一种双靶点抑制剂及含有该抑制剂的培养液和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种双靶点抑制剂及含有该抑制剂的培养液和应用。

背景技术

体细胞核移植(SCNT)技术在优良种畜快速扩繁、地方品种保护、基因编辑动物生产等方面具有巨大潜力，但目前低下的克隆效率影响其应用。近几年的研究表明，在体细胞核移植生产克隆胚胎的过程中，存在核质不同周期、母源mRNA和蛋白降解不完全、表观重编程不完全、体细胞带来的异源线粒体存在等问题，导致克隆胚胎发育失败，

自噬最初被认为是一种原始降解途径，是机体抵抗外界不良环境的一种反应，但后来证实参与了细胞、胚胎多种生物学功能，包括代谢调节、免疫系统调节、细胞更新等。研究表明，自噬活性与胚胎发育潜力有关，可以作为植入前胚胎质量的指标之一。在卵母细胞发生过程中，其积累了发育所必需的母体mRNA和蛋白质。在精卵结合后，母体mRNA和蛋白质在胚胎的二细胞阶段后迅速降解，由胚胎基因组编码的新合成的蛋白质开始被翻译，这个过程被称为卵母细胞到胚胎的转变。在原核阶段高水平的自噬诱导对于将卵母细胞胞质物质转换为合子物质，即产生母体蛋白质分解的氨基酸是重要的，分解的氨基酸可用于植入前发育过程中新的蛋白质合成。但是克隆胚胎中，自噬激活明显不足，导致克隆胚胎中母体mRNA和蛋白质的消除显著延迟，由此导致自噬抑制引起的发育障碍，导致克隆胚胎发育质量较差。

目前急需要一种物质可以来有效激活克隆胚胎的自噬，改善克隆胚胎发育质量，提高克隆效率。

发明内容

本发明的目的是提供可以有效激活克隆胚胎自噬的双靶点抑制剂及含有该双靶点抑制剂的培养液和应用，以改善克隆胚胎发育质量，提高克隆效率。

根据本发明的第一个方面，提供了一种双靶点抑制剂，该双靶点抑制剂为HDACs/mTOR Inhibitor 1，其化学式为C

由此，通过在克隆胚胎的培养液中添加该双靶点抑制剂，培养24h后，可以激活胚胎自噬的发生，有效清除母源mRNA和蛋白，同时提高组蛋白乙酰化水平，有利于转录因子与DNA特异性结合，从而激活胚胎基因组转录，进而改善克隆胚胎发育质量，提高克隆效率。

根据本发明的第二个方面，提供了一种双靶点抑制剂在克隆胚胎培养中的应用，该双靶点抑制剂为HDACs/mTOR Inhibitor 1。由此，通过在克隆胚胎的培养液中添加该双靶点抑制剂，培养24h后，可以激活胚胎自噬的发生，有效清除母源mRNA和蛋白，同时提高组蛋白乙酰化水平，有利于转录因子与DNA特异性结合，从而激活胚胎基因组转录，进而改善克隆胚胎发育质量，提高克隆效率。

在某些实施方式中，该应用是通过将所述双靶点抑制剂添加至克隆胚胎培养液中，来提高克隆胚胎发育质量。

在某些实施方式中，双靶点抑制剂的添加浓度为1nM-10μM。

在某些实施方式中，双靶点抑制剂的添加浓度为1μM。

根据本发明的第三个方面，提供了一种双靶点抑制剂提高克隆胚胎自噬水平上的应用。由此，可以高效地激活克隆胚胎自噬的发生，有效清除母源mRNA和蛋白，同时提高组蛋白乙酰化水平，有利于转录因子与DNA特异性结合，从而激活胚胎基因组转录，以此来提高克隆胚胎的质量和发育效率。

根据本发明的第四个方面，提供了一种培养液，该培养液是以PZM-3培养液作为基础培养液，并在PZM-3培养液中添加双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1。由此，将克隆胚胎置于该培养液中培养24小时，可以激活胚胎自噬的发生，有效清除母源mRNA和蛋白，同时提高组蛋白乙酰化水平，有利于转录因子与DNA特异性结合，从而激活胚胎基因组转录，进而改善克隆胚胎发育质量，提高克隆效率。

在某些实施方式中，该培养液的双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor1的浓度为1nM-10μM。

在某些实施方式中，该培养液的双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor1的浓度为1μM。

根据本发明第五个方面，提供了一种促进克隆胚胎体外发育的培养方法，该方法包括如下步骤：

S1:将供体细胞与卵母细胞进行融合培养；

S2:将融合后的胚胎置于含有双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1的培养液中，培养24h；

