一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程和食品领域，具体涉及提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽及其制备方法。

背景技术

α-乳清蛋白年进口量逐年攀升，亟需推动我国乳清蛋白类蛋白产品的生产研发。α-乳白蛋白是乳清蛋白中含量最高的蛋白质组分，也是牛乳清中第二大丰富的蛋白质。α-乳白蛋白具备多种重要的生理功能，首先，作为小分子蛋白质，更易肠道吸收利用，有助于提高蛋白质的生物利用度，降低蛋白质总量，从而有效减轻肾脏负担；其次，α-乳白蛋白含有丰富的色氨酸，色氨酸被认为是调节婴儿睡眠、情绪和食欲的重要氨基酸，有助于婴儿睡眠，促进大脑发育；另外，乳白蛋白的水解肽段能够增强孩子的自身抵抗力，抗炎抗氧化，减少过敏反应发生；α-乳白蛋白也是人体必需氨基酸的最佳来源，能促进神经发育，调节肠道的菌群平衡。基于其突出的生理和营养功能，α-乳白蛋白成为国内外婴幼儿配方奶粉的重要原料，伊利乳业将α-乳白蛋白配方作为其婴幼儿配方奶的专利组分。目前国内市场中乳白蛋白均为乳提取产品，且乳铁蛋白产品完全依赖进口。实现α-乳白蛋白的自主研发和微生物制造具有重要的战略意义。

α-乳白蛋白的专利较少，相关专利表明目前已实现在大肠杆菌、酵母、藻类等体系中生产，例如US9732351B2、WOUS90007438等。最近，CN113481115A专利中公布了一种利用毕赤酵母表达人源α-乳白蛋白的方法，产量为5mg/L。现有技术中涉及的微生物生产α-乳白蛋白的产量均较低，无法实现产业化应用。

另外，目前有一些专利文献中报道了利用融合肽来增强蛋白表达产量，例如：CN108794635A、CN114127124A、CN114249839A等。但尚没有用于提高α-乳白蛋白表达量的融合肽被报道。

发明内容

本发明筛选了一系列可与α-乳白蛋白融合表达，并提高其分泌产量的融合肽，所述融合肽与α-乳白蛋白串联构成。

所述的融合肽的氨基酸序列可以为SEQ ID NO.1-10的任意一个，连接在α-乳白蛋白的N端或者C端进行融合表达，可由全基因合成获得。

因此，本发明提供一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1-10所示的任意一个。尤其提供所述融合肽在提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的融合肽在增加重组细胞例如酵母菌表达α-乳白蛋白的产量中的用途。

进而本发明提供一种α-乳白蛋白的融合蛋白，其是将如所述的融合肽连接在α-乳白蛋白的N端或者C端肽，优选地两者之间还增加有酶切位点。

本发明还提供一种编码所述融合肽的核酸。

本发明还提供含有所述的核酸的载体。优选地，其是表达载体，其中所述的核酸与启动子可操作的连接，优选地，出发载体为质粒pKLAC1。

本发明提供含有所述的核酸或所述的表载体重组细胞。优选地，所述重组细胞是酵母菌。更优选地，所述重组细胞是乳酸克鲁维酵母。

本发明还提供一种生产α-乳白蛋白的方法，包括培养所述的重组细胞，收集α-乳白蛋白的步骤。

优选地，所述培养用的培养基组成包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-3g/L的半乳糖，更优选地，所述培养用的培养基YPG培养基：酵母提取物1％，蛋白胨2％，半乳糖2％；发酵后收集发酵液上清，再进一步进行纯化；另外优选地，培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。通过α-乳白蛋白与融合肽融合表达，可以显著提高α-乳白蛋白的表达量。这些融合肽也可以用于α-乳白蛋白在其他酵母中的表达。产生α-乳白蛋白融合肽分泌量比单独表达α-乳白蛋白提高了1.5-3倍，摇瓶产量达到70mg/L，在5L发酵罐中的产量达到600mg/L以上。

本发明的优势在于利用融合肽与α-乳白蛋白融合表达，大幅提高了α-乳白蛋白产量。并且融合肽构建于N端或C端均有提高效果。融合肽串联α-乳白蛋白的表达方式也可以应用于其他表达系统中，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为α-乳白蛋白与融合肽融合表达产量对比。

图2为GG799/pKLAC1-LP3-btla表达融合蛋白Western结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进一步进行阐述，但并不构成对本发明的限制。

