一种2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物及其用途

技术领域

本发明涉及一种2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物及其用途。

背景技术

早在2006年肿瘤就被世界卫生组织列为慢性病的行列，随着全球人口增长和预期寿命延长，癌症将会变得更加常见。国际癌症研究机构(International Agency forResearch on Cancer)有关数据显示：2020年全球新增癌症病例约1930万例，癌症死亡病例近1000万例。相对于物理治疗和手术治疗，药物治疗仍是目前最主要的癌症治疗方式，但一直受副作用和耐药性的限制。因此通过化学合成手段发现疗效佳、毒性低的抗肿瘤先导化合物仍是目前的热点研究方向。

杂环化合物与生命过程密切相关，在药物设计和开发领域得到了广泛的探索。其中含硫化合物噻吩也因其多样的生物活性和药理活性而受到特别关注。大量的文献报道证明噻吩衍生物具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗结核及激酶抑制剂，抗氧化剂等良好的生物活性。目前含有噻吩基团的上市药物种类繁多，例如抗精神分裂药物奥氮平(Olanzapine)、抗惊厥药物噻加宾(Tigabine)、抗炎药物舒洛芬(Suprofen)和替诺立定(Tinoridine)，以及抗血小板聚集药物噻氯匹定(Ticlopidine)等

针对噻吩衍生物作为抗癌剂，通过不同机制发挥作用的过程已被广泛地探索。同时希夫碱类化合物自20世纪70年代初被发现有良好的生物活性以来，在医药领域应用甚广。2017年我们课题组Khurshed Bozorov博士的研究结果表明，含单取代席夫碱的2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物普遍具有良好的抗癌、抗病毒活性，其中含有2-硝基噻吩环取代的化合物(B)对肺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞和乳腺癌细胞等表现出较强的抗肿瘤活性，对甲型和乙型流感病毒也有良好的抑制作用。另一方面，酰胺键作为药效团或连接基团，在药物设计和开发中的作用也越来越突出，例如扑热息痛(paracetamol)是乙酰苯胺类药物中效果最好的抗炎解热镇痛药。因此基于拼合原理，设计合成一系列结构新颖的化合物，期望寻找高活性、低毒性的新型抗肿瘤先导化合物。

本发明以成本低廉的试剂为起始原料，经三步反应合成了24个不同取代的2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物，活性筛选结果表明：18个化合物对HeLa人宫颈癌细胞有一定的抑制活性；16个化合物对HT-29人结肠癌细胞有一定的抑制活性，其中有5个化合物对该细胞的抑制活性优于阳性对照药DOX(IC

参考文献：

[1]Sung,H.；Ferlay,J.；Siegel,R.L.；Laversanne,M.；Soerjomataram,I.；Jemal,A.；Bray,F.,Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates ofIncidence and Mortality Worldwide for 36Cancers in 185Countries.CA.CancerJ.Clin.2021,71(3),209-249.

[2]Pathania,S.；Narang,R.K.；Rawal,R.K.,Role of sulphur-heterocycles inmedicinal chemistry:An update.Eur.J.Med.Chem.2019,180,486-508.

[3]Archna；Pathania,S.；Chawla,P.A.,Thiophene-based derivatives asanticancer agents:An overview on decade's work.Bioorg.Chem.2020,101,104026.

[4]AbdElhameid,M.K.；Labib,M.B.；Negmeldin,A.T.；Al-Shorbagy,M.；Mohammed,M.R.,Design,synthesis,and screening of ortho-amino thiophenecarboxamide derivatives on hepatocellular carcinomaas VEGFR-2Inhibitors.J.Enzyme Inhib.Med.Chem.2018,33(1),1472-1493.

[5]Pillai,A.D.；Rathod,P.D.；Xavier,F.P.；Padh,H.；Sudarsanam,V.；K,K.V.,Tetra substituted thiophenes as anti-inflammatory agents:exploitation ofanalogue-based drug design.Bioorg.Med.Chem.2005,13(24),6685-92.

[6]Al-Mousawi,S.M.；El-Apasery,M.A.；Mahmoud,H.M.,Disperse dyes basedon aminothiophenes:their dyeing applications on polyester fabrics and theirantimicrobial activity.Molecules 2013,18(6),7081-92.

