一种以脐带间充质干细胞为基础细胞高效生产细胞因子的方法

技术领域

本申请涉及生物领域，更具体的涉及一种以脐带间充质干细胞为基础细胞高效生产细胞因子的方法。

背景技术

细胞因子是一大类对细胞间信号传递很重要的蛋白质。它们由多种细胞产生，包括干细胞，免疫细胞，如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞。细胞因子的释放将对周围细胞活动产生影响。细胞因子可包括白细胞介素、干扰素、生长因子、肿瘤坏死因子、趋化因子和集落刺激因子。

白细胞介素(Interleukins)又简称为ILs，是一种细胞因子，在调控细胞进程(细胞生长、分化和移动)和刺激免疫反应方面起着重要作用。最初是在白细胞中发现，目前发现它们可由许多种细胞产生，包括巨噬细胞、淋巴细胞等具有实体结构和功能的细胞。主要包括CXCL8，IFNL3，IL10，IL11，IL12，IL12A，IL13，IL15，IL15RA，IL16，IL17A，IL17B，IL17F，IL17RA，IL18，IL19，IL1A，IL1B，IL1RL2，IL1RN，IL2，IL20，IL20RA，IL21，IL22，IL23，IL23R，IL3，IL31，IL33，IL36A，IL36B，IL36G，IL36RN，IL37，IL4，IL4R，IL5，IL6，IL7，IL9等。干扰素(Interferon)简称IFN，是宿主细胞针对多种存在的病毒制造并释放出一组信号蛋白，因其能保护细胞免受病毒感染，“干扰”病毒复制而得名。干扰素属于一大类细胞因子的蛋白质，用于细胞之间沟通，以触发免疫系统的保护性防御，来消灭病原体。生长因子也属于一种蛋白质或是类固醇激素，为天然存在物，能刺激细胞的生长、分化、生存、炎症和组织修复。生长因子对调节不同的细胞进程有重要的作用，可由邻近细胞、远处组织和腺体，甚至肿瘤细胞本身分泌。正常细胞通过表现出对几种生长因子的需求，来维持增殖和生存能力。生长因子可通过内分泌、旁分泌或自分泌机制发挥其刺激作用。

目前细胞因子的生产方法有很多种。比如CN106520689A提供了一种间充质干细胞细胞因子的制备方法，包括以下步骤：提取间充质干细胞；培养；低氧条件下继续培养；用0.25％胰酶EDTA溶液消化；离心，用0.9％生理盐水清洗；用0.9％生理盐水调整细胞浓度，再添加1 3mg/mL的EDTA和5 10mg/mL的Vc；冻融；离心，过滤。但是所述方法针对细胞因子IL-6的产量并不高。

CN106367389A中公开了一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括人脐带间充质干细胞的原代分离与培养和冻干粉的制备及活性检测两个步骤，其细胞因子主要是通过将培养瓶中P20代内的细胞进行离心、孵化、二次离心和超滤浓缩后得到因子浓缩液来制备的，同样的其获得的细胞因子中并不高表达IL-6。CN105543313A中公开了一种分离纯化人源间充质干细胞因子的方法，它包括细胞培养上清液的获取：取人间充质干细胞，置于间充质干细胞无血清培养基中培养，当细胞生长到汇合度75～85％时，收集上清液，过滤浓缩：对上清液先采用0.22μm滤膜过滤；然后通过50KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液,即可。所述方法同样的在制备过程中IL-6的生产较少。

由于白介素6(interleukin 6，IL-6)，是与炎症相关最为典型的细胞因子。它通过调节免疫和炎症反应，在宿主防御中发挥着重要作用。IL-6是一个小分子糖蛋白，分子量为19-28kDa，由184个氨基酸形成四个α螺旋结构，通常以单体形式存在，等电点为5.0。编码人IL-6的基因位于染色体7p15-21，包括4个内含子和5个外显子。IL-6有3个受体结合位点，包括1个特异性受体IL-6R(IL-6binding receptor protein，IL-6R)结合位点，和2个gp130(signal-transducing protein)结合位点。IL-6也是一种具有多效活性的细胞因子，可以促进多种细胞的增殖和分化，也可以加速肝细胞急性期蛋白的合成，还可以抑制M1髓性白血病细胞系的生长，促进其成熟和分化，抑制黑素瘤、乳腺癌细胞的生长。因此，高效生产IL-6细胞因子是目前研究的迫切方向。

