一种自组装重组胶原蛋白、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型的自组装重组胶原蛋白、其制备方法及其用途。

背景技术

胶原蛋白是一种生物高分子蛋白，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％。与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系，是生物科技产业最关键的原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业中均有广泛应用。

目前工业化使用的胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取动物的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，其主要来源为动物结缔组织，但从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险，同时大规模的制备会造成动物的需求量过大，供给侧的动物饲养造成巨大的压力。

随着基因工程技术的大规模应用，基因工程重组表达胶原利用模式化表达宿主以外源蛋白表达的形式成功的解决了胶原蛋白大规模制备的瓶颈。与传统的动物胶原提取相比，基因工程重组制备胶原具备以下方面优势：1.生产的胶原种类繁多，可以是常见的牛、猪、鱼等来源的胶原蛋白，同样可以生产人源的胶原蛋白，在医疗器械等领域上具有更好的安全性及免疫优效性。2.可以有效的避免动物源疾病，重组胶原通常以简单的原核或者真核细胞为表达宿主，其细胞致病源由于与人的细胞结构差别巨大，不能相互传播。3.生产周期短，节约成本，可以快速放大，适于工业化大规模生产。与动物培养长动辄3-5个月相比，微生物培养周期仅需2、3天且培养简单，提供简单的C源、N源就能进行大规模培养，易于经行工业级的制备。因此重组胶原特别是重组人源胶原的制备是目前胶原生产研究的热点。

当前大规模制备的重组胶原蛋白多采用大肠杆菌、酵母菌等微生物作为表达宿主，然而微生物细胞相比人细胞在蛋白翻译后修饰方面存在明显的劣势，仅能实现简单的糖基化、甲基化、乙酰化等修饰，因此制备的重组蛋白无法形成更高级的胶束、胶管结构，多以线状、α-螺旋、β-折叠等低级结构存在，因此普遍不能像天然胶原那样形成稳定且复杂的空间结构，在生产、储存过程中容易出现降解、局部聚集现象，增加了纯化和储存的难度。可以利用交联剂将重组胶原蛋白交联起来以增加其稳定性，但是交联剂对人体有毒或有免疫原性，因此从安全性考虑并不推荐使用交联剂。总之，目前尚未有很好地解决重组胶原降解问题的办法。

发明内容

氨基酸序列决定了重组胶原蛋白的空间结构，发明人在科研实践过程中偶然发现通过在人I型胶原氨基酸序列GAPGAPGLQGAPGSQ的52次重复的两端添加特定氨基酸序列，可以得到一种具有多聚体结构的大分子重组胶原蛋白。本发明的重组胶原蛋白在水溶液长期储存过程中表现出优异的稳定性，这是因为形成了更稳定的多聚体。

具体而言，本发明包括：

1.一种重组胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

SEQ ID No.1：MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM(G AP GAP G S Q G AP G LQ)

对于MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM(G A P G A PG S Q G A P G L Q)

2.根据项1所述的重组胶原蛋白，其中，SEQ ID No.1所示的氨基酸序列自组装形成多聚体(例如六聚体和/或七聚体和/或八聚体)结构。

3.根据项1或2所述的重组胶原蛋白，其还带有使其易于纯化的标签。

4.根据项3所述的重组胶原蛋白，其中，所述标签为His标签、Flag标签或c-Myc标签。

5.根据项1～4中任一项所述的重组胶原蛋白作为组织工程材料的用途。

6.根据项5所述的用途，其中，所述组织工程材料选自皮下填充剂、人工骨、人工皮肤、口腔可吸收生物膜、骨植入剂、血管支架、细胞间质支架和胶原蛋白海绵。

7.一种重组胶原蛋白水溶液，其包含项1～4中任一项所述的重组胶原蛋白。

8.根据项7所述的重组胶原蛋白水溶液，其中，所述重组胶原蛋白具有多聚体(例如六聚体和/或七聚体和/或八聚体)结构。

9.根据项7所述的重组胶原蛋白水溶液，其已于室温保存了3个月以上、优选6个月以上。

10.一种分离的核酸，其编码项1～4中任一项所述的重组胶原蛋白。

同时，本发明提供如前所述的重组胶原蛋白的制备方法，其特征是，其通过分子克隆的手段在表达宿主中高效表达所提供的氨基酸序列为SEQ ID No.1制备而成。

其中所述的分子克隆手段是指通过将如前所述的重组胶原蛋白的基因序列以质粒携带、整合到宿主染色体等方式利用宿主细胞本身高效的蛋白合成特性，高效制备重组胶原蛋白的方法；宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，包括：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等细菌宿主、毕赤酵母、酿酒酵母、动物细胞、植物细胞等真核宿主，优选大肠杆菌及毕赤酵母，更优选毕赤酵母。

在通过分子克隆的手段表达蛋白时，为了方便蛋白的识别、纯化、定量等用途，本领域工作人员通常会采用构建工程菌时添加对应的标签，本发明所述的制备方法，其包括了为方便纯化、识别、定量等在不影响胶原蛋白结构的基础上添加标签、小分子肽，如：His标签、Flag标签、c-MYC等。