[7]Desantis,J.；Nannetti,G.；Massari,S.；Barreca,M.L.；Manfroni,G.；Cecchetti,V.；Palu,G.；Goracci,L.；Loregian,A.；Tabarrini,O.,Exploring thecycloheptathiophene-3-carboxamide scaffold to disrupt the interactions of theinfluenza polymerase subunits and obtain potent anti-influenzaactivity.Eur.J.Med.Chem.2017,138,128-139.

[8]Pandya,D.H.；Sharma,J.A.；Jalani,H.B.；Pandya,A.N.；Sudarsanam,V.；Kachler,S.；Klotz,K.N.；Vasu,K.K.,Novel thiazole-thiophene conjugates asadenosine receptor antagonists:synthesis,biological evaluation and docking studies.Bioorg.Med.Chem.Lett.2015,25(6),1306-9.

[9]Kang,D.；Fang,Z.；Li,Z.；Huang,B.；Zhang,H.；Lu,X.；Xu,H.；Zhou,Z.；Ding,X.；Daelemans,D.；De Clercq,E.；Pannecouque,C.；Zhan,P.；Liu,X.,Design,Synthesis,and Evaluation of Thiophene[3,2-d]pyrimidine Derivatives as HIV-1Non-nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors with Significantly Improved DrugResistance Profiles.J.Med.Chem.2016,59(17),7991-8007.

[10]Shah,R.；Verma,P.K.,Synthesis of thiophene derivatives and theiranti-microbial,antioxidant,anticorrosion and anticancer activity.BMCChem.Biol 2019,13(1),54.

[11]Bozorov,K.；Zhao,J.y.；Nie,L.F.；Ma,H.-R.；Bobakulov,K.；Hu,R.；Rustamova,N.；Huang,G.；Efferth,T.；Aisa,H.A.,Synthesis and in vitro biologicalevaluation of novel diaminothiophene scaffolds as antitumor and anti-influenza virus agents.Part 2.RSC Adv.2017,7(50),31417-31427.

[12]Bozorov,K.；Nie,L.F.；Zhao,J.Y；Aisa,H.A.,2-Aminothiophenescaffolds:Diverse biological and pharmacological attributes in medicinalchemistry.Eur.J.Med.Chem.2017,140,465-493.

[13]Bourgeaux,M.；Vomscheid,S.；Skene,W.G.,Optimized Synthesis andSimple Purification of 2,5-Diamino-thiophene-3,4-dicarboxylic Acid DiethylEster.Synth.Commun.2007,37(20),3551-3558.

本发明在对国内外有关专利、文献综合分析的基础上，合成了一种2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物，并研究了这些化合物对HT-29人结肠癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞、HeLa人宫颈癌细胞和HepG2人肝癌细胞的抑制活性，以便后期发现疗效显著、靶点明确的抗肿瘤活性候选药物。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物及其用途，所述化合物以氰基乙酸乙酯为初始原料，与N,N二甲基甲酰胺在三乙胺的催化下进行缩合，再与硫加成，得到2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯(A)，接着在乙醇溶液中加入等量的5-硝基噻吩-2-甲醛和催化量的对甲苯磺酸，加热回流得到单取代化合物2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(B)，最后，在催化量碱的作用下，与不同取代的酰氯反应得到目标2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物(C1-C24)。并考察了这24个化合物对HeLa人宫颈癌细胞、HT-29人结肠癌细胞、A549人非小细胞肺癌细胞和HepG2人肝癌细胞的抑制活性。结果显示：以阿霉素(DOX)为阳性对照药，18个化合物对HeLa人宫颈癌细胞有一定的抑制活性；16个化合物对HT-29人结肠癌细胞有一定的抑制活性，其中有5个化合物对该细胞的抑制活性优于阳性对照药DOX(IC

本发明所述的一种2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物，该类衍生物的结构为：

其中：

化合物C1为2-苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C2为2-(噻吩-2-甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C3为2-苯乙酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C4为2-苯丙酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C5为2-肉桂酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C6为2-(四氢-2H-吡喃-4-甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C7为2-环己烷甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C8为2-环戊烷甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C9为2-丁酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C10为2-戊酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C11为2-庚酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C12为2-萘甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C13为2-(4-甲基苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C14为2-(4-(三氟甲氧基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C15为2-(4-三氟甲基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C16为2-(4-氟苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C17为2-(4-氯苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C18为2-(4-溴苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C19为2-(3-甲氧基苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C20为2-(3-(三氟甲氧基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C21为2-(3-三氟甲基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C22为2-(2-三氟甲基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C23为2-(3-溴苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C24为2-(2-溴苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯。

