上的残留污染物。在该程序中，一般的做法是将含有高浓度的NaOH的碱性溶液应用于亲和配体基质。野生型蛋白A结构域不能长时间承受这种苛刻的碱性条件，并很快失去对免疫球蛋白的结合能力。此外，对于亲和配体基质的重复使用，需要在苛刻的酸性条件下进行清洁步骤。

因此，在该领域中持续需要获得能够结合包含Fc序列的蛋白质并承受亲和层析中应用的苛刻清洁条件的新蛋白质。

本发明提供了特别适用于免疫球蛋白的亲和纯化的Ig结合蛋白。特别地，本发明的Ig结合蛋白具有若干优点。本发明的Ig结合蛋白的一个显著优点是它们在高pH值下的延长时间的改善的稳定性，而不会降低Ig结合能力连同高动态结合能力。

以上概述不一定描述本发明解决的所有问题。

发明内容

本发明的一个方面是提供适用于亲和纯化的Ig结合蛋白。

[1]这通过一种包含一个或多个Ig结合结构域的Ig结合蛋白实现，其中至少一个结构域包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:1(cs50)、SEQ ID NO:2(cs52)、SEQ IDNO:3(cs58)、SEQ ID NO:4(cs59)、SEQ ID NO:5(cs60)、SEQ ID NO:6(cs51)、SEQ ID NO:7(cs56)、SEQ ID NO:8(cs54)或SEQ ID NO:10(cs55)中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中的任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[2]根据[1]所述的Ig结合蛋白，其中所述结构域包含如SEQ ID NO:1(cs50)所示的氨基酸序列，或与其至少95％同一性的序列。

[3]根据[1]所述的Ig结合蛋白，其中所述结构域包含如SEQ ID NO:7(cs56)所示的氨基酸序列或与其至少95％同一性的序列，或其中所述结构域包含如SEQ ID NO:10(cs55)所示的氨基酸序列，或与其至少95％同一性的序列。

[4]根据[3]所述的Ig结合蛋白，其中所述结构域包含如SEQ ID NO:8(cs54)或SEQID NO:9(cs57)所示的氨基酸序列。

[5]根据[1]-[4]所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白包含2、3、4、5、6、7或8个彼此连接的结构域。

[6]根据[5]所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白质是同源多聚体或异源多聚体。

[7]根据[6]所述的Ig结合蛋白，其中一个或多个结构域彼此直接连接或通过一个或多个接头彼此连接。

[8]根据[1]-[7]中任一项所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白结合IgG

[9]根据[1]-[8]中任一项所述的Ig结合蛋白，其中所述蛋白质被固定在固体支持物上。

[10]一种亲和分离基质，包含与所述亲和分离基质偶联的根据[1]-[9]中任一项所述的Ig结合蛋白。

[11]根据[1]-[9]中任一项所述的Ig结合蛋白或根据[10]所述的亲和分离基质用于亲和纯化对所述Ig结合蛋白具有亲和力的任何蛋白质的用途。

[12]一种亲和纯化包含Ig序列的蛋白质的方法，所述方法包括：

(a)提供含有包含Ig序列的蛋白质的液体；

(b)提供根据[10]所述的亲和分离基质；

(c)在允许根据[1]-[9]中任一项所述的至少一种Ig结合蛋白与包含Ig序列的蛋白质结合的条件下使所述亲和分离基质与所述液体接触；

(d)从所述亲和纯化基质中洗脱包含Ig序列的所述蛋白质。

[13]根据[12]所述的方法，其中在步骤(d)中，其中大于90％的包含所述Ig序列的蛋白质是从根据[1]-[9]中任一项所述的Ig结合蛋白洗脱的。

[14]根据[12]-[13]所述的方法，包括用碱性清洗液清洗所述亲和纯化基质的所述另外的步骤(e)。

[15]根据[14]所述的方法，其中所述Ig结合蛋白的Ig结合能力是在碱性条件下孵育之前的所述Ig结合能力的至少70％。

本发明的该概述不一定描述本发明的所有特征。通过阅读随后的详细描述，其他实施方式将变得显而易见。

附图说明

图1.新Ig结合蛋白的氨基酸序列。顶行中的数字是指Ig结合蛋白中相应的氨基酸位置。

图1A.SEQ ID NO:17的共有氨基酸序列和SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列。位置3、9、40、43和46中的可变氨基酸以灰色显示。