另一方面，本发明同时提供自组装重组胶原蛋白的制备方法，其通过以下技术方案实现：

(1)获得目的基因构建相应的表达载体；

(2)转入表达宿主中，筛选阳性转化子，获得共表达菌株；

(3)培养(2)中获得的表达菌株，表达目的蛋白；

(4)分离纯化，即得自组装重组胶原蛋白。

其中：

在步骤(1)中，所述的目的基因的获得可以是PCR扩增也可以是全基因合成。

在步骤(1)中，相应的质粒是指，能够在选定的表达系统中高通量组成表达或诱导表达胶原基因质粒。

在步骤(3)中的表达可以是组成表达、诱导表达中的一种或者两种表达的组合，其中诱导表达的诱导剂可以是IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、乳糖、半乳糖、甲醇等诱导剂。

在步骤(4)中，重组胶原蛋白的分离纯化方法可采用盐析、超滤、色谱层析、等电点沉淀、膜分离等方法中的一种或几种的组合，优选色谱层析与膜分离的组合，更优选离子交换层析与膜分离的组合。

此外，本发明同时提供了如前所述的重组胶原蛋白在护肤品、保健品、组织材料、医疗器械等中应用，优选在组织材料、医疗器械中的应用。

本发明的有益效果在于：提供了一种可在水溶液中保持稳定自组装特性的重组胶原蛋白的氨基酸序列、其制备方法及应用，自组装后的重组胶原蛋白长期储存稳定性优异，有效地避免了蛋白在储存过程中的降解问题。

附图说明

图1为显示NHLC蛋白与对照品的分子排阻色谱检测结果的图。

图2为显示NHLC蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果的图。

图3为显示NHLC蛋白具有自组装特性的透射电镜图。

图4为显示HLC蛋白不具有自组装特性的透射电镜图。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。

实施例1：重组胶原蛋白在大肠表达系统中的制备

1.pKK223-3-HLC表达菌株构建

将如SEQ ID No.1的氨基酸序列根据大肠杆菌密码子偏好优化后，通过全基因合成的方式合成后，直接连接在pKK223-3质粒上即得pKK223-3-NHLC质粒，将pKK223-3-NHLC以热击的方式转入DE3感受态细胞，涂布抗性平板，挑取平板上的单菌落即为表达菌株。

2.目标蛋白的表达

(1)挑取经菌落PCR验证构建成功的单菌落，接种至装有3.0ml LB培养基试管中(添加氨苄抗生素)，37℃培养10-12h，获得种子液。

(2)将培养好的种子液以1％的接种量接入100ml LB液体培养基中，

37℃，220rpm培养至OD

(3)以pH6.0的PBS缓冲液配制10％(g湿菌体/mL PBS)的菌悬液，800bar条件下高压匀浆3min，9000rpm离心10min收集离心上清液即为粗蛋白溶液。

3.目标蛋白分离纯化

(1)将离心收集的粗蛋白上清液中加入终浓度为60％的NaCl，搅拌溶解后常温下静置2h，9000rpm离心10min后收集上清液。将收集的上清液经30KD超滤膜浓缩脱盐。

(2)将浓缩脱盐后的蛋白上清液用磷酸调整pH至6.5，阳离子交换树脂上样，通过0.5M NaCl洗脱后获得目标蛋白；

(3)将收集的目标蛋白溶液经30KD超滤膜脱盐后，然后置于-20℃冰箱预冻4h，然后转入真空冷冻干燥机中进行冻干，48h后收集冻干后蛋白，即为NHLC蛋白。

实施例2：对照蛋白在大肠表达系统中的制备

将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列去掉接头序列而得到的氨基酸序列(即GAPGAPGLQGAPGSQ重复52次)根据大肠杆菌密码子偏好优化后，通过全基因合成的方式合成后，参照实施例1中描述的方法，进行蛋白的制备，获得的蛋白命名为HLC蛋白。

实施例3蛋白质分子量及结构确认

1.NHLC蛋白自组装性能检测

取实施例1中纯化冻干后的蛋白5mg，加入10mL超纯水中，完全溶解后。通过superdex 200increase分子排阻色谱柱进行检测，流动相为超纯水，流速为0.75mL/min，上样体积为500μL。同时在该条件下分别进行不同分子量的已知蛋白的对照检测。

如图1所示，在保留时间为10min时NHLC蛋白出峰(图1下)，对应的相同出峰时间的已知蛋白的分子量为约670KD(图1上)，因此NHLC蛋白的分子量为约670KD。

图2所示，NHLC蛋白单体分子量为约90kD。

结合图1和图2的检测结果可知，NHLC蛋白发生了自组装，以多聚体(七聚体)的形式存在。

2.透射电镜观察NHLC蛋白的自组装特性

取实施例1、2制备的蛋白，分别配制成浓度为1.0g/L的水溶液，通过透射电镜观察溶液中蛋白的形态，结果图3和图4所示。由图3和图4可知，实施例1中制备的NHLC蛋白在水溶液中能够自组装，而实施例2中制备的HLC蛋白无此特性。

实施例4蛋白溶液稳定性加速试验

将实施例1、2中制备的重组胶原蛋白用ddH2O配置成蛋白浓度为1mg/mL的蛋白溶液，在超净工作台中用0.22μm的无菌滤器过滤后分装到无菌离心管中密封，置于40℃±2℃相对湿度75％±5％的条件下，分别于1个月、2个月、3个月、6个月取样，每次取样3管，检测蛋白溶液纯度(高效液相色谱法测定蛋白纯度)变化，结果如表1所示。

表1蛋白溶液稳定性加速试验结果

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由表1的测试结果可知，6个月内NHLC蛋白的纯度变化低于1％，其在长期保存稳定性加速试验条件下稳定，基本上未发生降解；而作为对照的HLC蛋白储存6个月后纯度仅为78.35％，降解明显。