实施例一：融合表达质粒的构建

本发明通过文献检索筛选找到10个融合肽，其中一些是已被报道应用于其他酵母中融合蛋白表达的(例如LP1,LP6)；有些是蛋白自身可以在乳酸克鲁维酵母中高效的分泌表达(例如LP2，LP3,LP4,LP5,LP7,LP8,LP9,LP10)，但其并没有用于α-乳白蛋白的融合表达，本发明通过研究希望利用这些蛋白来实现与α-乳白蛋白的融合表达。

LP1氨基酸序列：

MMVAWWSLFLYGLQVAAPALAQQTVWGQCGGQGWSGPTSCVAGSACSTLNPYYAQCIPGATTMSTTTKPTSVSASTTRASATSSATPPTSS；

LP2氨基酸序列：

MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAVNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITAVWIPPAYKGLSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGTKSELQDAIGSLHSRNVQVYGDVVLNHKAGADATEDVTAVEVNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHWYHFDGADWDESRKISRIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDYLMYADVDYDHPDVVAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIKFSFLRDWVQAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKTSFNQSVFDVPLHFNLQAASSQGGGYDMRRLLDGTVVSRHPEKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYAYGPQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGLAALITDGPGGSKRMYAGLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSVSIYVQK；

LP3氨基酸序列：

MASLVAGALCILGLTPAAFARAPVAARATGSLDSFLATETPIALQGVLNNIGPNGADVAGASAGIVVASPSRSDPNYFYSWTRDAALTAKYLVDAFIAGNKDLEQTIQQYISAQAKVQTISNPSGDLSTGGLGEPKFNVNETAFTGPWGRPQRDGPALRATALIAYANYLIDNGEASTADEIIWPIVQNDLSYITQYWNSSTFDLWEEVEGSSFFTTAVQHRALVEGNALATRLNHTCSNCVSQAPQVLCFLQSYWTGSYVLANFGGSGRSGKDVNSILGSIHTFDPAGGCDDSTFQPCSARALANHKVVTDSFRSIYAINSGIAEGSAVAVGRYPEDVYQGGNPWYLATAAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITDVSLPFFQDIYPSAAVGTYNSGSTTFNDIISAVQTYGDGYLSIVEKYTPSDGSLTEQFSRTDGTPLSASALTWSYASLLTASARRQSVVPASWGESSASSVPAVCSATSATGPYSTATNTVWPSSGSGSSTTTSSAPCTTPTSVAVTFDEIVSTSYGETIYLAGSIPELGNWSTASAIPLRADAYTNSNPLWYVTVNLPPGTSFEYKFFKNQTDGTIVWEDDPNRSYTVPAYCGQTTAILDDSWQ；

LP4氨基酸序列：

KIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTRITK；

LP5氨基酸序列：

MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL；

LP6氨基酸序列：

MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLVKRAVCYDTDQVPLNIFFGPPDKKKRDY；

LP7氨基酸序列：

MNIFYIFLFLLSFVQGKRIHMAPVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSSGAGAGAGAGA；

LP8氨基酸序列：

MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKRDGDSKAITNTTFSLNRPSVHFTPSHGWMNDPNGLWYDAKEEDWHLYYQYNPAATIWGTPLYWGHAVSKDLTSWTDYGASLGPGSDDAGAFSGSMVIDYNNTSGFFNSSVDPRQRAVAVWTLSKGPSQAQHISYSLDGGYTFQHYSDNAVLDINSSNFRDPKVFWHEGENGEDGRWIMAVAESQVFSVLFYSSPNLKNWTLESNFTHHGWTGTQYECPGLVKVPYDSVADSSSNSSDSKPDSAWVLFVSINPGGPLGGSVTQYFVGDFNGTHFTPIDDQTRFLDMGKDYYALQTFFNTPNEKDVYGIAWASNWQYAQQAPTDPWRSSMSLVRQFTLKDFSTNPNSADVVLNSQPVLNYDALRKNGTTYSITNYTVTSENGKKIKLDNPSGSLEFHLEYVFNGSPDIKSNVFADLSLYFKGNNDDNEYLRLGYETNGGAFFLDRGHTKIPFVKENLFFNHQLAVTNPVSNYTTNVFDVYGVIDKNIIELYFDNGNVVSTNTFFFSTNNVIGEIDIKSPYDKAYTINSFNVTQFNV；

LP9氨基酸序列：

MRCLVVLLAVFALSQGAEITRIPLYKGKSLRKALKEHGLLEDFLQKQQYGISSKYSGFGEVASVPLTNYLDSQYFGKIYLGTPPQEFTVLFDTGSSDFWVPSIYCKSNACKNHQRFDPRKSSTFQNLGKPLSIHYGTGSMQGILGYDTVTVSNIVDIQQTVGLSTQEPGDVFTYAEFDGILGMAYPSLASEYSIPVFDNMMNRHLVAQDLFSVYMDRNGQESMLTLGAINPSYYTGSLHWVPVTVQQYWQFTVDSVTISGVVVACEGGCQAILDTGTSKLVGPSSDILNIQQAIGATQNQYGEFDIDCDNLSYMPTVVFEINGKMYPLTPSAYTSQDQGFCTSGFQSENHSQKWILGDVFIREYYSVFDRANNLVGLAKAI；

