抗PK34单克隆抗体和杂交瘤细胞系及其制备和纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗PK34单克隆抗体和杂交瘤细胞系及其制备和纯化方法。

背景技术

结核病是严重危害公众健康的传染病，病原体为结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)。虽然结核病是可以预防并通过化学药物治愈的，但由于化疗药物具有较强毒副作用的短板，而且抗结核治疗时间长且多种化疗药物联合用药，导致MTB容易出现多重耐药和广泛耐药的耐药性问题，因此开发新的抗MTB感染和病灶修复方法具有重要价值。

抗菌肽作为一种生物抗菌药物，自身具有一系列优势：存在广泛、抗菌谱广、杀菌快速、无蓄积中毒作用等。由于抗菌肽与传统抗菌药物有不同的作用机制，从而使其成为对抗耐药菌的一个重要候选对象。研究证明，抗菌肽治疗结核病是有效的，并且没有结核化疗药物的肝功能损害、胃肠道症状、过敏反应等一系列不良反应。Wei等研究者从MTB噬菌体D29 中筛选出一小分子多肽PK34，可以专一地结合于MTB表面最丰富的糖酯——海藻糖双分枝菌酸(Trehalose-6,6'-dimycolate，TDM)。TDM是MTB的表面核心分子，是研发抗MTB药物的一个重要靶标。PK34同时具有杀灭MTB和抗炎症反应的能力。体内试验表明，PK34 具有与利福平相当的清除MTB的能力。PK34通过抑制丝裂原激活的蛋白激酶和蛋白激酶B 的活化，而抑制发炎因子的大量分泌，但同时维持一定炎症细胞因子水平以保持正常的免疫能力。PK34有望成为治疗MTB感染的辅助药物，或作为研发抗结核药物的模板。

目前并没有抗PK34多肽的单克隆抗体被发表公布，主要是因为多肽作为免疫原分子量小，在小鼠体内的次级淋巴器官中较难形成成熟的具有分泌特异性抗体能力的B细胞。并且，获得稳定且具有抗体分泌功能的细胞克隆后，细胞克隆的筛选以及分泌抗体的鉴定又是个繁琐且耗时的过程。另外，由于多倍体的特性，杂交瘤细胞长期储存后会导致突变或者遗传漂变，从而不产生抗体或者产生非特异性抗体，这使得获得的杂交瘤细胞具有遗传不稳定性，容易发生杂交瘤细胞退化阳性丢失的风险。其次，若未来PK34抗菌肽能被运用在结核病的临床治疗中，那利用PK34单克隆抗体构建体外免疫学技术方法，测定蛋白水平浓度，更有利于疾病的分析与病情监测。在细胞治疗中，也可以将PK34多肽对应基因修饰到细胞中，那抗PK34多肽单克隆抗体也可以用于检测PK34在体内的表达量。

因此，需要制备出一种抗PK34多肽的单克隆抗体，及一种抗PK34单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并对该杂交瘤细胞进行杂交瘤抗体基因测序，获得抗体基因序列。后续可通过基因工程的方式在体外轻松获得重组抗体，以及实现抗体人源化等抗体改造项目。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供抗抗PK34单克隆抗体和杂交瘤细胞系及其制备和纯化方法，以解决背景技术中涉及的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：一种抗PK34单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系的保藏编号为CCTCC NO.C202226，分类命名：抗PK34单克隆抗体的杂交瘤细胞系。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2022年1月26日。

本发明进一步的技术方案，所述杂交瘤细胞系分泌抗PK34单克隆抗体。

本发明还包括一种抗PK34单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备方法，所述杂交瘤细胞系为上述的杂交瘤细胞系，所述制备方法包括：

步骤1：PK34作为免疫原，免疫小鼠，采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对 PK34的效价；

步骤2：制备滋养细胞、骨髓瘤细胞和脾细胞，并进行细胞电融合，筛选后得到针对PK34 有特异性的融合细胞株；

步骤3：进行细胞亚克隆，筛选后得到针对PK34具有较高特异性的单克隆细胞株。

本发明进一步的技术方案，所述步骤2中的细胞电融合的条件为交流校准电压35V左右，交流持续时间60s以内，低电压模式直流融合电压260V左右，直流脉冲宽度40μs左右。