发明内容

本发明提供了一种高效生产IL-6及其他细胞因子的方法。

具体的，本发明提供一种生产含有IL-6细胞因子的细胞因子混合物的方法。

Wnt-1蛋白是由343个氨基酸组成分泌型糖蛋白，多数通过细胞表面Frizzled家族受体发挥作用，在胚胎正常发育过程中是必不可少。Wnt-1的激活会引起复杂的级联信号反应，最终导致多个基因表达上调。Wnt-1参与了人体多种细胞进程，并影响某些系统的正常功能。Wnt1/β-catenin通路中Wnt-1是最重要的调控蛋白。通过抑制Wnt-1的活性，能够整体上抑制Wnt1/β-catenin通路。

一方面，本发明提供了一种抑制Wnt-1的活性的单克隆抗体。

所述抑制Wnt-1的活性的单克隆抗体是Wnt-1-15C，其轻链可变区VL氨基酸序列：

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCPGFMENMTGMWYQQKPGSSPKPWIYAPFRFTWGVPFRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCPSEFEPKIVFGGGTKLEIK

重链可变区VH氨基酸序列：

QVKLQESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFSFYAERMMWVRQAPGKGLEWVAHYNVWWGRQDFGTSCYPTARFTISRDDSQSMLYLQMHNLKTDDTAMYYCVRLGIKMAYMYYDSHWGAGTTVTVSS

所述抗体的轻重链可变区分别是：

进一步的，本发明还提供了抑制Wnt-1的活性的单克隆抗体在制备促进脐带间充质干细胞分化为肝样细胞的试剂中的用途。

进一步的，所述分化试剂包括三阶段试剂组成，所述三阶段试剂在诱导脐带间充质干细胞分化中分别使用条件是：将脐带间充质干细胞现在阶段1培养:DMEM-LG+20μg/L表皮生长因子+10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，培养3d；然后阶段2培养:DMEM-LG+体积分数为1％胎牛血清+20μg/L肝细胞生长因子+10μg/L碱性成纤维细胞生长因子+0.61g/L烟酸胺+10μg/L的Wnt-1-15C单抗，培养6d，每3d换液1次；最后阶段3培养：含体积分数5％胎牛血清、10μg/L人成纤维生长因子4、10μg/L肝细胞生长因子、10μg/L重组抑瘤素M、10μg/L的Wnt-1-15C单抗、10

进一步的，本发明还提供了将分化后的肝样细胞用于生产富含IL6的细胞因子的方法。

所述生产方法包括本领域常规的培养细胞方法，收集上清，即可获得所述细胞因子。

进一步的，所述生产方法可以是取采用单抗诱导分化后的肝样细胞的密度接种含10％胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃、5％CO

进一步的，本发明还提供了制备获得的富含IL6细胞因子用于制备促进成纤维细胞增殖、用于治疗癌症等相关疾病的药物中的用途。

进一步的，本发明制备的细胞因子可用于制备细胞因子制剂、化妆品等。

本发明的药物组合物还包含缓冲液，其可选自由以下组成的组：磷酸钾、乙酸/乙酸钠、柠檬酸/柠檬酸钠、琥珀酸/琥珀酸钠、酒石酸/酒石酸钠、组氨酸/组氨酸HCl、甘氨酸、Tris、谷氨酸盐、乙酸盐和其混合物，并且特别地选自磷酸钾、柠檬酸/柠檬酸钠、琥珀酸、组氨酸、谷氨酸盐、乙酸盐和其组合。

药物组合物可任选地包含一种或多种另外的赋形剂，只要它们不降低或消除其如本文所述的有利特性，特别是其稳定性。

赋形剂可在本发明中用于广泛多种目的，如调整配制物的物理、化学或生物特性(诸如调整粘度)和/或本发明的方法以进一步改进有效性和/或进一步使所述配制物和方法稳定以对抗归因于例如在制造、运送、储存、使用前制备、施用期间和此后产生的应力的降解和腐败。术语“赋形剂”一般包括填充剂、粘合剂、崩解剂、涂层、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、湿润剂、载剂、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂和张力调节剂。