S3:将培养24h后的胚胎培养液换为PZM-3培养液，继续培养至144h；

S4:筛选和收集发育状态好的囊胚，即获得了高质量体外克隆胚胎。

采用该方法，可以显著促进克隆胚胎体外发育质量和效率。

根据本发明第六个方面，提供了一种提高动物克隆效率的方法，其中，所述方法包括如下步骤：

S1:将供体细胞与卵母细胞进行融合培养；

S2:将融合后的胚胎置于含有双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1的培养液中，培养24h；

S3:将培养24h后的胚胎培养液换为PZM-3培养液，继续培养至144h；

S4:筛选和收集发育状态好的囊胚，将筛选出的囊胚置于代孕动物子宫内，待该动物出生，即可以提高该动物克隆效率。

采用该方法，可以显著改善克隆胚胎发育质量，提高克隆效率。

本发明的有益效果总结如下：

1、提供了一种双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1，通过将该抑制剂添加至克隆胚胎基础培养液PZM-3中，可高效激活胚胎自噬的发生，有效清除母源mRNA和蛋白，同时提高组蛋白乙酰化水平，有利于转录因子与DNA特异性结合，从而激活胚胎基因组转录，以此来提高克隆胚胎的质量和发育效率；

2、提供了一种双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1在克隆胚胎培养中的应用，通过将该双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1应用在克隆培养培养中，可以显著提高克隆胚胎发育质量和发育效率；

3、提供了一种双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1在提高克隆胚胎自噬水平上的应用，通过将该靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1应用在提高克隆胚胎自噬水平上，可高效地激活克隆胚胎自噬的发生，有效清除母源mRNA和蛋白，同时提高组蛋白乙酰化水平，有利于转录因子与DNA特异性结合，从而激活胚胎基因组转录，以此来提高克隆胚胎的质量和发育效率；

4、提供了一种培养液，该培养液含有双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1，通过将克隆培养置于该培养液中培养24小时，可以激活胚胎自噬的发生，有效清除母源mRNA和蛋白，同时提高组蛋白乙酰化水平，有利于转录因子与DNA特异性结合，从而激活胚胎基因组转录，进而改善克隆胚胎发育质量，提高克隆效率。

5、提供了一种促进克隆胚胎体外发育的培养方法，该方法通过将融合激活后的克隆胚胎置于在含有双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1的培养液中培养24h，然后在换为胚胎基础培养液继续培养至144h，该方法可以显著提高胚胎转录水平，改善体外克隆胚胎的发育质量和发育效率。

6、提供了一种提高动物克隆效率的方法，该方法通过将融合激活后的克隆胚胎置于在含有双靶点抑制剂HDACs/mTOR Inhibitor 1的培养液中培养24h，然后在换为胚胎基础培养液继续培养至144h，然后将囊胚置于代孕动物子宫内，待该动物出生，即可以提高该动物克隆效率。该方法，可以可以显著提高胚胎转录水平，改善克隆胚胎的发育质量，提高克隆动物出生效率。

附图说明

图1为不同浓度HDACs/mTOR Inhibitor 1处理胚胎后的囊胚发育情况；

图2为24h 1μM HDACs/mTOR Inhibitor 1处理胚胎后囊胚相关基因的表达水平结果图。

具体实施方式

下面结合附图对发明作进一步详细的说明。

以猪克隆胚胎构建为例：

1、卵母细胞的获取和体外成熟培养

a、卵母细胞成熟培养液的配制：

以TCM-199培养基为基础培养基，在此基础上添加10ng/mL表皮生长因子(EGF)，体积分数为10％的猪卵泡液(PFF)，0.1IU/ml孕马血清促性腺激素(PMSG)，0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素(hCG)，10％胎牛血清(FBS)以及添加0.6mM半胱氨酸，配置好后用滤膜过滤，过滤后置于四孔板中，用无菌矿物油覆盖，放入培养箱中平衡至少4h。

b、卵母细胞的收集：

从屠宰场中收集卵巢，放至含有双抗和生理盐水的保温瓶中运送回实验室，用含双抗的生理盐水清洗卵巢3-5次，取带18号针头的10ml无菌注射器抽取直径为3-6mm的卵泡，待卵泡液沉降后，弃掉上清部分，用DPBS-PVA缓冲液将沉淀重悬，重复3次，之后在体视镜下用自制捡卵针挑选出卵丘细胞严密包裹三层以上、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes,COCs)，放入上述配制平衡后的成熟培养液中，在5％O

