一种达格列净SM-1中基因毒性杂质溴乙烷的检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种达格列净SM-1中基因毒性杂质溴乙烷的检测方法。

背景技术

达格列净是一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)选择性抑制剂。SGLT2选择性表达在肾小球近端小管的第一节(S1)，调控大部分滤过液葡萄糖的重吸收。达格列净抑制SGLT2会导致多余的葡萄糖通过尿液排泄，从而在不增加胰岛素分泌的情况下改善血糖控制。体外研究表明，相对于密切相关的选择性1242-1600-折叠的hSGLT1，达格列净能有效选择性的抑制人体(h)SGLT2。相对于mGLT1和dSGLT1，达格列净可以选择性的抑制老鼠(m)和犬(d)的SGLT2。临床研究结果显示，达格列净单用或与二甲双胍、吡格列酮、格列美脲、胰岛素等药物联合使用，可以显著降低2型糖尿病患者的HbA1c和空腹血糖，不良反应发生率与安慰剂相似，低血糖风险低。

溴乙烷是达格列净SM-1合成工艺中引入的，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，溴乙烷在3类致癌物清单中。为了更好地控制达格列净的质量，有必要提供一种测量方法，以检测达格列净中是否含有溴乙烷，从而保证用药的安全性，但是目前尚未见达格列净SM-1中溴乙烷检测方法的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种达格列净SM-1中基因毒性杂质溴乙烷的检测方法。本发明可以有效地检测出达格列净SM-1中是否含有残留的溴乙烷及其含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种达格列净SM-1中基因毒性杂质溴乙烷的检测方法，包括以下步骤：

将溴乙烷对照品溶于甲醇中，得到对照品溶液；

将待测达格列净SM-1溶于甲醇中，得到供试品溶液；

将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行气相色谱检测，得到溴乙烷对照品中溴乙烷的峰面积和待测达格列净SM-1中溴乙烷的峰面积；

采用式I计算得到所述待测达格列净SM-1中基因毒性杂质溴乙烷的含量；

式I中，F

A

W

溴乙烷含量的单位为ppm；

式II中，n为对照品进样次数，F

式III中，W

P

A

所述气相色谱检测的条件包括：

柱温：起始温度为35℃，维持10分钟，再以50℃/分钟的速率升温至240℃，维持5分钟；

载气：氮气；

顶空平衡温度：55～65℃；

顶空平衡时间：30min；

流速：1.4～1.6mL·min

检测器为FID，检测器温度：250℃；

进样口温度：200℃。

优选地，所述对照品溶液的浓度为2.7～3.3μg/mL。

优选地，所述供试品溶液的浓度为18～22mg/mL。

优选地，所述待测达格列净SM-1中溴乙烷的含量为0.78～4.68μg/mL。

优选地，所述气相色谱检测的检测限浓度为0.25μg/mL。

优选地，所述气相色谱检测的定量限浓度为0.81μg/mL。

优选地，所述气相色谱检测的固定相为氰丙基苯基-二甲基聚硅氧烷，分流比为3：1。

本发明提供了一种达格列净SM-1中基因毒性杂质溴乙烷的检测方法，包括以下步骤：将溴乙烷对照品溶于甲醇中，得到对照品溶液；将待测达格列净SM-1溶于甲醇中，得到供试品溶液；将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行气相色谱检测，得到溴乙烷对照品中溴乙烷的峰面积和待测达格列净SM-1中溴乙烷的峰面积。

本发明提供了一种达格列净SM-1中溴乙烷的检测方法，本发明提供的检测方法具有较高的灵敏性和耐用性，可以有效检测出达格列净SM-1中是否含有残留的溴乙烷及其含量，通过本发明方法能够有效地控制达格列净产品的质量，提高了药品的用药安全。

附图说明

图1为专属性验证例中溶剂的典型色谱图；

图2为专属性验证例中对照品溶液的典型色谱图；

图3为专属性验证例中供试品溶液的典型色谱图；

图4为专属性色谱图；

图5为检测限溶液的典型色谱图；

图6为定量限溶液的典型色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种达格列净SM-1中基因毒性杂质溴乙烷的检测方法，包括以下步骤：

将溴乙烷对照品溶于甲醇中，得到对照品溶液；

将待测达格列净SM-1溶于甲醇中，得到供试品溶液；

将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行气相色谱检测，得到溴乙烷对照品中溴乙烷的峰面积和待测达格列净SM-1中溴乙烷的峰面积；