图1B.SEQ ID NO:18的共有氨基酸序列和SEQ ID NO:7-10的氨基酸序列。位置2、4、7、40、46和53中的可变氨基酸以灰色显示。

图2.固定在Praesto

图3.本发明的Ig结合蛋白的动态结合能力。

图3A.与市售蛋白质树脂MabSelect SuRe相比，显示了Ig结合蛋白的动态结合能力(DBC；mg/ml)。图3B.与MabSelect SuRe相比，提高了Ig结合蛋白的动态结合能力(DBC；mg/ml)。

图4.本发明的Ig结合蛋白的苛性稳定性。图4A.与MabSelect SuRe相比，分析Ig结合蛋白的碱性稳定性。Y轴：在0.5M NaOH孵育24小时后剩余的IgG结合活性，以％计。

具体实施方式

在下面详细描述本发明之前，应理解本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。除非另外定义，否则在本文使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

优选地，本文使用的术语与“生物技术术语的多语言词汇表”中提供的定义一致：(lUPAC建议)",Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.and Kolbl,H.eds.(1995),HelveticaChimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland)。

贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”以及诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”的变体将被理解为暗示包括所陈述的成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组。如在本发明的描述和所附权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”可互换使用，并且意在包括复数形式并落入每个含义内，除非上下文另有明确的说明。此外，如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时缺少组合。

如本文所用，术语“约”包括明确列举的量以及与其的±10％的偏差。更优选地，术语“约”包括5％的偏差。

贯穿本说明书的全文引用了若干文件(例如：专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书等)。本文中的任何内容均不应解释为承认由于在先发明，本发明无权先于这样的公开。本文引用的一些文件特征为“通过引用并入”。如果此类并入的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导之间存在冲突，则以本说明书的正文为准。

本文中提及的所有序列都在所附序列表中公开，其全部内容和公开内容是本说明书的一部分。

在本发明的上下文中，术语“Ig结合蛋白”或“免疫球蛋白结合蛋白”用于描述能够特异性结合免疫球蛋白的蛋白质。如本文所理解的，“免疫球蛋白”或“Ig”可包括但不一定限于，哺乳动物IgG，诸如例如人IgG

根据本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。“特异性结合”是指Ig结合蛋白或Ig结合结构域与其特异性的免疫球蛋白的结合比与另一种非免疫球蛋白靶标的结合更强。

术语“结合活性”是指本发明的Ig结合蛋白结合免疫球蛋白的能力。例如，可以在碱处理之前和/或之后确定结合活性。可以确定Ig结合蛋白或偶联至基质的Ig结合蛋白，即固定的结合蛋白的结合活性。术语“人工”是指非天然存在的物体，即该术语是指由人工生产或修改的物体。例如，由人类(诸如例如，在实验室中通过基因工程、通过改组方法或通过化学反应等)产生或有意修饰的多肽或多核苷酸序列是人工的。

术语“解离常数”或“K

术语“蛋白质”和“多肽”是指通过肽键连接的两个或多个氨基酸的任何线性分子链，而不是指特定长度的产物。因此，“肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语或与这些术语中的任何术语互换使用。术语“多肽”也意指多肽翻译后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、蛋白水解切割、通过非天然存在的氨基酸修饰和本领域公知的类似的修饰。因此，包含两个或更多个蛋白质结构域的Ig结合蛋白也属于术语“蛋白质”或“多肽”的定义。

术语“碱性稳定的”或“碱性稳定性”或“苛性稳定的”或“苛性稳定性”(本文也缩写为“cs”)是指本发明的Ig结合蛋白承受碱性条件的能力而不显著丧失结合免疫球蛋白的能力。本领域技术人员可以通过将Ig结合蛋白与例如氢氧化钠溶液一起孵育，例如实施例中所述，容易地测试碱性稳定性，然后通过本领域技术人员已知的常规实验随后测试与免疫球蛋白的结合活性，例如，通过层析方法。

本发明的Ig结合蛋白以及包含本发明的Ig结合蛋白的基质表现出“增加的”或“改善的”碱性稳定性，这意味着掺入所述Ig结合蛋白的分子和基质相对于参考在碱性条件下稳定延长的时间段。

如本文所用，术语“变体”包括Ig结合蛋白或结构域的氨基酸序列，其通过至少一个氨基酸替换、缺失或插入与另一氨基酸序列不同。这些修饰可以通过基因工程或通过人工进行的化学合成或化学反应产生。