本发明进一步的技术方案，所述步骤2中的细胞电融合的具体步骤为：

(1)混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞与脾细胞数量比在1:2；

(2)将细胞放到离心管中，用DMEM基础培养基稀释后1500rpm 5min离心，弃上清；

(3)向离心管中加入电融合液，摇动离心管使细胞均匀，然后1500rpm 5min离心，弃上清，洗涤细胞一次；

(4)再加入电融合液将细胞密度调整至2×10

(5)设置交流校准电压35V左右，交流持续时间60s以内，低电压模式直流融合电压260V左右，直流脉冲宽度40μs左右；

(6)电融合后静置10min，再将融合细胞1000rpm 5min离心收集弃上清，用HATDMEM 培养基重悬融合细胞，把融合细胞加入提前1-2天制备好的含有滋养细胞层的96孔细胞培养板中，100μL/孔；

(7)然后将细胞培养板放入37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。

本发明还包括一种抗PK34的单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞系分泌得到，或，所述杂交瘤细胞系由上述的方法制备，所述单克隆抗体的重链可变区基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步的技术方案，重链可变区基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明进一步的技术方案，所述单克隆抗体的重链信号肽基因序列如SEQ IDNO.5所示，轻链信号肽基因序列如SEQ ID NO.6所示；

重链信号肽基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.7所示，轻链信号肽基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明进一步的技术方案，所述单克隆抗体的重链恒定区基因序列如SEQ IDNO.9所示，轻链恒定区基因序列如SEQ ID NO.10所示；

重链恒定区基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.11所示，轻链恒定区基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.12所示。

所述单克隆抗体的测序步骤包括：

步骤1：杂交瘤细胞裂解提取总RNA：

步骤2：使用RACE技术将RNA反转录合成cDNA，再以cDNA为模板通过PCR扩增获得重链和轻链全长：

步骤3：使用连接酶将目标片段连接至载体，并将连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，然后挑取单克隆进行筛选测序：

步骤4：进行测序结果分析与注释：

本发明还包括一种抗PK34单克隆抗体的纯化方法，

步骤1：将单克隆细胞株进行抗体表达；

步骤2：利用亲和纯化层析柱，将细胞上清缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体；

步骤3：将抗体在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度测定。

本发明抗PK34单克隆抗体及纯化方法和杂交瘤细胞系及制备方法的有益之处：本发明制备出了抗PK34单克隆抗体及其杂交瘤细胞系。若未来PK34抗菌肽能被运用在结核病的临床治疗中，那利用PK34单克隆抗体构建体外免疫学技术方法，测定蛋白水平浓度，更有利于疾病的分析与病情监测。在细胞治疗中，也可以将PK34多肽对应基因修饰到细胞中，那抗PK34多肽单克隆抗体也可以用于检测PK34在体内的表达量，进一步推动了结核病的研究进程。

附图说明

图1为本发明实施例抗体SDS-PAGE的分析图；

图2为本发明实施例抗体对PK34的WB检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图对其具体实施方式作进一步阐述。

如下实施例中的试剂和仪器均为常规实验试剂和仪器。

实施例1：

一种抗PK34单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系的保藏编号为CCTCCNO:C202226。

本发明进一步的技术方案，所述杂交瘤细胞系分泌抗PK34单克隆抗体。

本发明还包括一种抗PK34单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备方法，所述杂交瘤细胞系为上述的杂交瘤细胞系，所述制备方法包括：

步骤1：PK34作为免疫原，免疫小鼠，采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对 PK34的效价；

步骤2：制备滋养细胞、骨髓瘤细胞和脾细胞，并进行细胞电融合，筛选后得到针对PK34 有特异性的融合细胞株；

步骤3：进行细胞亚克隆，筛选后得到针对PK34具有较高特异性的单克隆细胞株。

本发明进一步的技术方案，所述步骤2中的细胞电融合的条件为交流校准电压35V左右，交流持续时间60s以内，低电压模式直流融合电压260V左右，直流脉冲宽度40μs左右。

