大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2、其编码蛋白及其dsRNA在线虫防治中的应用

技术领域

本发明分子生物学领域，尤其涉及一种大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2、其编码蛋白及其dsRNA在线虫防治中的应用。

背景技术

大豆是重要的粮食和油料作物，而大豆孢囊线虫病是严重制约大豆产量的重要因素之一。大豆孢囊线虫病在我国大豆产区都有发生，估计每年由此造成的经济损失高达6亿元。大豆孢囊线虫(Soybean cyst nematode，SCN)属于植物定居型内寄生线虫，主要寄生于大豆等豆科植物的根部，侵入根系后易造成寄主根部发育迟缓，叶部变黄，一般减产30-50％，严重时导致绝产。此外，大豆孢囊线虫侵染还会加剧其它病害的发生程度，例如大豆疫霉、大豆茎褐腐病等。

当前对大豆孢囊线虫的防治以化学防治法为主，在线虫侵染而又无抗病品种的地区，应用化学药剂防治大豆胞囊线虫确有效果。目前常用的有8％甲多种衣剂，药种比例为1∶75进行种子包衣处理；另外，还有5％甲基异硫磷等都能有效地防治大豆胞囊线虫病。但是农药存在对环境污染及对人畜有害的问题。

发明内容

本发明是要解决现有大豆孢囊线虫的化学防治方法存在环境污染及对人畜有害的问题，提供大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2、其编码蛋白及其dsRNA在线虫防治中的应用。

本发明提供大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明提供大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2的编码蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。

本发明大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2的dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

本发明以大豆孢囊线虫瞬时感受器电位香草素TRPV通道基因Hg-ocr-2为模板，设计特异性引物，通过MEGAscript RNAi试剂盒合成基因Hg-ocr-2的dsRNA片段。

本发明还提供大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2的dsRNA在防治线虫中的应用。

具体方法为：用含有大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2的dsRNA的处理液浸泡大豆孢囊线虫二龄幼虫，室温下暗处震荡孵育48h。

本发明的有益效果：

本发明的基因Hg-ocr-2来源于大豆孢囊线虫瞬时感受器电位香草素TRPV通道，该基因在线虫的尾感器中表达，是调控酸碱的化感基因，在大豆孢囊线虫的预寄生期二龄幼虫中表达最高。试验显示基因Hg-ocr-2参与调控大豆孢囊线虫对酸碱的趋化性及其对寄主的侵染和繁殖，可作为大豆孢囊线虫防治药物开发的靶标基因。这个基因的鉴定及其功能研究也是首次在植物寄生线虫中进行报道。

本发明针对TRPV通道基因Hg-ocr-2的碱基序列，筛选特定的功能区域合成dsRNA，通过体外干扰的方法测定dsRNA处理后的线虫对酸碱的趋化反应、对植物根部的侵染能力以及雌虫指数的影响，验证基因Hg-ocr-2在线虫预寄生和寄生过程中的作用。本发明TRPV通道基因Hg-ocr-2，经过双链RNA片段dsRNA-Hg-ocr-2单独处理后，线虫对酸性pH(5.25)的趋化性降低8.4％，但对碱性pH(8.6)的趋化性提高12.3％；侵染至根内的二龄幼虫数量及侵染35天后根表雌虫数量分别下降45％和39.9％。结果表明基因Hg-ocr-2在调控大豆孢囊线虫对酸碱化感物质的趋化性及在侵染寄主及发育过程中发挥关键作用，可以作为杀线剂开发的靶标基因。

本发明对于大豆孢囊线虫致病机制的研究以及线虫防治具有重大理论和应用价值。

附图说明

图1为RT-PCR克隆大豆孢囊线虫TRPV通道基因Hg-ocr-2；

图2为原位杂交显示Hg-ocr-2在SCN尾感器细胞的定位；

图3为外源dsRNA处理对二龄幼虫中Hg-ocr-2表达量的影响；

图4为dsRNA处理和未处理二龄幼虫J2对酸(pH 5.25)和碱(pH 8.6)的趋化指数；

图5为dsRNA处理和未处理二龄幼虫J2侵染大豆根部36h后根内的J2数目；

图6为dsRNA处理和未处理二龄幼虫接种大豆35天后根表和土壤内孢囊数量。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

具体实施方式二：本实施方式大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2的编码蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

具体实施方式三：本实施方式大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2的dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

本实施方式以大豆孢囊线虫瞬时感受器电位香草素TRPV通道基因Hg-ocr-2为模板，设计特异性引物，通过MEGAscript RNAi试剂盒合成基因Hg-ocr-2的dsRNA片段。