如本文所用，术语“缀合物”涉及包含化学连接至其他物质例如连接至第二蛋白质或非蛋白质部分的至少第一蛋白质或基本上由其组成的分子。

术语“修饰”或“氨基酸修饰”是指氨基酸在多肽序列中的特定位置被另一个氨基酸交换、缺失或插入。鉴于已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，熟练的科学家可以很容易地构建编码氨基酸变体的DNA。

术语“替换”或“氨基酸替换”是指多肽序列中特定位置的氨基酸被另一氨基酸交换。术语“缺失”或“氨基酸缺失”是指去除多肽序列中特定位置的氨基酸。

术语“插入”或“氨基酸插入”是指向多肽序列添加氨基酸。

在本说明书中，氨基酸残基位置编号被指定为对应于例如SEQ ID NO:1-10的那些。

术语“氨基酸序列同一性”是指两种或多种蛋白质的氨基酸序列的同一性(或差异)的定量比较。相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“相同百分比”或“同一性百分比”定义为(如果需要)在比对序列并引入缺口之后，序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，以获得最大的序列同一性百分比。

为了确定序列同一性，将查询蛋白质的序列与参考蛋白质的序列进行比对。比对方法是本领域公知的。序列比对的方法是本领域公知的。例如，为了确定任意多肽相对于参考氨基酸序列的氨基酸序列同一性的程度，优选使用SIM局部相似性程序。对于多重比对分析，优选使用本领域技术人员已知的ClustalW。

序列同一性的程度通常相对于未修饰序列的总长度计算。如本文所用，在两个多肽序列的上下文中，短语“相同百分比”或“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同一性百分比”是指在一些实施方式中具有至少89.5％，在一些实施方式中至少91％，在一些实施方式中至少92％，在一些实施方式中至少93％，在一些实施方式中至少94％，在一些实施方式中至少95％，在一些实施方式中至少96％，在一些实施方式中至少97％，在一些实施方式中至少98％，和在一些实施方式中100％的氨基酸残基同一性的两个或多个序列或子序列，当为最大对应进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查测量的。为清楚起见，例如具有至少89.5％同一性的序列包括同一性高于89.5％同一性的所有序列，例如具有至少89.6％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸同一性的实施方式。在一些实施方式中，同一性百分比存在于至少52个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少53个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少54个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少55个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少56个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少57个残基的区域，在一些实施方式中存在于至少58个残基的区域。

术语“融合”是指组分通过肽键直接或通过肽接头连接。

术语“融合蛋白”涉及包含与至少第二蛋白质遗传连接的至少第一蛋白质的蛋白质。融合蛋白是通过连接两个或多个最初为不同蛋白质编码的基因而产生的。因此，融合蛋白可以包含相同或不同蛋白的多聚体，这些蛋白表达为单个线性多肽。

如本文所用，术语“接头”以其最广泛的含义指共价连接至少两个其他分子的分子。在本发明的典型实施方式中，“接头”应理解为将Ig结合结构域与至少一个另外的Ig结合结构域连接的部分，即，将两个蛋白质结构域彼此连接以产生多聚体的部分。在优选的实施方式中，“接头”是肽接头，即连接两个蛋白质结构域的部分是一个单一氨基酸或包含两个或更多个氨基酸的肽。

术语“层析法”是指使用流动相和固定相将样品中的一种类型的分子(例如免疫球蛋白)与其他分子(例如，污染物)分离的分离技术。液体流动相包含分子混合物，并将这些分子输送穿过或通过固定相(例如，固体基质)。由于流动相中不同分子与固定相的不同相互作用，可以分离流动相中的分子。

术语“亲和层析”是指一种特定的层析模式，其中与固定相偶联的配体与流动相(样品)中的分子(即，免疫球蛋白)相互作用，即配体对分子具有特异性结合亲和力被纯化。如在本发明的上下文中所理解的，亲和层析涉及将含有免疫球蛋白的样品添加到包含层析配体例如本发明的Ig结合蛋白的固定相。

术语“固体支持物”或“固体基质”对于固定相可互换使用。

如本文可互换使用的，术语“亲和基质”或“亲和分离基质”或“亲和层析基质”是指基质，例如层析基质，其上附着有亲和配体，例如本发明的Ig结合蛋白。配体(例如，Ig结合蛋白)能够特异性结合待纯化或从混合物中去除的感兴趣的分子(例如，如上定义的免疫球蛋白)。

如本文所用，术语“亲和纯化”是指通过将如上定义的免疫球蛋白与固定在基质上的Ig结合蛋白结合而从液体中纯化如上定义的免疫球蛋白的方法。因此，除去了混合物中除免疫球蛋白之外的所有其他组分。在进一步的步骤中，免疫球蛋白以纯化的形式被洗脱。