可接受的赋形剂优选地是药学上可接受的，包括但不限于：氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、2-苯基丙氨酸，括带电氨基酸，优选地赖氨酸、乙酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸盐和/或组氨酸。

进一步的，药物组合物中的主要媒介物或载剂可本质上为水性或非水性。合适的媒介物或载剂可为注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊髓液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其他示例性媒介物。

有益效果

本发明制备获得了特异性的抑制Wnt1/β-catenin通路中Wnt-1活性的单克隆抗体，该抗体能够促进脐带间充质干细胞向肝样细胞分化，同时分化后的肝样细胞能够高表达富含IL6的细胞因子，所述细胞因子具有较好生物活性，能够用于制备相应的药物，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1噬菌体克隆ELISA检测结果图

图2单抗的特异性鉴定结果图

图3细胞因子对人皮肤成纤维细胞增殖效果图

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

实施例1Wnt-1单克隆抗体的制备

将人重组Wnt-1(Biovision，货号：4754-50)用50mmol/L碳酸氢钠(pH10.0)包被ELISA板，PBS/2％牛奶封闭后加入噬菌体库(武汉金开瑞生物工程有限公司合成，Fab噬菌体库)，室温缓摇1h，经PBS/0.1％Tween洗6次，酸性洗脱液(0.1mmol/LHCl-Gly，pH2.2，0.1％BSA)洗脱结合的噬菌体，再用1mol/LTris-HCl(pH9.1)中和洗脱液，测滴度，扩增噬菌体用于下一轮筛选。共进行3轮筛选，后2轮筛选过程同第一轮，但减少包被抗原量，并且逐渐增加Tween浓度，分别为0.3％、0.5％。经过3轮筛选，最终富集的噬菌体的富集指数为109，说明已经成功的富集了与Wnt-1具有高亲和性的噬菌体。

挑取42株经3轮筛选获得的阳性克隆，接种于100μl含100mg/LAmp的2YT培养液中，37℃培养至OD600＝0.3～0.4，加入25μl辅助噬菌体进行侵染，然后加入25μl含300mg/LKan的2YT培养液，37℃培养过夜。富集的各个噬菌体克隆采用ELISA方法进行特异性鉴定，每孔包被人重组Wnt-1 100ng，加100μl噬菌体，HRP标记的鼠抗M13噬菌体抗体显色。以空白对照调零,酶标仪(MultiskanSpectrummicroplateThermo1500)测A450nm吸光光度值。阳性标准为P/N值(阳性/阴性)>2.0,阴性标准为P/N值<0.5。结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，其中阳性效果最好的2株单抗分别是Wnt-1-15C和Wnt-1-13F。

针对Wnt-1-15C，用5’端引物：AAGACAGCTATCGCGATT和3’端引物：GCCCCCTTATTAGCGTTT将Fab基因片断扩增出来，PCR条件：94℃5min；94℃15s，50℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。产物送到上海生工生物技术有限公司进行抗体可变区基因序列测定，对测序结果用DNAMAN和数据库进行检索分析。经序列比对，获得了编码Wnt-1-15C单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列和编码Wnt-1-15C单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列，重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在HB2151细菌中可溶性分离得到表达Fab抗体，0.5mol/L的IPTG低温诱导表达过夜，利用渗透压休克法从细菌周质腔获取可溶性Wnt-1-15C单抗，镍柱纯化获得纯化单抗，将所述单抗调整浓度为1mg/mL备用。

实施例2Wnt-1-15C单克隆抗体的亲和力及特异性鉴定

应用SPR技术分析Wnt-1-15C抗体对Wnt-1蛋白的结合能力：将Wnt-1蛋白偶联到CM5传感器芯片上，以1～100nM范围内的6个不同浓度注射Wnt-1-15C单抗，在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HCl pH1.5。使用在不同抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数KD。经计算，得到表1的结果。

表1 Wnt-1-15C单抗的亲和力

从表1的结果可以看出，本发明制备的抗体与抗原的亲和性的KD为4.58×10

特异性鉴定：纯化的Wnt-1-15C单抗采用ELISA方法进行特异性分析，每孔包被人重组Wnt-1蛋白、Wnt-2蛋白和BSA各100ng，加梯度稀释的Wnt-1-15C单抗，HRP标记的鼠抗Flag抗体显色。结果如图2所示。