具体实施方式四：本实施方式大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2的dsRNA在防治线虫中的应用。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2的dsRNA防治线虫的具体方法为：用含有大豆孢囊线虫基因Hg-ocr-2的dsRNA的处理液浸泡大豆孢囊线虫二龄幼虫，室温下暗处震荡孵育48h。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：基因Hg-ocr-2的克隆

1、收集新鲜孵化的大豆孢囊线虫二龄幼虫，放入生物冷冻研碎器，加入适量液氮迅速研磨，研磨后将线虫粉末转移到1.5mL的离心管中，加入Trizol 1mL，震荡混匀提取线虫的总RNA。

2、以步骤1的总RNA为模板，使用

3、以步骤2合成的cDNA为模板，用上游引物和下游引物对基因Hg-ocr-2进行PCR分段扩增。

基因Hg-ocr-2上游引物和下游引物如下

Hg-ocr-2-1F：5’-ATGGGCGAGAATTTGGTTGG-3’

Hg-ocr-2-1R：5’-CCGCGTATTCCGTCTTGAGA-3’

Hg-ocr-2-2F：5’-ATTTGGTTGGCTGTTGTCTG-3’

Hg-ocr-2-2R：5’-TTCCGTTCGTGTCCTGTG-3’

Hg-ocr-2-3F：5’-ACGATGCTTCGGTGCTT-3’

Hg-ocr-2-3R：5’-AGTGCCATTCCGTAGACC-3’

Hg-ocr-2-4F：5’-GCCACCACTTGGGTAATC-3’

Hg-ocr-2-4R：5’-GAGGAAGAAGCGGAACAA-3’

Hg-ocr-2-5F：5’-TCGTCGCCGATGGCTTCA-3’

Hg-ocr-2-5R：5’-CAGTGTCGTCGTGTTGC-3’

Hg-ocr-2-6F：5’-TTGATGGCTCTGTTGGG-3’

Hg-ocr-2-6R：5’-CTACAGTGTCGTCGTGTTGCCG-3’

扩增反应体系：T3 Super PCR Mix，36μL，cDNA模板，2μL，上游引物，2μL，下游引物，2μL，ddH

反应条件：98℃变性2min，98℃，10s，50-57℃，10s，72℃延伸15s/kb，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物应用1％的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，结果如图1所示。

4、将步骤3中的PCR扩增产物连接T载体，并转化大肠杆菌DH5α培养，取500μL菌液测序。测序结果表明，扩增产物中具有序列表中SEQ ID NO：1所示的开放阅读框，编码序列表的序列表中SEQ ID NO：2所示的蛋白质。将序列表中SEQ ID NO：2命名为蛋白Hg-OCR-2，将编码基因命名为Hg-ocr-2。

实施例2：基因Hg-ocr-2的组织定位分析

按照DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter KitI的方法对大豆孢囊线虫二龄幼虫进行组织定位分析。

1、以大豆孢囊线虫的cDNA为模板，用上游引物和下游引物扩增目的片段。

扩增反应体系：T3 Super PCR Mix，7.2μL，cDNA模板，0.4μL，上游引物，0.4μL，下游引物，0.4μL，ddH

2、应用不对称PCR合成地高辛标记的正义链探针和反义链探针。

以步骤1回收的基因部分片段为模板标记DIG，获得正义链探针和反义链探针。其中所涉及的基因Hg-ocr-2的部分片段长度是912bp。

3、进行原位杂交。

原位杂交结果见图2。结果显示，反义链探针标记的Hg-ocr-2处理后，线虫尾感器组织细胞发生显色反应。结果表明，Hg-ocr-2主要在二龄幼虫(H.glycines J2s)的尾感器组织表达，而尾感器是线虫化感调控的重要部位。

实施例3：体外RNAi干扰试验验证Hg-ocr-2功能

1、dsRNA的合成：设计目的片段的特异性引物

引物Hg-OCR-2-si-T7F：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGGAACTGAATCTCAAGACGGAATA-3

引物Hg-OCR-2-si-R：

5’-CAAGTGGTGGCGGAAAA-3

引物Hg-OCR-2-si-F：

5’-GAACTGAATCTCAAGACGGAATA-3

引物Hg-OCR-2-si-T7R：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGCAAGTGGTGGCGGAAAA-3

在特异性引物的5’端引入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGGAG。以cDNA为模板合成dsRNA，纯化后用于下一步试验。