LP10氨基酸序列：

MKFLVLAVLLTVGAAQEGISSRALWQFRSMIKCAIPGSHPLMDFNNYGCYCGLGGSGTPVDELDRCCETHDNCYRDAKNLDSCKFLVDNPYTESYSYSCSNTEITCNSKNNACEAFICNCDRNAAICFSKAPYNKEHKNLDTKKYC。

首先构建α-乳白蛋白表达载体：以商品化质粒pKLAC1(柯雷生物，货号：kl-zl-0249)为模板，以表1中引物VF/VR扩增获得载体；以来源牛Bos taurus的α-乳白蛋白(GeneID:113893771)基因为模板(但不限于牛来源)，引物IF/IR扩增获得目标片段，两部分通过Gibson组装的方式连接起来，构建获得表达载体pKLAC1-btla。

融合肽LP1-LP10基因序列由华大基因全合成获得，利用表1所列的相应的引物序列(LP-IF/LP-IR)分别扩增对应的融合肽基因片段。将融合肽LP1-LP11除LP4构建于α-乳白蛋白的C端，均分别构建于α-乳白蛋白的N端。其中LP4和LP11都对应来自大肠杆菌的(E.coli)麦芽糖结合蛋白序列，不同之处在于LP4是将融合肽序列构建于α-乳白蛋白的C端，而LP11是构建于N端。以前步获得载体pKLAC1-btla为模板，以表1所列引物序列(LP-VF/LP-VR)为引物，扩增获得载体片段。将融合肽片段与对应的载体片段以Gibson组装的方式连接起来，化学法转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布氨苄抗性平板。长出的单菌落利用引物(checkF：GAGAGAAGATGTTCTTCCCT；checkR：AACAGCTTGGGTATCATA)进行菌落PCR和测序验证。

表1所使用的引物

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实施例二、融合表达的酵母菌株的构建

提取实施例一中测序验证正确的质粒，命名为pKLAC1-LP1-btla至pKLAC1-LP11-btla，使用限制性内切酶SacII进行质粒线性化后，利用酵母转化试剂盒(酷来博货号：SK2400-200T)转入乳酸克鲁维酵母GG799菌种中，涂布于含有乙酰胺的YCB平板上，30℃培养5天获得转化子，阳性菌落即为含有LP1-btla至LP11-btla融合肽基因的重组菌命名为GG799/pKLAC1-LP1-btla至GG799/pKLAC1-LP11-btla。另外，转化pKLAC1-btla于GG799菌株作为融合表达对照，命名为GG799/pKLAC1-btla。

YCB固体平板(100mL)：3mL 1M Tris-HCl pH7.5；1.17g YCB；2g琼脂粉加水99mL，121℃20min灭菌后，加入1mL过滤除菌0.5M乙酰胺。

实施例三、融合表达的酵母菌株的表达和表征

将单菌落接入1mLYPG(YPG培养基：酵母提取物1％，蛋白胨2％，半乳糖2％)培养基中进行培养，30℃220rpm 24小时后，以1％接种量转接种子液于250mL三角瓶中，内含10mLYPG培养基，30℃220rpm摇瓶培养72小时后，收集发酵液上清，以不含LP融合肽的GG799/pKLAC1-btla发酵液上清作为对照；以α-乳白蛋白标品(货号：S12080)作为定量标准。通过western来确证产物，其中一抗为APPLYGEN/普利莱(生产)的鼠抗α-乳白蛋白单克隆抗体(9E9)(货号：C1385-50)；二抗为Easybio/柏奥易杰(生产)的Goat Anti-Mouse IgG(H&L)-HRP Conjugated羊抗鼠(货号：BE0102-100)。同时通过上海天能全自动化学发光图像分析系统内置软件，计算α-乳白蛋白产量。结果见图1和图2，结果可知所有的融合肽，α-乳白蛋白产量都明显高于对照，其中LP3效果最好达到70mg/L，LP11、LP10、LP6、LP1、LP7次之，分别达到65mg/L、62mg/L、62mg/L、57mg/L、55mg/L，这些都基本是对照的α-乳白蛋白产量近3倍或3倍以上。另外，对比LP4和LP11可以发现，相同融合肽，放置于目标蛋白N端或C端均可帮助其表达。