采用式I计算得到所述待测达格列净SM-1中基因毒性杂质溴乙烷的含量；

式I中，F

A

W

溴乙烷含量的单位为ppm；

式II中，n为对照品进样次数，F

式III中，W

P

A

所述气相色谱检测的条件包括：

柱温：起始温度为35℃，维持10分钟，再以50℃/分钟的速率升温至240℃，维持5分钟；

载气：氮气；

顶空平衡温度：55～65℃；

顶空平衡时间：30min；

流速：1.4～1.6mL·min

检测器为FID，检测器温度：250℃；

进样口温度：200℃。

在本发明中，若没有特殊说明，采用的试剂均为本领域技术人员所熟知的市售商品。

本发明将溴乙烷对照品溶于甲醇中，得到对照品溶液。

在本发明中，所述溴乙烷对照品的纯度优选为95wt％以上。本发明采用甲醇溶液能够使得溴乙烷完全溶解。

在本发明中，所述对照品溶液的浓度优选为2.7～3.3μg/mL，更优选为3.0μg/mL。

本发明将待测达格列净SM-1溶于甲醇中，得到供试品溶液。

在本发明中，所述待测达格列净SM-1中溴乙烷的含量优选为0.78～4.68μg/mL。

在本发明中，所述供试品溶液的浓度优选为18～22mg/mL，更优选为20mg/mL。

得到对照品溶液和供试品溶液后，本发明将所述对照品溶液和供试品溶液分别进行气相色谱检测，得到溴乙烷对照品中溴乙烷的峰面积和待测达格列净SM-1中溴乙烷的峰面积。

本发明采用梯度升温，能够将达格列净SM-1及达格列净SM-1中的杂质洗脱出来，避免其余杂质干扰溴乙烷的测定，保证了方法的专属性。

在本发明中，所述气相色谱检测的检测限浓度优选为0.25μg/mL。

在本发明中，所述气相色谱检测的定量限浓度优选为0.81μg/mL。

在本发明中，所述气相色谱检测的固定相优选为氰丙基苯基-二甲基聚硅氧烷，具体优选为AgilentDB-624；分流比优选为3：1。

在本发明中，所述气相色谱检测的色谱柱的内径优选为0.32mm，柱长优选为30m，色谱柱膜厚优选为1.8μm。

在本发明中，所述供试品稀释倍数指的是由溴乙烷对照品制备得到进行气相色谱检测用供试品溶液的总稀释倍数；所述对照品稀释倍数指的是由溴乙烷对照品制备得到进行气相色谱检测用对照品溶液的总稀释倍数。

本发明通过方法学验证证明了本发明检测方法的专属性、灵敏性和耐用性，可以有效地检测出达格列净SM-1中是否含有残留的溴乙烷及其含量，通过本发明方法有效地控制达格列净产品的质量，提高了药品的用药安全。

为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的达格列净SM-1中基因毒性杂质溴乙烷的检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例与验证例中所采用的的材料、试剂、仪器与气相色谱条件为：

1.仪器与气相色谱条件：

岛津GC-2010plus气相色谱仪(进样口、柱温箱、自动进样器、检测器、系统监测器和Chromeleon7工作站)(日本岛津公司)；XSR205DU型十万分之一天平(德国METTLERTOLEDO公司)；AB265-S型十万分之一分析天平(美国METTLERTOLEDO公司)。

色谱条件：

以(6vol％)氰丙基苯基-(94vol％)二甲基聚硅氧烷作为固定相；起始温度为35℃，维持10分钟，再以50℃/分钟的速率升温至240℃，维持5分钟；检测器为FID，检测器温度250℃；进样口温度200℃；顶空60℃平衡30分钟；载气为氮气，流速为每分钟1.5mL；分流比3：1。

2.材料

溴乙烷对照品(来源：博洛徳，批号：DGLJ20200302)；达格列净SM-1(来源：山东鲁抗医药股份有限公司、济南三元化工，批号：C274-股Z2006001、20200303、20200401)；甲醇(来源：新蓝景，批号：A2219041000)。

实施例1

对照品溶液制备：精密称取溴乙烷对照品适量，加甲醇溶解并稀释成每1mL含3.0μg的溴乙烷对照品的溶液，精密量取5mL置顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。

供试品溶液制备：取达格列净SM-1约100mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加甲醇5mL使溶解，密封，作为供试品溶液。

分别取上述溶液顶空进样，记录峰面积，采用式I的方法计算达格列净SM-1中溴乙烷的含量，结果见表1。

表1达格列净SM-1中溴乙烷的测定结果

验证例方法学验证

1专属性

对照品溶液精密称取溴乙烷1g，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀；精密量取上述溶液0.2mL至10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释后的溶液0.4mL至100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL置顶空瓶中，密封。

供试品溶液精密称取供试品100mg，置顶空进样瓶中，精密加5mL甲醇使溶解，密封。

取甲醇、对照品溶液和供试品溶液分别顶空进样，记录色谱图，结果见图1～3，图1为专属性验证例中溶剂的典型色谱图，图2为专属性验证例中对照品溶液的典型色谱图，图3为专属性验证例中供试品溶液的典型色谱图，图4为专属性色谱图。由图1～4可以看出，溶剂和供试品溶液对溴乙烷的检测无干扰。

2定量限、检测限

检测限(LOD)和定量限(LOQ)是根据信噪比法来确定的。已知浓度的溴乙烷对照品贮备液稀释，S/N≈10时的浓度作为定量限浓度，S/N≈3时的浓度作为检测限浓度。

照上述色谱条件，精密量取各定量限溶液和检测限溶液各10μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。结果见表2，典型图谱见图5～6，图5为检测限溶液的典型色谱图，图6为定量限溶液的典型色谱图。由表2可以看出，检测限S/N＝7.2>3，六针定量限中最小S/N＝13.0，均大于10，浓度为0.8069μg/ml，小于限度浓度的30％，且连续6针定量限RSD为6.0％，符合规定，本方法灵敏度较高。

表2达格列净SM-1中溴乙烷含量测定方法学-定量限、检测限结果

3耐用性

溶剂：甲醇。

对照品溶液精密称取溴乙烷1g，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀；精密量取上述溶液0.2mL至10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释后的溶液0.4mL至100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL置顶空瓶中，密封。

供试品溶液精密称取供试品100mg，置顶空进样瓶中，精密加5mL对照品溶液使溶解，密封。

分别改变流速(±0.1mL/min)、顶空平衡温度(±5℃)，更换不同色谱柱，取甲醇、对照品溶液和供试品溶液分别顶空进样，记录色谱图。结果见表3。由表3可以看出，各耐用性条件下溶剂和供试品溶液不干扰溴乙烷的检测；与正常条件下测得的溴乙烷含量相比相对偏差均小于±8％，方法耐用性良好。

表3达格列净SM-1中溴乙烷含量测定方法学-耐用性结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。