一种与白菜类作物开花时间紧密连锁的调控温度途径FLM基因SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学、遗传学和分子标记领域，具体涉及一种与白菜类作物开花时间紧密连锁的调控温度途径FLM基因SNP分子标记及其应用。

背景技术

白菜类作物都属于十字花科芸薹属(Brassica rapa subsp.pekinensis)植物，具有生长周期短，对气候土壤条件适应性强等特点，是一类重要蔬菜或油料作物，具有很高经济价值。白菜类作物主要包括大白菜、小白菜、芜菁、白菜型油菜等几种重要类型，在我国范围内得到普遍种植，国外也广泛分布。

抽薹开花现象是植株从营养生长向生殖生长转变的重要象征，此过程中，营养生长阶段积累的营养物质会在开花阶段逐步转化并发育形成种子。抽薹开花时间是白菜类作物重要的农艺性状，直接影响白菜类作物的产量品质。芸薹属植物抽薹开花有六个途径，即春化途径、光周期途径、自主途径、赤霉素途径、年龄途径和环境温度途径。其中，环境温度通过影响植株的营养生长调控其抽薹开花时间，呈现高温促进开花，低温抑制开花的现象。

有综述报道FLM基因的研究进展，得出FLM是抑制开花的基因。MADS-Box基因家族是一个很大的一个转录因子家族，编码一个MADS结构域，在花发育中起着重要作用。FLOWERING LOCUS M(FLM)是环境温度途径中调控开花的关键基因，编码MADS-box蛋白。FLM基因是调控环境温度途径的主要基因，基于大白菜基因组测序信息(http://brassicadb.drg/brad/)，FLM基因在白菜A基因组第2号染色体上。本发明在环境温度途径调控开花时间的候选基因基因BrFLM_A02基因上找到的与白菜类作物开花时间紧密连锁的调控环境温度通路的基因SNP分子标记属首次发现。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种与白菜类作物开花时间紧密连锁的调控温度途径FLM基因SNP分子标记及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种与白菜类作物开花时间紧密连锁的调控温度途径FLM基因SNP分子标记，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示BrFLM_A02基因的第2373个碱基，存在A/T多态性。

具体的，当所述碱基为A突变为T，产生非同义突变，导致氨基酸由组氨酸(H)突变为亮氨酸(L)。

本发明的第二个目的是提供用于检测前述的SNP分子标记的特异性引物对。

进一步的，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.2所示正向引物：5′-TCGTCGATCGTTATGAAATACAA-3′，

SEQ ID NO.3所示反向引物：5′-GGTGAATTGTTCTCTCTCCTTC-3′。

本发明的第三个目的是提供前述的白菜类作物开花时间紧密连锁的SNP分子标记在鉴定白菜类作物在低温条件下开花时间中的应用。

进一步的，SNP分子标记的基因型为A/A时，白菜类作物为晚开花型；SNP分子标记的基因型为A/T或T/T时，白菜类作物为早开花型。

进一步的，包括如下步骤：

(1)提取待测白菜类作物基因组DNA；

(2)利用前述的引物对对前述的SNP分子标记进行PCR扩增；

(3)对PCR产物进行测序，确定前述的SNP分子标记的碱基，从而鉴定白菜类作物开花时间。

进一步的，步骤(2)中，PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；72℃延伸5min；产物4℃保存；PCR反应体系为20μL，分别为：Mix10μL、模板DNA1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、ddH

本发明的第四个目的是提供前述的白菜类作物开花时间紧密连锁的SNP分子标记在白菜类作物选育中的运用。

本发明的第五个目的时提供前述的特异性引物对在鉴定白菜类作物在低温条件下开花时间中的应用。

本发明的第六个目的是提供前述的特异性引物对白菜类作物选育中的运用。

本发明所述低温条件为不高于24℃；优选的，所述低温条件为-4℃～24℃；进一步优选的，所述低温条件为8℃。

本发明技术方案有益效果在于：

本发明BrFLM_A02基因的第2373个碱基A→T的变异，显著影响开花时间，A位点连锁晚开花类型，T位点连锁早开花类型；且该位点的变异是非同义突变，导致氨基酸由组氨酸突变为亮氨酸。本发明可以为白菜类作物环境温度途径影响开花时间研究提供理论依据，为选育早开花白菜类作物提供有效手段。该SNP位点可以作为分子标记进行辅助育种工作，提高白菜类作物晚开花类型的育种效率，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点，在聚合有利性状的同时，还可以通过遗传背景选择，减少连锁累赘，加快育种讲程。

附图说明

图1为BrFLM_A02的cDNA序列(上)、翻译的蛋白质序列(下)和其突变位点，以及氨基酸突变；

图2为亲本杂交后代F

图3为F

具体实施方式

以下实施案例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明选择环境温度途径调控开花时间的候选基因BrFLM_A02，在起源于36个国家的213份白菜类作物上，使用测序平台I11uminaHi Seq

进一步地，对该位点在F

DNA提取方法为CTAB法，步骤如下：

(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB,研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min,期间不时缓慢摇匀。

其中1.5×CTAB配方如下(1L)：CTAB 15g、1mol/L的Tris.C1(pH为8.0)75mL、0.5mol/L的EDTA 30mL、NaC1 61.4g，加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。

(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1，v/v)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇,混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。

(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入50μL Buffer TE溶解DNA。

(5)SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示PCR引物对中，上游引物距BrFLM_A02基因起始密码子193bp长度，下游引物距起始密码子458bp长度，上下游引物之间有245bp长度的序列。用于扩增该位点的引物序列为，正向引物：5′-TCGTCGATCGTTATGAAATACAA-3′(SEQ IDNO.2)，反向引物：5′-GGTGAATTGTTCTCTCTCCTTC-3′(SEQ ID NO.3)。

PCR体系如表1所示。

表1PCR反应体系

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存。

在F

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。