本发明进一步的技术方案，所述步骤2中的细胞电融合的具体步骤为：

(1)混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞与脾细胞数量比在1；2；

(2)将细胞放到离心管中，用DMEM基础培养基稀释后1500rpm 5min离心，弃上清；

(3)向离心管中加入电融合液，摇动离心管使细胞均匀，然后1500rpm 5min离心，弃上清，洗涤细胞一次；

(4)再加入电融合液将细胞密度调整至2×10

(5)设置交流校准电压35V左右，交流持续时间60s以内，低电压模式直流融合电压260V左右，直流脉冲宽度40μs左右；

(6)电融合后静置10min，再将融合细胞1000rpm 5min离心收集弃上清，用HATDMEM 培养基重悬融合细胞，把融合细胞加入提前1-2天制备好的含有滋养细胞层的96孔细胞培养板中，100μL/孔；

(7)然后将细胞培养板放入37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。

本发明还包括一种抗PK34的单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞系分泌得到，或，所述杂交瘤细胞系由上述的方法制备，所述单克隆抗体的重链可变区基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区基因序列如SEQ ID NO.2所示。

重链可变区基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.4所示。

所述单克隆抗体的重链信号肽基因序列如SEQ ID NO.5所示，轻链信号肽基因序列如 SEQ ID NO.6所示；

重链信号肽基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.7所示，轻链信号肽基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.8所示。

所述单克隆抗体的重链恒定区基因序列如SEQ ID NO.9所示，轻链恒定区基因序列如 SEQ ID NO.10所示；

重链恒定区基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.11所示，轻链恒定区基因编码的多肽序列如SEQ ID NO.12所示。

所述单克隆抗体的测序步骤包括：

步骤1：杂交瘤细胞裂解提取总RNA：

步骤2：使用RACE技术将RNA反转录合成cDNA，再以cDNA为模板通过PCR扩增获得重链和轻链全长：

步骤3：使用连接酶将目标片段连接至载体，并将连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，然后挑取单克隆进行筛选测序：

步骤4：进行测序结果分析与注释：

本发明还包括一种抗PK34单克隆抗体的纯化方法，

步骤1：将单克隆细胞株进行抗体表达；

步骤2：利用亲和纯化层析柱，将细胞上清缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体；

步骤3：将抗体在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度测定。

实施例2：

一种抗PK34单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备方法，

步骤1：动物免疫：

选取5只BALB/c小鼠，将PK34与弗氏佐剂按1:1的体积比进行混合乳化，按50μg/只进行皮下注射免疫，每2-3周进行一次加强免疫。其中，首次免疫是PK34与弗氏完全佐剂混合，加强免疫是PK34与弗氏不完全佐剂混合。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对PK34的效价。

抗血清效价检测及筛选：

(1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。

(2)用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)作为包被缓冲液将PK34稀释成需要的1μg/mL浓度，混匀后加入板条中，每孔100μL，4℃冰箱过夜。

(3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

(4)抗血清按1:500，3倍稀释，每孔100μL，37℃恒温箱1h。

(5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μL稀释好的酶标二抗，酶标二抗：山羊抗鼠-HRP，1:20,000。37℃恒温箱1h。

(6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μL TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。

(7)每孔加入100μL 1M HCL溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD 值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

结果分析：通过对1#和4#小鼠6免后鼠抗血清效价检测结果，1#小鼠抗血清效价能够达到1093.5K，6免后抗血清效价有明显提升，可以安排细胞融合实验，融合细胞阳性率以实际结果为准；4#小鼠6免后抗血清效价在40.5K左右，通过两次加强免疫实验抗血清效价没有明显的提升，4#小鼠不再进行加强免疫实验。

步骤2：

(1)滋养细胞培养：

以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。融合的前1-2天，颈椎脱白法安乐死BALB/c 小鼠，75％酒精体表消毒和固定后，用无菌剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜。用注射器注入5-10 mL DMEM基础培养基(不含血清)至小鼠腹腔内，注意注射器针头不要刺穿腹腔内肠道、内脏，以免污染腹腔巨噬细胞。反复吹打冲洗数次，回收腹腔冲洗液，1000rpm 10min离心收集,弃上清。用含20％胎牛血清的DMEM重悬细胞，调整细胞浓度为1×10

(2)骨髓瘤细胞制备：

融合前一周，用含10％FBS DMEM培养基扩大培养SP2/0细胞。到融合时，细胞长满大约6瓶T25细胞培养瓶，在融合当天收集SP2/0细胞到50mL离心管中，1500rpm，5min 离心。弃上清，然后再加入20mL DMEM基础培养基，吹散细胞然后计数。