所述2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物中的C1、C3、C4、C5、C7、C8、C10、C11、C12、C13、C15、C16、C17、C18、C20、C21、C22、C24在制备治疗HeLa人宫颈癌药物中的用途。

所述2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物中的C1、C3、C4、C5、C8、C9、C10、C11、C13、C14、C15、C17、C18、C21、C23、C24在制备治疗HT-29人结肠癌药物中的用途。

所述2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物中的C1、C3、C4、C5、C7、C8、C10、C12、C14、C15在制备治疗A549非小细胞肺癌药物中的用途。

所述2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物中的C2、C6、C9、C13、C16、C17、C19、C20、C21、C22在制备治疗HepG2人肝癌药物中的用途。

本发明所述的2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物的制备方法，按下列步骤进行：

化合物A的制备：

化合物A的合成参照文献，单质硫5g，156mmol和氰基乙酸乙酯31.5mL，311.9mmol的混合物中加N,N-二甲基甲酰胺25mL和三乙胺4.9mL，39mmol，室温反应6天，将所得混合物加入2L冷水中搅拌3h后过滤，干燥，再采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为体积比为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到化合物A，即2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯。

化合物B的制备：

化合物B的合成参照文献，在室温条件下，将黄色固体A 2.56g,9.9mmol和5-硝基噻吩甲醛1.71g,10.9mmol溶于10mL超干乙醇，加催化量的对甲苯磺酸0.69g,4mmol,88℃回流3h,薄层色谱(TLC)监测反应完毕，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为体积比2:1的石油醚:乙酸乙酯，得到化合物B，即2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯；

化合物C1-C24的制备：

将得到的化合物B 0.25mmol溶解在无水二氯甲烷中，然后滴加缚酸剂三乙胺0.37mmol和催化剂DMAP 0.06mmol，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用洗脱剂体积比5:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱，得到目标化合物C1-C24。

本发明所述的一种2-氨基噻吩类衍生物，是以氰基乙酸乙酯为初始原料，经过两步反应得到单取代的2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(B)，然后在催化量碱的作用下，与不同取代的酰氯反应得到目标2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物(C1-C24)，合成路线如下：

该类化合物经体外活性筛选结果表明：18个化合物对HeLa人宫颈癌细胞有一定的抑制活性；16个化合物对HT-29人结肠癌细胞有一定的抑制活性，其中有5个化合物对该细胞的抑制活性优于阳性对照药DOX(IC

具体实施方式

依据实施例对本发明进一步说明，但本发明不仅限于这些实施例；

试剂：所有试剂均为市售的分析纯。

实施例1

化合物2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯(A)的制备：

单质硫5g，156mmol和氰基乙酸乙酯31.5mL，311.9mmol的混合物中加N,N-二甲基甲酰胺25mL和三乙胺4.9mL，39mmol，室温反应6天，将所得混合物加入2L冷水中搅拌3h后过滤，干燥，再采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为体积比为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到化合物A为2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯，产率：56.9％，黄色固体，熔点：154-155℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例2

化合物2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(B)的制备：

在室温条件下，将黄色固体A 2.56g，9.9mmol和5-硝基噻吩甲醛1.71g，10.9mmol溶于10mL超干乙醇，加催化量的对甲苯磺酸0.69g，4mmol，88℃回流3h，薄层色谱(TLC)监测反应完毕，薄层色谱(TLC)监测反应完毕，用二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为体积比2:1的石油醚:乙酸乙酯，得到化合物B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：86.7％，红黑色固体，熔点：186-188℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例3

化合物2-苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C1)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C1为2-苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：80％，红色固体，熔点：255-256℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例4

化合物2-(噻吩-2-甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C2)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C2为2-(噻吩-2-甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：67％，橙红色固体，熔点：265-267℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例5

化合物2-苯乙酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C3)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C3为2-苯乙酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：73％，红色固体，熔点：218-220℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例6

2-苯丙酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C4)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C4为2-苯丙酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：70％，亮红色固体，熔点：158-160℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例7

化合物2-肉桂酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C5)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C5为2-肉桂酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：68％，橙红色固体，熔点：215-216℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例8

化合物2-(四氢-2H-吡喃-4-甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C6)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C6为2-(四氢-2H-吡喃-4-甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：67％，红色固体，熔点：223-224℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例9