本发明的实施方式

现在将进一步描述本发明。在以下段落中更详细地定义了本发明的不同实施方式。除非明确指出相反的情况，否则下面定义的每个实施方式可以与任何其他实施方式组合。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与任何其他特征或指示为优选或有利的特征组合。

在一个实施方式中，Ig蛋白包含一个或多个结构域，其中至少一个结构域包含SEQID NO:1-10中的任一个的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1-7中的任一个的氨基酸序列，或与其具有至少89.5％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸或基本上由其组成或由其组成。在一些实施方式中，Ig蛋白包含一个或多个结构域，其中至少一个结构域包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸或基本上由其组成或由其组成。本发明的Ig结合结构域是58个氨基酸的三螺旋束，其中螺旋1来自氨基酸残基7-19、螺旋2来自氨基酸残基23-37，并且螺旋3来自氨基酸残基40-56。

本发明的Ig结合蛋白的惊人优点是在极端条件下的稳定性，例如在低pH或高pH(pH 13和更高)下，而不会失去Ig结合特性。如本文所述的Ig结合蛋白表现出延长时间段的碱稳定性而不损害Ig结合特性。此外，它们在低pH值下是稳定的，而不会显著丧失Ig结合特性。在0.5M NaOH中孵育至少24小时后，本发明的Ig结合蛋白的结合能力降低小于30％。对于使用具有高NaOH浓度的碱性溶液去除基质上的污染物的清洁程序的层析方法，该特征非常重要，使得例如，基质可以使用多次。除了高苛性稳定性外，Ig结合蛋白还显示出高偶联效率。此外，亲和层析的重要步骤是洗脱与本发明的Ig结合蛋白结合的蛋白质。该步骤通常在低pH值下进行。本发明的Ig结合蛋白在该处理后不会失去与Ig的结合特性。

在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含一个或多个Ig结合结构域，其中至少一个结构域包含SEQ ID NO:1-7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-7中的任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，其中Ig结合蛋白的Ig结合能力为碱性条件下孵育前的Ig结合能力的至少70％，例如，如通过在0.5M NaOH中孵育至少24小时后剩余的Ig结合能力测定的。

SEQ ID NO:17的氨基酸序列的选定实例是SEQ ID NO:1-6，如图1A中所示。在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的一个或多个结构域，或与其具有至少89.5％序列同一性的序列。例如，与SEQ ID NO:1具有至少89.5％同一性，优选至少95％同一性的氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:2(cs52；与SEQ ID NO:1具有98.3％同一性、SEQ ID NO:3(cs58；与SEQ ID NO:1具有98.3％同一性、SEQ ID NO:4(cs59；与SEQ IDNO:1具有98.3％同一性、SEQ ID NO:5(cs60；与SEQ ID NO:1具有96.6％同一性)和SEQ IDNO:6(cs51；与SEQ ID NO:1具有96.6％同一性)。SEQ ID NO:17的示例性氨基酸序列的氨基酸同一性参见表1。

表1.SEQ ID NO:1-6的氨基酸同一性

IX

SEQ ID NO：18的氨基酸序列的选定实例是SEQ ID NO：7-10，如图1B所示。在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的一个或多个结构域或具有至少92％同一性的氨基酸序列。例如，与SEQ ID NO：7具有至少89.5％同一性的氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO：8(cs54；与SEQ ID NO：7具有96.6％同一性)、SEQ ID NO：10(cs55；与SEQ ID NO：7具有94.8％同一性)和SEQ ID NO：9(cs57；与SEQ ID NO：7具有93.1％同一性)。例如，对于SEQ ID NO：18的氨基酸序列的氨基酸同一性，参见表2。

表2.SEQ ID NO：7-10的氨基酸同一性

在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:1-8中所示的氨基酸序列的一个或多个结构域，或与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少92％同一性的序列。

在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:8(cs54)所示的氨基酸序列的一个或多个结构域，或与其至少92％同一性的序列。在其他实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:10(Cs55)所示的氨基酸序列的一个或多个结构域，或与其至少94％同一性的氨基酸序列，优选与其至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:1-10，优选SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ I D NO:10所示的氨基酸序列的一个或多个结构域，或与SEQ ID NO:1-10中的任一个，优选SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或10中的任一个具有至少95％同一性的序列。在其他实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:9(cs57)所示的氨基酸序列的一个或多个结构域，或与其至少95％同一性，优选至少98％同一性的氨基酸序列。