(3)脾细胞制备：

六次免疫后血清ELISA效价符合要求的1#小鼠，在融合前3天终免，腹腔注射PK34抗原100μg，不包含弗氏佐剂，不进行乳化，直接腹腔注射。融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠。用75％酒精浸泡5min。无菌取脾脏，把脾脏放入内有10mL DMEM基础培养的培养皿中。取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏。加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中。将细胞移至50mL离心管中，用不含血清的DMEM洗脾细胞一次，1500rpm离心5min。收集脾细胞用红细胞裂解液去除红细胞，用不含血清的DMEM洗脾细胞一次，1500rpm离心5min。收集脾细胞计数。

(4)细胞融合：

混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞与脾细胞数量比在1：2为宜。把细胞放到50mL 离心管中，用DMEM基础培养基稀释后1500rpm 5min离心，弃上清。向离心管中加入电融合液，摇动离心管使细胞均匀，然后1500rpm 5min离心，弃上清，洗涤细胞一次。再加入电融合液将细胞密度调整至2×10

(5)融合筛选：

在检测的前一天，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)包被1μg/mL PK34抗原于ELISA板(100μL/孔)，4℃过夜。次日吸取细胞上清100μL/孔进行ELISA检测，根据ELISA结果，判断阳性孔(样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔)。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。经过细胞融合，共铺8块96孔细胞培养板，通过ELISA筛选检测，获得了10株(1A1、1B5、1F6、1G4、2B6、3H11、4G2、 4G7、5B8、6E2)针对PK34有特异性的融合细胞株。然后，对确定后的阳性孔细胞进行亚克隆。

步骤3：

(1)细胞亚克隆：

吹打阳性孔中细胞，计数，在离心管中加入N/4mL DMEM培养基(N为细胞计数结果)，取100μL细胞悬液到离心管中，吹匀后留1mL，补加DMEM到4mL，吹匀，留100μL(约 2滴)在管底。在离心管中加DMEM至5mL，混匀后滴加至96孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2mL左右，补加DMEM至5mL，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8mL左右，补加DMEM至2.8-3mL左右，吹匀后滴加至96孔板的G、H 行，每孔一滴，7-10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，尽可能挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株。

(2)亚克隆筛选：

在检测的前一天，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)包被1μg/mL PK34抗原于ELISA板(100μL/孔)，4℃过夜。次日吸取细胞上清100μL/孔进行ELISA检测根据ELISA结果，判断阳性孔(样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔)。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。

经ELISA筛选阳性克隆结果如下：

通过ELISA筛选检测，获得了4株针对PK34有较高特异性的单克隆细胞株(1F6C8、2B6H2、6E2B6、6E2F11)。

步骤4：杂交瘤细胞的扩大培养与冻存保藏

细胞培养条件：DMEM(高糖)+15％FBS(BI公司)，37℃，5％CO2培养，

选取针对PK34蛋白有较高特异性的强阳性单克隆细胞株6E2B6进行扩大培养，1000 rpm，5min离心，弃上清，加入1mL DMEM完全培养基重悬细胞，将细胞转移至15mL无菌尖底离心管中，再加入4ml DMEM将细胞吹匀，再次1000rpm，5min离心。弃上清(观察底部细胞沉淀的量，如果可直接看到厚度为0.5mm厚度的细胞沉淀即可直接将细胞转移置 T25方瓶培养；若细胞沉淀很少，可将细胞转移置2-3个24孔中培养，待第二日观察细胞状态)重悬沉淀，转至T25培养瓶继续培养。第二日观察细胞状态，若是细胞量较少，或者细胞状态较差，可再培养皿中加入饲养细胞，或者稍微提高培养基中血清浓度。

细胞传代：T25培养瓶长至底部密度80-90％，轻轻拍打两侧数次，观察细胞是否脱落，按1传3的比例进行扩大培养。

细胞冻存液：90％胎牛血清+10％二甲基亚砜，

待杂交瘤细胞密度达到90％，直接弃上清，轻轻拍打培养瓶两侧数次，收集细胞悬液， 1000rpm,离心5min,弃上清，使用细胞细胞冻存液重悬菌体，终浓度为1×10