Wnt-1抗原和对照蛋白(Wnt-2和BSA)包被ELISA板，分析结果显示Wnt-1-15C单抗可以特异性地结合Wnt-1蛋白，不与其他非相关蛋白结合(图2)，表现了较好的特异性。

实施例3脐带间充质干细胞的制备及分化诱导

将新鲜脐带放入培养皿中，去除羊膜及血管。将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm

UC-MSCs免疫表型检测是通过流式细胞仪测定UC-MSCs表面CD90、CD45、CD105、CD34和HIA-DR的表达情况。结果如表2所示。

表2间充质干细胞免疫表型鉴定

从表2的结果可以看出，CD90和CD105表达阳性，阳性率都>98％，而CD34、CD45、HLA-DR表达阴性，阳性率<2％，表明分离制备获得的是脐带间充质干细胞。

选择第4代生长状态良好的hUC-MSCs，以每孔5×10

阶段3培养：含体积分数5％胎牛血清、10μg/L人成纤维生长因子4、10μg/L肝细胞生长因子、10μg/L重组抑瘤素M、10μg/L的Wnt-1-15C单抗、10

分别用0.25％胰蛋白酶消化并收集诱导后的细胞，试剂盒提取总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA。选用SYBR Slect Master Mix用于荧光定量PCR检测，取1μL cDNA模板，加入各引物0.5μL，采用10μL的反应体系，同时选择GAPDH基因作为内参，实验条件为如下:95℃10min，58℃20s,72℃30s，共循环40次。具体的引物为AFP上游引物：GCTGGTGGTGGATGAAACA，下游引物:TCCTCTGTTATTTGTGGCTTTTG；IL-6上游引物：

AAATTCGGTACATCCTCGAC，下游引物：CAGGAACTGGATCAGGACTT；以GAPDH为内参基因，上游引物：AGCCACATCGCTCAGACAC；下游引物：GCCCAATACGACCAAATCC。结果如下表3所示。

表3 IL-6、AFP基因各组的表达情况

从表3的结果可以看出，AFP和IL-6的mRNA表达水平在诱导组中显著的高于对照组(*P<0.05)，通过诱导之后，脐带间充质干细胞表型向肝类似细胞分化，分化的细胞具有肝细胞标志物AFP的高表达特性，表明诱导分化成功。而在添加了本发明的单抗后，竞争性抑制Wnt/p-catenin信号通路后，又进一步的促进了hUC-MSCs向肝样细胞分化、成熟。并且，出乎意料的，分化成熟后的肝样细胞具有高表达细胞因子IL-6的特性。

实施例4分化后的细胞生产含有人IL6的细胞因子组合物

取实施例3采用单抗诱导分化后的肝样细胞以5×10

取第4代生长状态良好的hUC-MSCs以5×10

采用ELISA检测试剂盒测定相同细胞密度条件下的IL6的分泌量。结果如表4所示。

表4 IL6的分泌量

从表4的结果可以看出，相比对照组，采用Wnt-1-15C单抗增强诱导后得到的细胞能够高浓度的分泌IL-6，差异及其显著(P<0.01)，在1×10

实施例5细胞因子活性检测

人皮肤成纤维细胞HFF-1细胞培养于10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中，在温度37℃、浓度5％CO2的饱和湿度培养箱中进行常规培养，细胞长至85％时用胰酶消化、传代培养。取对数生长期的HFF-1细胞，每孔1×10

从图3结果可以看出，本申请采用单抗诱导的细胞产生的细胞因子具有浓度相关性，随着浓度的增加，可以显著促进人皮肤成纤维细胞的增殖(与对照组相比，P<0.05)，且呈现剂量依赖性。在使用单抗诱导的细胞制备的100μg/mL的细胞因子可以将HFF-1细胞的增殖活性提高到(243.2±14.3)％，不使用单抗诱导获得细胞制备的细胞因子将HFF-1细胞的增殖活性提高(196.8±10.5)％，这也说明，使用单抗诱导后，能够显著的提高细胞因子的含量以及活性。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。