2、按照MEGAscript

反应体系：回收的基因片段模板1μg，10×T7反应缓冲液2μL，ATP 2μL，CTP 2μL，GTP 2μL，UTP 2μL，T7酶混合物2μL，无核酸酶水补足至20μL，37℃暗处孵育4h，-20℃放置过夜。产物应用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，260nm波长下检测dsRNA浓度，合成的dsRNA在-80℃保存。dsRNA序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

3、收集新鲜孵化的大豆孢囊线虫二龄幼虫，1/4M9缓冲液清洗三遍后待用。

4、大豆孢囊线虫的二龄幼虫体外RNAi干扰参照文章(Urwin PE,Lilley CJ,AtkinsonHJ.Molecular Plant-Microbe Interactions,2002,15:747-752)中的方法。取500条步骤3收集的二龄幼虫，浸泡在处理液1、处理液2、处理液3中，500条/样本，每个处理重复三次，室温下暗处震荡孵育48h。

处理液1含有50mM章鱼胺、3mM精氨酸、0.05％明胶、1.5mg/mL dsRNA和0.1mg/mLFITC。

处理液2含有50mM章鱼胺、3mM精氨酸、0.05％明胶和1.5mg/mL dsRNA。

处理液3含有50mM章鱼胺、3mM精氨酸、0.05％明胶和1.5mg/mLgfp。

5、移液器吸取数条处理液1组二龄幼虫，使用荧光显微镜在488-525nm波长下检测线虫体内是否可见绿色荧光。

6、提取处理液2和处理液3浸泡大豆孢囊线虫的总RNA并反转录为cDNA，应用荧光定量PCR检测基因Hg-ocr-2的表达量(以actin基因为内参)，结果如图3，Hg-ocr-2的dsRNA处理后，大豆孢囊线虫体内Hg-ocr-2表达量显著降低。

荧光定量检测引物：

引物Hg-ocr-2F：5’-TCTGACTCCGCTTACTTTGG-3’

引物Hg-ocr-2R：5’-CGCCCGTTTCCTGATTG-3’

引物Hg-actin F：5’-GCGTGGTTACTCCTTCGTG-3’

引物Hg-actin R：5’-CGGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3’

引物GFP F：5’-GCAGAAGAACGGCATCAAG-3’

引物GFP R：5’-TCCAGCAGGACCATGTGAT-3’

7、使用趋化指数反映线虫对酸碱信号的趋性。酸信号(pH 5.25)由0.17M的HAC溶液营造，首先向直径60mm培养皿中加入23％PF-127凝胶10mL。取50μL HAC溶液加入适配器中，将该适配器作为处理组(A)水平放入培养皿，小头端抵靠培养皿边缘，大头端指向培养皿中心，使适配器内的HAC向外扩散，形成酸性梯度。在培养皿的另一端相向放置对照组(C)适配器，两适配器位于同一条直线。待凝胶凝固后，在培养皿中心滴加约300条dsRNA干扰的大豆孢囊线虫，然后转移至25℃恒温箱内暗培养。碱信号(pH 8.6)由0.5M NaOH配制，其余步骤与酸信号趋性试验方法相同。在培养24h后，分别统计处理组(A)和对照组(C)区域的线虫数量，计算趋化指数Chemotaxis Index＝(A-C)/(A+C)。结果如图4所示，

8、处理液2和处理液3处理后的二龄幼虫250条接种大豆幼苗，暗处培养36h后采用品红法检测侵染率。剪掉大豆地上部分，清水冲洗干净大豆根后浸泡在1.5％的次氯酸钠溶液中3min。取出大豆根，用无菌水彻底清洗干净次氯酸钠，将洗后的大豆根浸泡在品红溶液中，加热至溶液沸腾。沸腾30s后室温放置直至品红溶液降至室温。取一棵大豆根用清水清洗表面品红后制做玻片，在体视显微镜下统计根内线虫数量，计算侵染率。侵染率计算公式如下：

侵染率＝(侵入根内线虫数/接种线虫数)×100％

9、接种35d后统计根表和土壤中孢囊数量。

外源dsRNA-Hg-ocr-2处理二龄幼虫(H.glycines J2s)后对SCN侵染和繁殖的影响如图5和6所示。结果显示，RNAi干扰后，Hg-ocr-2的表达量下降了47.7％，其中dsRNA-Hg-ocr-2处理的侵染率和孢囊数量分别降低了40.5％和17.7％，结果说明，dsRNA能够干扰Hg-ocr-2的表达，Hg-ocr-2沉默后均影响线虫的侵染和发育，可以作为杀线药物的靶标基因用于线虫防控。