将抗PK34单克隆抗体的杂交瘤细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:C202226，保藏日：2022年01月26日，分类命名：抗PK34单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

实施例3：

一种抗PK34单克隆抗体的制备与鉴定方法，

步骤一：细胞表达：

选择6E2B6这株单克隆细胞株扩大培养，进行抗体表达。

步骤二：抗体纯化：

将Protein G琼脂糖凝胶介质装入亲和纯化层析柱，将6E2B6细胞上清缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4) 中进行4℃透析过夜，隔日利用SDS-PAGE对抗体纯度进行检测，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定。最后获得抗体浓度为0.20mg/mL，体积为6mL。将纯化后的抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。结果如图1所示，纯化抗体SDS-PAGE分析，Lane M：蛋白质分子量标准；Lane 1：抗体纯化分析结果。

步骤三：抗体鉴定：

(1)通过ELISA技术检测纯化抗体对PK34的效价：

在检测的前一天，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)包被1μg/mL PK34抗原于ELISA板(100μL/孔)，4℃过夜。次日对纯化抗体倍比稀释后(起始稀释度为1:500)，进行ELISA 检测，判断其对PK34的效价。

表1纯化抗体间接ELISA检测结果

抗体效价即样品OD/空白OD≥2.1的最高稀释度，通过ELISA效价检测结果得出，6E2B6 纯化抗体针对PK34多肽的效价达到256K左右。

(2)抗体特异性鉴定：

通过Western blot技术检测纯化抗体的特异性。将PK34蛋白加至聚丙烯酰胺凝胶加样孔， 100V跑至浓缩胶与分离胶交界处，再将电压升至160V直到电泳结束。电泳结束后，取下凝胶进行湿法转膜，恒流280mA转膜约1h。电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min，再将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中37℃封闭1h。用PBST按1:200比例稀释纯化后的抗体，膜在纯化抗体稀释液中4℃过夜。次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min，用含5％脱脂奶粉的封闭液按1:20000比例稀释二抗。膜在二抗稀释液中37℃孵育1h后，将膜取出置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。使用ECL发光液显影，曝光，结果见图 2，Lane M：蛋白质分子量标准；Lane 1:抗体-PK34 WB检测结果。

实施例4：

一种抗PK34单克隆抗体的基因全长测序：

步骤包括：

步骤1：杂交瘤细胞裂解提取总RNA：

取适量抗PK34单克隆抗体的杂交瘤细胞，进行细胞裂解后提取杂交瘤细胞总RNA。

步骤2：使用RACE技术将RNA反转录合成cDNA，再以cDNA为模板通过PCR扩增获得重链和轻链全长：

通过RACE技术(cDNA末端快速扩增技术)，根据已知序列设计特异性引物，利用 3′RACE获得3′端序列(基因特异性引物→3′末端)，利用5′RACE获得5′端序列(基因特异性引物→5′末端)，最终获得完整的cDNA序列。再利用5′RACE和3′RACE的上下游引物，通过PCR扩增获得编码单克隆抗体重链和轻链的基因扩增产物，另以ddH2O为模板完成整个体系的运行，以设置PCR扩增的阴性对照组。

步骤3：使用连接酶将目标片段连接至载体，并将连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，然后挑取单克隆进行筛选测序：

对上述PCR产物使用PCR产物回收试剂盒(Vazyme公司)进行纯化回收，并对回收产物以及连接载体pUC57载体使用EcoR V限制性内切酶进行单酶切。然后将酶切后的纯化产物及载体使用T4连接酶(Thermo公司)，用下表2配制连接反应体系后，在25℃下反应30min。

表2连接反应体系

表3菌落体系

将重组载体转化进TOP10感受态细胞中，再加入700μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。再将复苏后的感受态细胞涂布在氨苄抗性LB平板上37℃培养。约10h后可见单克隆菌落。挑取单克隆菌落后使用菌落PCR进行验证，具体菌检体系如表3，菌落PCR程序设置如表4。将PCR鉴定筛选为阳性的单克隆菌落进行扩大培养。对扩大培养后的菌落进行质粒小提(Axygen公司)，再将质粒基于Sanger测序法进行核苷酸测序。