2、克隆胚胎的构建和融合激活

a、供体细胞的获取：

选用优秀公猪耳皮成纤维细胞作为供体，用酒精消毒猪耳部后，剪取小块耳组织，4℃冻存运回实验室，消毒清洗后将猪耳皮组织块剪碎，加入DMEM，离心去除上清液，将沉淀用适量血清重悬并转移到10cm培养皿中，并置于37℃、5％CO

b、卵母细胞准备：

在培养箱中培养42～44h后，用移液枪吸出卵丘卵母细胞复合体，放至含有200μl的透明质酸酶的1.5ml离心管中，反复轻柔吹打至少20次，在体式显微镜下挑选胞质均匀、排除第一极体、卵周隙明显的成熟卵母细胞作为核移植受体。

c、克隆胚胎的构建：

用Hoechst33342荧光染色液对卵母细胞染色，染色后转移至含7.5μg/mL CB的操作液中进行去核，在倒置显微镜荧光灯的照射下，用固定针固定卵母细胞，去核针快速吸取细胞核和第一极体，操作成功后及时拨开，挑选大小适中、光泽度较好且形态饱满的供体细胞注入到去核卵母细胞间隙内，注核后按批次将重构胚胎放入PZM-3培养液静置培养。

PZM-3培养液的组分和含量分别为：108.00mM氯化钠，10.00mM氯化钾，0.35mM磷酸二氢钾，0.40mM七水硫酸镁，25.07mM碳酸氢钠，0.20mM丙酮酸钠，2.00mM乳酸钙，2.00mM L-谷氨酰胺，5.00mM亚牛磺酸，4.00mg/mL牛血清白蛋白，20.00mL/L必需氨基酸，10.00mL/L非必需氨基酸。

d、克隆胚胎的融合激活：

将置于PZM-3培养液中的重构胚胎转移到融合液中平衡，平衡后将重构胚胎放入已铺满融合液的融合槽内，使供体细胞和卵母细胞的细胞膜接触面与电极平行，用100v/mm、80μs、2次脉冲直流电诱导融合同时激活，接着洗涤3遍后立即转入预平衡后的辅助激活液培养4h，计算融合率。

3、克隆胚胎的体外培养

a、胚胎培养液的配制：

以PZM-3培养液作为胚胎基础培养液，在此基础上添加0nM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM的HDACs/mTOR Inhibitor 1(HM1)，配置成不同浓度的胚胎培养液。

HDACs/mTOR Inhibitor 1(HM1)的化学式为C

b、克隆胚胎的体外培养：

将上述融合后的胚胎分批置于添加不同浓度HM1的胚胎培养液中，培养24h后，将胚胎培养液换为胚胎基础培养液PZM-3，培养至144h。

4、克隆胚胎的体外发育效率及囊胚质量

胚胎培养至48h时观察卵裂，培养至144h时观察囊胚(图1)，并取出囊胚，DPBS-PVA洗3遍，用含10μg/ml Hoechst 33342的DPBS染色5～10min后，置于载玻片，在倒置荧光显微镜下观察，采用SPSS 26软件对数据进行方差分析，比较不同浓度HDACs/mTOR Inhibitor 1处理下胚胎的发育情况，卵裂率和囊胚率见表1。结果表明，使用1μM处理猪体细胞克隆胚胎24h，可以显著提高猪克隆胚胎的体外发育效率，其144h囊胚率显著高于对照组。

表1不同浓度HDACs/mTORInhibitor 1处理下胚胎的发育情况

备注：统计分析3次重复试验的数据，计算其平均值±标准误，同一列的不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，下同。

5、RT-QPCR检测克隆胚胎HDAC1、LC3B和mTOR表达水平

胚胎培养至144h时，取出囊胚，DPBS清洗2遍后，置于1.5ml离心管中，-80℃冻存待用。提取胚胎RNA前，先解冻，然后在离心管中加入75μl RLT缓冲液(含1％巯基乙醇)，用移液枪吹打混匀后，加入5μl carrier RNA，混匀静置1min后，加入等体积的70％乙醇(75μl)，移液混匀，将样品转移至吸附柱中，离心，弃滤液；后续分别加入RW1、RPE以及80％乙醇清洗，离心，弃滤液后空离；采用20μl RNase-free ddH2O洗脱。洗脱后进行反转录，反转录后跑定量，95℃10s,60℃30s,72℃30s，再延伸72℃5min。根据定量结果采用GraphPad Prism软件分析HM1处理胚胎后囊胚的HDAC1、LC3B和mTOR基因的相关表达水平(图2)。结果显示，处理组HDAC1和LC3B基因显著下调(P＜0.05)，说明处理组胚胎提高了乙酰化(HDAC1)和自噬(LC3B)水平。

6、添加HM1提高动物克隆效率

将供体细胞与卵母细胞进行融合培养；并将融合后的胚胎置于含有浓度为1μM的HM1的培养液中，培养24h；将培养24h后的胚胎培养液换为PZM-3培养液，继续培养至144h；筛选和收集发育状态好的囊胚，将筛选出的囊胚置于代孕动物子宫内，待该动物出生，即可以提高该动物克隆效率。

本申请仅以猪克隆胚胎培养作为实施例，但是该HDACs/mTOR Inhibitor 1包括不限于在猪克隆胚胎上发挥作用，还可以在牛、羊、小鼠等动物上发挥作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。