化合物2-环己烷甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C7)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C7为2-环己烷甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：73％，橙红色固体，熔点：232-234℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例10

化合物2-环戊烷甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C8)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C8为2-环戊烷甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：70％，红色固体，熔点：215-216℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例11

化合物2-丁酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C9)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C9为2-丁酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：73％，橙红色固体，熔点：209-210℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例12

化合物2-戊酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C10)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C10为2-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基-5-戊酰胺基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：68％，橙黄色固体，熔点：195-196℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例13

化合物2-庚酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C11)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C11为2-庚酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：73％，黄色固体，熔点：160-162℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例14

化合物2-萘甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C12)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C12为2-萘甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：71％，红色固体，熔点：233-234℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例15

化合物2-(4-甲基苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C13)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C13为2-(4-甲基苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：71％，橙黄色固体，熔点：266-267℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例16

化合物2-(4-(三氟甲氧基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C14)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C14为2-(4-(三氟甲氧基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：76％，橙红色固体，熔点：203-205℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例17

化合物2-(4-三氟甲基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C15)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C15为2-(4-三氟甲基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：73％，橙黄色固体，熔点：248-249℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例18

化合物2-(4-氟苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C16)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C16为2-(4-氟苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：72％，橙红色固体，熔点：276-278℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例19

化合物2-(4-氯苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C17)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C17为2-(4-氯苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：71％，橙黄色固体，熔点：249-251℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例20

化合物2-(4-溴苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C18)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C18为2-(4-溴苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：71％，砖红色固体，熔点：254-255℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例21

化合物2-(3-甲氧基苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C19)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C19为2-(3-甲氧基苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：75％，橙黄色固体，熔点：230-231℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例22

化合物2-(3-(三氟甲氧基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C20)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C20为2-(3-(三氟甲氧基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：64％，橘红色固体，熔点：187-188℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例23

化合物2-(3-三氟甲基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C21)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C21为2-(3-三氟甲基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：70％，红色固体，熔点：218-219℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例24

化合物2-(2-三氟甲基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C22)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C22为2-(2-三氟甲基)苯甲酰胺基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：65％，黄色固体，熔点：248-249℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例25

化合物2-(3-溴苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C23)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C23为2-(3-溴苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：72％，红色固体，熔点：236-237℃；

核磁数据：

质谱数据：C

实施例26

化合物2-(2-溴苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯(C24)的制备：

将红黑色固体B为2-氨基-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯100mg，0.25mmol用超干二氯甲烷溶解，加52.4μL，0.37mmol三乙胺作缚酸剂和7.7mg，0.06mmol的DMAP作催化剂，0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的苯甲酰氯35μL，0.3mmol，室温搅拌6h，TLC监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，干燥、浓缩，采用正向硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱剂为5:1的石油醚:乙酸乙酯，得到目标化合物C24为2-(2-溴苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基氨基噻吩-3,4-二羧酸二乙酯，产率：73％，红色固体，熔点：247-248℃；

核磁数据：

质谱数据：C

将实施例3-26得到的2-氨基噻吩类衍生物进行体外抗肿瘤活性筛选：

MTT法检测细胞存活率：

实验过程：将生长在对数生长期的细胞，吸去培养基，磷酸盐缓冲溶液洗一次，加培养基终止，轻轻吹打，计数，以相应的细胞密度接种在96孔板中(100μL/孔)，过夜培养，加化合物(20μL/孔)，每一化合物设浓度梯度，每一浓度设3复孔，CO

计算公式：

细胞活力百分比％＝(化合物OD-空白OD/对照组OD-空白OD)×100％

细胞抑制率％＝1-细胞活力％＝[1-(化合物OD-空白OD/对照组OD-空白OD)]×100％，用graphpad，经公式拟合得IC

样品处理：样品用二甲基亚砜(DMSO)溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内；

数据处理及结果说明：初筛选择单浓度条件下，例如单体化合物浓度50μM；提取物50μg/μL，对样品的活性进行测试；对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％(Inhibition)大于70％，进一步测试活性剂量依赖关系，即IC

表1衍生物C1-C24的体外抗肿瘤生物活性结果

从表中可以看出：本发明所述的2,5-二氨基-3,4-噻吩二羧酸二乙酯衍生物C1-C24中，18个化合物对HeLa人宫颈癌细胞具有抑制活性，其中C7活性最好，IC