在其他实施方式中，Ig结合蛋白包含如SEQ ID NO:8、9、10所示的氨基酸序列的一个或多个结构域或与SEQ ID NO:8、9、10中的任一个至少89.5％同一性的序列，条件是对应于位置54的氨基酸是丝氨酸。

在一些实施方式中，多聚体是同源多聚体，例如，Ig结合蛋白的所有Ig结合结构域的氨基酸序列是相同的。

多聚体可以包含两个或更多个Ig结合结构域，其中所述Ig结合结构域优选地包含如上所述的序列或基本上由其组成。二聚体的实例在SEQ ID NO:11(cs58二聚体)、SEQ IDNO:12(cs59二聚体)、SEQ ID NO:13(cs60二聚体)和SEQ ID NO:14(cs50二聚体)中提供。五聚体的实例在SEQ ID NO:15(cs50五聚体)和SEQ ID NO:16(cs59五聚体)中提供。

在一些实施方式中，多聚体是异源多聚体，例如，至少一个Ig结合结构域与Ig结合蛋白内的其他Ig结合结构域具有不同的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，亲和分离基质是固体支持物。亲和分离基质包含至少一种如上所述的Ig结合蛋白。

亲和基质可用于分离免疫球蛋白，并且即使在清洁过程中应用的高度碱性条件下也应保留Ig结合特性。基质的这种清洁对于基质的长期重复使用是必不可少的。

用于亲和层析的固体支持物基质是本领域已知的并且包括例如但不限于，琼脂糖和琼脂糖的稳定衍生物(例如

整体柱(monolith)(例如

固体支持物基质的形式可以是任何合适的众所周知的类型。用于偶联如本文所述的Ig结合蛋白的此类固体支持物基质可包括例如以下之一：柱、毛细管、颗粒、膜、过滤器、整体柱、纤维、垫、凝胶、载玻片、板、盒或层析中常用的且本领域技术人员已知的任何其他形式。

在一个实施方式中，基质由基本上球形的颗粒组成，也称为珠，例如琼脂糖凝胶或琼脂糖珠或单分散聚丙烯酸酯珠。合适的粒度可以在5-500μm，例如10-100μm，例如20-80μm，例如40-70μm的直径范围内。颗粒形式的基质可用作填充床或包括膨胀床的悬浮形式。

在替代实施方式中，固体支持物基质是膜，例如水凝胶膜。在一些实施方式中，亲和纯化涉及作为基质的膜，一个实施方式的Ig结合蛋白与其共价结合。固体支持物也可以是盒中的膜形式。

在一些实施方式中，亲和纯化涉及含有固体支持物基质的层析柱，一个实施方式的Ig结合蛋白与其共价结合。

在一些实施方式中，碱稳定的Ig结合蛋白包含用于共价连接至固相(基质)的连接位点。位点特异性连接位点包含天然氨基酸，例如半胱氨酸或赖氨酸，其能实现与固相的反应基团或固相与蛋白质之间的接头的特定化学反应。

在一些实施方式中，连接位点可以直接位于Ig结合蛋白的C-或N-末端。在一些实施方式中，单个半胱氨酸位于C末端以用于Ig结合蛋白的位点特异性固定。具有C-末端半胱氨酸的优点是Ig结合蛋白的偶联可以通过半胱氨酸硫醇与支持物上的亲电子基团的反应导致硫醚桥偶联来实现。这为偶联蛋白提供优异的流动性，其提供增加的结合能力。

在其他实施方式中，N-末端或C-末端与连接位点之间可能存在接头。在本发明的一些实施方式中，Ig结合蛋白可包含3-20个氨基酸，优选4-10个氨基酸的N-末端或C-末端氨基酸序列，具有末端半胱氨酸。末端连接位点的氨基酸可选自脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，在C末端有单个半胱氨酸用于偶联。

在本发明的一些实施方式中，Ig结合蛋白还可以在N-末端和/或C-末端包含另外的氨基酸残基，诸如例如在N-末端的前导序列和/或在N-末端或C-末端有或没有标签的偶联序列。