表4菌落PCR程序设置

步骤4：进行测序结果分析与注释：

将抗PK34单克隆抗体的重、轻链测序结果分别在NCBI和IMGT数据库中进行核苷酸序列和氨基酸序列比对，实现同源性分析。将所得序列同现有已报道的其他抗体基因进行同源性比较，并分析其胚系基因来源。并通过NCBI、FR-IMGT和CDR-IMGT分析确定抗体重轻链的前导序列(信号肽)，可变区的FR、CDR的序列，以及抗体恒定区的序列。实验结果：核苷酸序列比对结果显示，抗PK34单克隆抗体的重链可变区基因序列与编号为GenBank：MH765571.1的小鼠Ig重链可变区基因序列同源性最高，为278/292(95％)。抗PK34单克隆抗体的轻链可变区基因序列与编号为GenBank：NG_005612.1的小鼠Ig轻链可变区基因序列同源性最高，为298/305(98％)。氨基酸序列比对结果显示，抗PK34单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列与编号为GenBank：AEX91931.1的小鼠Ig重链可变区基因序列同源性最高，为98/118(83％)。抗PK34单克隆抗体的轻链可变区基因序列与编号为GenBank： ADO17787.1的小鼠Ig轻链可变区基因序列同源性最高，为107/112(96％)。同源性分析表明，编码抗PK34单克隆抗体的重轻链可变区的核苷酸序列，来源于鼠胚系基因，但与现有报道的各种单克隆抗体基因序列均不完全一致，表明本发明在基因序列上具有唯一性。抗 PK34单克隆抗体的重轻链可变区的氨基酸序列为鼠源性蛋白，虽然与其他蛋白氨基酸序列有同源性，但未发现与本发明完全相同的氨基酸序列，表明本发明在氨基酸序列上也具有唯一性。

抗PK34单克隆抗体的重链可变区3个CDR序列如SEQ ID NO.3部分所示，具体为：

CDR1：Gly Phe Thr Phe Thr ASn Tyr Gly

CDR2：Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro

CDR3：Ala Lys GIu Asp Asp Ser Gly Ala Ile Asp Tyr

抗PK34单克隆抗体的轻链可变区3个CDR序列如SEQ ID NO.4部分所示，具体为：

CDR1：Gln Ser Ile Val His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr

CDR2：Lys Val Ser

CDR3：Phe Gln Gly Ser His Phe Pro Pro Thr

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 潍坊医学院

<120> 抗PK34单克隆抗体和杂交瘤细胞系及其制备和纯化方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcacgatc 60

tcctgcaaga cttctggctt taccttcaca aactatggaa tgatctgggt gaggcagcct 120

ccaggaaagg gtttcaagtg gatgggctgg ataaacaccg acactggaga gccaacatat 180

gctgatgagt tcaagggacg gtttgccttc tctttggaga cctctgccag cactgcctat 240

ttgcagatca gcaacctcaa aaatgaagac atggcttcat atttctgtgc aaaagaggat 300

gattccgggg ctatagacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354

<210> 2

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatgttttga tgacccaaac tcccctctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gttctagtca gagcattgta cataataatg ggaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaagg ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggttcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acattttcct 300

cccacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336

<210> 3

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<223> V-region

（26）…（33）

重链CDR1区

V-region

（51）…（58）

重链CDR2区

V-region

（97）…（107）

重链CDR3区

<400> 3

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ile Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Ser Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Asp Asp Ser Gly Ala Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<223> V-region

（27）…（37）

轻链CDR1区

V-region

（55）…（57）

轻链CDR2区

V-region

（94）…（102）

轻链CDR3区

<400> 4

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggattggc tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtgc ccaagca 57

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc caacagt 57

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ala Gln Ala

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Asn Ser

<210> 9

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60

tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180

ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240

acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300

gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360

cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420

gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480

gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540

agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600

aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660

aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720

agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780

aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840

tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagaacaact ggggggcagg aaatactttc 900

acctgctttg tgttccatga gggcctgcac aacccccata ctgagaagag cctctcccac 960

tctcctggta aatga 975

<210> 10

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60

ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120

tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180

agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240

cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300

agcttcaaca ggaatgagtg ttga 324

<210> 11

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Asn Asn Trp Gly Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Phe Val

290 295 300

Phe His Glu Gly Leu His Asn Pro His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105