(a)提供含有Ig的液体，例如IgG1、IgG2、IgG4、IgM、IgA、Ig片段、Fc片段或Fab片段(包括融合蛋白和缀合物，如上定义的)；

(b)提供一种亲和分离基质，该基质包含固定在所述亲和分离基质上的如上所述的固定化Ig结合蛋白；

(c)在允许如上所述的至少一种Ig结合蛋白与Ig结合的条件下，使所述液体与所述亲和分离基质接触；和

(d)从所述基质中洗脱所述Ig，从而获得含有所述Ig的洗脱液。

在一些实施方式中，亲和纯化方法可以进一步包括在步骤(c)和(d)之间在足以从亲和分离基质中去除一些或所有与其非特异性结合的分子的条件下进行的一个或多个洗涤步骤。非特异性结合是指不涉及至少一种Ig结合蛋白和Ig之间的相互作用的任何结合。

适合于所公开的用途和方法的亲和分离基质是根据上述实施方式并且如本领域技术人员已知的那些基质。

在一些实施方式中，步骤(d)中免疫球蛋白从Ig结合蛋白的洗脱是通过pH变化和/或盐浓度变化实现的。通常，进行亲和纯化方法的合适条件是本领域技术人员公知的。在一些实施方式中，包含公开的Ig结合蛋白的公开的用途或亲和纯化方法在大于或等于3.5(例如，约3.8、约4.0或约4.5)的pH下可提供至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的含有Ig的蛋白质的洗脱。由于本发明的Ig结合蛋白的高稳定性，大于或等于pH 3.5的溶液可用于Ig蛋白的洗脱(参见实施例6)。

在一些实施方式中，添加用于有效清洁亲和基质的其他步骤(f)，优选通过使用例如具有13-14的pH的碱性液体。在某些实施方式中，清洁液体包含0.1-1.0M的NaOH或KOH，优选0.25-0.5M的NaOH或KOH。由于本发明的Ig结合蛋白的高碱性稳定性，这种强碱性溶液可用于清洁目的。

在一些实施方式中，Ig结合蛋白的Ig结合能力是在碱性条件下孵育之前的Ig结合能力的至少70％、至少约80％、至少约90％或100％，例如，通过在0.5M的NaOH中孵育至少24小时后剩余的Ig结合能力确定的(参见图4和实施例)。

在一些实施方式中，亲和基质可以重复使用至少10次、至少20次、至少30次、至少40次、至少50次、至少60次、至少70次、至少80次、至少90次或至少100次，由于步骤(a)至(e)的重复，可选地(a)至(f)可重复至少10次、至少20次、至少30次、至少40次、至少50次、至少60次、至少70次、至少80次、至少90次或至少100次。

在一个实施方式中，本发明涉及一种表达系统，其包含如上公开的核酸或载体，例如原核宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，或真核宿主，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或哺乳动物细胞，如CHO细胞。

Ig结合蛋白的生产方法。在一个实施方式中，本发明涉及一种生产本发明的Ig结合蛋白的方法，包括以下步骤(多个)：(a)在合适的条件下培养一个实施方式的宿主细胞以用于表达结合蛋白以获得所述Ig结合蛋白；和(b)可选地分离所述Ig结合蛋白。培养原核或真核宿主的合适条件是本领域技术人员公知的。

本发明的Ig结合分子可以通过许多常规和众所周知的技术中的任一种来制备，例如普通有机合成策略、固相辅助合成技术或通过市售的自动合成仪。另一方面，它们也可以通过单独的常规重组技术或与常规合成技术结合来制备。

本发明的一个实施方式涉及一种用于制备如上文详述的根据本发明的Ig结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备编码如上定义的Ig结合蛋白的核酸；(b)将所述核酸导入表达载体；(c)将所述表达载体引入宿主细胞中；(d)培养宿主细胞；(e)将宿主细胞置于表达Ig结合蛋白的培养条件下，从而(e)产生如上所述的Ig结合蛋白；可选地(f)分离步骤(e)中产生的蛋白质；和(g)可选地将蛋白质缀合至如上所述的固体基质。

在本发明的另一个实施方式中，Ig结合蛋白的产生通过无细胞体外转录/翻译进行。

实施例

提供以下实施例以进一步说明本发明。然而，本发明并不限于此，以下实施例仅基于以上描述说明本发明的实用性。

实施例1：本发明的Ig结合蛋白的产生

人工Ig结合配体最初通过天然存在的蛋白A结构域和蛋白A结构域变体(例如，Z结构域)的改组过程产生。更详细地，本文理解的改组过程是导致从一组不同的已知氨基酸序列开始的人工氨基酸序列的组装过程。改组过程包括以下步骤：a)提供五个天然存在的蛋白A结构域E、B、D、A和C以及蛋白A变体结构域Z的序列；b)所述序列的比对；c)在硅上(insilico)统计片段化以鉴定重组的子序列，然后d)组装各种片段的新人工序列以产生镶嵌产物，即新的氨基酸序列。步骤c)中生成的片段具有任意长度，例如如果片段化的亲本序列的长度为n，则片段的长度为1至n-1。

镶嵌产物中氨基酸的相对位置相对于起始氨基酸序列保持不变。人工改组的Ig结合蛋白的总氨基酸序列是人工的，因为它与任何天然存在的蛋白A结构域或结构域Z的总氨基酸序列具有不大于85％的同一性。在产生最初的人工Ig结合蛋白后，通过氨基酸序列的位点特异性随机化进一步修饰蛋白质以进一步修饰功能特性。通过单个氨基酸残基的位点饱和诱变引入进一步的修饰。例如，碱性稳定的Ig结合蛋白cs26的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)通过这种方法产生。

变体cs50、cs52、cs58、cs59、cs60、cs51、cs56、cs54、cs55和cs57由合成基因片段(Twist Bioscience/Thermo Fisher Scientific)产生。基因片段对应于纯化的PCR产物，并被克隆到pET28a载体的衍生物中。通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌XL2-蓝色细胞(Stratagene)中。通过PCR筛选单个菌落以鉴定包含正确大小插入物的构建体。DNA测序用于验证正确的序列。本发明的所有变体与例如天然存在的蛋白A结构域C、蛋白A结构域B或结构域Z具有小于80％的同一性。

实施例2：Ig结合蛋白的表达

BL21(DE3)感受态细胞用编码Ig结合蛋白的表达质粒转化。将细胞铺在选择性琼脂平板(卡那霉素)上并在37℃下孵育过夜。将预培养物从单菌落接种到补充有50μg/ml卡那霉素的50ml 2xYT培养基中，并在500mL的锥形瓶中的常规定轨振荡器中以200rpm在37℃下培养17小时。OD

实施例3：Ig结合蛋白的表达和溶解度的SDS-PAGE分析

将样品重悬于90pi的提取缓冲液(补充有0.2mg/ml的溶菌酶、0.5xBugBuster、6mMMgSO

实施例4：Ig结合蛋白的纯化

Ig结合蛋白在大肠杆菌(E.coli)的可溶性部分中表达。将细胞重新悬浮在细胞破碎缓冲液中并通过超声细胞破碎系统(Sonopuls HD 2200,Bandelin)裂解。使用pH 3.0的柠檬酸缓冲液(20mM的柠檬酸，1mM EDTA，pH 3.0)使用AKTAvant系统(Ge Healthcare)根据制造商的说明使用IEC Sepharose SP-HP(GE Healthcare)进行纯化步骤。通过将氯化钠浓度增加到1M以10个柱体积的线性梯度洗脱纯蛋白质部分。

实施例5：(如由表面等离子共振实验确定的)Ig结合蛋白以高亲和力与IgG结合

用SPR运行缓冲液平衡CM5传感器芯片(GE Healthcare)。由使EDC和NHS的混合物通过以产生反应性酯基团来活化表面暴露的羧基。将700-1500RU的on-配体(on-ligand)固定在流动池上，off-配体(off-ligand)固定在另一个流动池上。配体固定后注射乙醇胺可去除非共价结合的Ig结合蛋白。配体结合后，蛋白质分析物在表面上积累，从而增加折射率。折射率的这种变化是实时测量的，并绘制为响应或共振单位(RU)与时间的关系图。将分析物以合适的流速(μl/min)以连续稀释的形式施加到芯片上。每次运行后，芯片表面用再生缓冲液再生并用运行缓冲液平衡。将对照样品施加到基质上。如前所述进行再生和再平衡。通过使用

表3：Ig结合蛋白以高亲和力与IgG结合

表3A.IgG1的Ig结合蛋白的K

表3B.IgG1(西妥昔单抗)、IgG4(那他珠单抗)和IgG2(帕尼单抗)的Ig结合蛋白的K

实施例6：Ig结合蛋白偶联至基于琼脂糖的层析珠Praesto

根据制造商的说明将纯化的Ig结合蛋白与基于琼脂糖的层析珠(Praesto

用50mM的乙酸缓冲液(pH 3.5)然后用0.1M磷酸洗涤基质以洗脱与固定的Ig结合蛋白结合的hIgG。对于所有测试的Ig结合蛋白，大于97％的抗体被洗脱(100％，cs55、cs56、cs57；99.5％的cs54；98.3％的cs52、97.4％的cs51和97.3％的cs50)。或者，用100mM的乙酸缓冲液(pH 3.7)然后用0.1M磷酸洗涤基质以洗脱与固定的Ig结合蛋白结合的hIgG。大于98％的抗体从具有固定化cs60(二聚体)的基质中洗脱。

实施例7：偶联到环氧活化基质上的Ig结合蛋白的碱性稳定性

在室温(22℃+/-3℃)下，将柱用0.5M NaOH孵育0小时和24小时。在用0.5M NaOH孵育之前和之后分析固定蛋白的Ig结合活性。结果示于图4中。此外，在0.5M NaOH中48小时后，分析一些Ig结合蛋白的苛性稳定性。即使在强碱性溶液中孵育2天后，cs50的剩余结合能力仍为79％，cs52为75.2％，并且cs56为61.4％。与MabSelect Sure相比，结合容量提高了至少38.9％(cs56)、70.1％(cs52)和78.7％(cs50)。

将具有固定化20mg/ml的cs59(二聚体)或cs60(二聚体)的Praesto85环氧树脂与0.5M NaOH一起在室温(22℃+/-3℃)下孵育24小时和50小时。即使在强碱性溶液中大于2天后，cs59(二聚体)和cs60(二聚体)仍分别显示95.3％和98.6％的针对Ig的剩余结合能力。与SEQ ID NO:19的苛性稳定蛋白(针对Ig的88％的剩余结合能力)相比，在碱处理50小时后的cs59和cs60的剩余IgG结合能力得到改善。

序列表

<110> 纳维格蛋白质有限公司（Navigo Proteins GmbH）

<120> 用于亲和纯化的免疫球蛋白结合蛋白

<130> NP41 EP2

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs50

<400> 1

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 2

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs52

<400> 2

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 3

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs58

<400> 3

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 4

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs59

<400> 4

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 5

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs60

<400> 5

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 6

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs51

<400> 6

Ile Asp Ser Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 7

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs56

<400> 7

Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 8

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs54

<400> 8

Ile Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 9

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs57

<400> 9

Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 10

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs55

<400> 10

Ile Ala Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs58 二聚体

<400> 11

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp

50 55 60

Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu

65 70 75 80

Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro

85 90 95

Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

100 105 110

Gln Ala Pro Pro

115

<210> 12

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs59 二聚体

<400> 12

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp

50 55 60

Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu

65 70 75 80

Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro

85 90 95

Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

100 105 110

Gln Ala Pro Pro

115

<210> 13

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs60 二聚体

<400> 13

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp

50 55 60

Glu Ala Ala Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu

65 70 75 80

Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro

85 90 95

Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

100 105 110

Gln Ala Pro Pro

115

<210> 14

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs50 二聚体

<400> 14

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp

50 55 60

Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu

65 70 75 80

Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro

85 90 95

Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

100 105 110

Gln Ala Pro Pro Cys

115

<210> 15

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs50 五聚体

<400> 15

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp

50 55 60

Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu

65 70 75 80

Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro

85 90 95

Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

100 105 110

Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala

115 120 125

Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn

130 135 140

Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu

145 150 155 160

Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp

165 170 175

Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His

180 185 190

Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu

195 200 205

Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys

210 215 220

Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala

225 230 235 240

Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu

245 250 255

Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val

260 265 270

Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala

275 280 285

Pro Pro

290

<210> 16

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cs59 五聚体

<400> 16

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp

50 55 60

Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu

65 70 75 80

Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro

85 90 95

Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

100 105 110

Gln Ala Pro Pro Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala

115 120 125

Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn

130 135 140

Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu

145 150 155 160

Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala

165 170

<210> 17

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列 1

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(3)

<223> 可以由S替换

<220>

<221> 变体

<222> (9)..(9)

<223> 可以由A替换

<220>

<221> 变体

<222> (40)..(40)

<223> 可以由T替换

<220>

<221> 变体

<222> (43)..(43)

<223> 可以由A替换

<220>

<221> 变体

<222> (46)..(46)

<223> 可以由G替换

<400> 17

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 18

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列 2

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> 可以由A替换

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> 可以由Q替换

<220>

<221> 变体

<222> (7)..(7)

<223> 可以由k替换

<220>

<221> 变体

<222> (40)..(40)

<223> 可以由V替换

<220>

<221> 变体

<222> (46)..(46)

<223> 可以由A替换

<220>

<221> 变体

<222> (53)..(53)

<223> 可以由D替换

<400> 18

Ile Asp Ala Lys His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 19

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 参考 2

<400> 19

Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55