一种基于小鼠芳香烃受体的二噁英类物质活性测定的重组载体及方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于小鼠芳香烃受体的二噁英类物质活性测定的重组载体及方法。

背景技术

二噁英是环境中广泛存在且毒性极强的持久性有机污染物(POPs)，在废弃物焚烧和工业生产过程中非故意产生, 具有半挥发性、长距离迁移、冷捕集效应和生物富集/放大等特性，其在细胞内主要作用位点为芳香烃受体（又称二噁英受体）aryl hydrocarbonreceptor（AHR），通过激活AHR产生一系列毒性效应，可对生态环境和人体健康构成严重威胁，是《斯德哥尔摩公约》中首批限制使用的 12 种持久性有机污染物之一。当前不断发现的新型类似污染物（例如：卤代咔唑PHCZs、多氯代二苯硫醚 PCDPSs、多氯萘 PCNs 等）在分子结构、生物效应等方面具有类似二噁英的性质，其中，2,3,7,8-四氯代二苯并-对-二噁英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-

AHR的转录激活这一分子起始事件是二噁英及类似物产生毒性效应的最初事件，简要包括：1）配体在细胞质内结合AHR并转位至核内；2）AHR与伴侣蛋白ARNT结合并被募集到二噁英受体AHR响应元件DRE上；3）配合基础转录机器启动所调控基因的转录（如CYP1A1、CYP1B1）。围绕这一机制研发生成了众多评估AHR活性、配体筛选和环境样品的定量方法，其中AHR报告基因方法也已成为对新型二噁英及类似污染物毒性评估的重要工具。然而，由于不同生物体内主要介导二噁英毒性的芳香烃受体AHR的敏感性不同，因此不同生物暴露于二噁英所导致的风险存在明显差异，且不同的二噁英类物质单体对不同物种AHR的激活效率也存在明显差异，因此需要进行有针对性的研究。

当前，用于评估不同物种AHR活性的典型报告基因方法的技术路线为：基于COS-7细胞体外瞬转表达不同物种AHR亚型的表达载体，并同时转入含有二噁英受体AHR响应元件DRE序列的报告基因载体，随后加入待测化合物并通过报告基因方法检测该AHR的活性/敏感性，以及化合物针对特定AHR亚型的激活能力。

但由于该现有技术的瞬时转染效率误差、转入质粒多难以质控、灵敏度弱、COS-7少量的内源猴AHR的干扰，不足以高效地开展多物种的AHR活性评估，因此需要一种更为灵敏、准确的方法来研究不同物种AHR亚型对二噁英及类似物的敏感度。

除上述方法之外，一项衍生出的基于Gal4-UAS的哺乳动物单杂交报告基因系统是一项替代性的新型转录因子、核受体活性检测方法。通过将核受体的LBD-TAD区域（配体结合区-转录激活区）串联融合至表达载体中的Gal4结构域后方，转染表达后的融合蛋白将可结合至报告基因载体的上游激活序列Gal4-UAS区域，通过核受体自身TAD的配体依赖的转录激活能力，使报告基因的表达增强，通过分析报告基因活性的强弱来反映核受体被激活的水平及配体的激活效力。

发明内容

二噁英及其类似物通过激活细胞内的芳香烃受体产生一系列毒性效应，由于不同生物体内主要介导二噁英毒性的AHR的敏感性不同，因此不同生物暴露于二噁英所导致的风险存在明显差异，需要进行有针对性的研究。

目前，针对不同物种AHR亚型对二噁英及类似物敏感度的分析中，基于COS-7细胞体外瞬转的方法有以下不足：瞬时转染效率误差、转入质粒多难以质控、灵敏度弱以及COS-7细胞内有少量内源猴AHR的干扰，所以该方法在AHR功能鉴定研究中多用于强AHR配体TCDD的研究，而后续针对较弱的AHR激活能力的二噁英类似物的研究中发现这一方法表现欠佳。然而多数情况下，新型的二噁英类似物的活性是较弱的，本方法由于自身的特性难以有效地开展多物种的AHR激活能力的分析。

故本发明提供了基于小鼠芳香烃受体的二噁英类物质活性测定的重组载体，利用基于Gal4-UAS的哺乳动物单杂交报告基因系统进行啮齿类动物--小鼠AHR活性测定，及二噁英类物质激活能力即毒性评估。该系统使酵母Gal4结构域融合表达有所优选截取的不同区段小鼠AHR序列，使融合表达的Gal4-AHR可以在外界二噁英类物质刺激下，结合于人工的结合区Gal4-UAS并引发下游报告基因的表达，避免了传统报告基因方法中内源AHR同时结合于二噁英响应元件DRE所引起的潜在的内源干扰效应，可以用于测定哺乳动物中啮齿类动物--小鼠的AHR的活性，并可用于分析测定二噁英及二噁英类似物潜在的激活能力（即毒性效力）。本发明通过优化并截取高效的AHR受体序列区域，提供2种高效的基于小鼠AHR的二噁英类物质活性测定的重组载体及相关测定方法，与现有技术相比，本方法排除了内源AHR的干扰；降低了非特异性报告基因的背景值；转入质粒较少从而降低瞬时转染误差，同时通过对相关技术参数进行了系统的优化，提升系统的灵敏度和稳定性。建立一种毒理学测试方法，解决跨物种的高效毒性评估问题，为研究新型类二噁英污染物生态毒性风险提供有效工具。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

基于小鼠芳香烃受体的二噁英类物质活性测定的重组载体，其核苷酸序列任选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 4。

一种小鼠芳香烃受体的二噁英类物质活性测定的重组载体，所述的核苷酸序列的引物对选自SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 8中的一条与SEQ ID NO. 9。

一种检测试剂或试剂盒，其含有重组载体。

一种重组载体/检测试剂或试剂盒在小鼠AHR受体的敏感性测定及二噁英类物质的激活能力/毒性效力评估中的应用。

有益效果

本发明通过设计并优选小鼠的AHR基因区段，提供基于小鼠芳香烃受体的二噁英类物质活性测定的重组载体，以减少非特异性的报告基因背景值，消除所采用的检测细胞株内源AHR的干扰。本发明基于哺乳动物单杂交的报告基因技术进行系统的优化，建立一种二噁英毒理学测试方法，解决跨物种的高效毒性评估问题，为研究新型类二噁英污染物生态毒性风险提供有效工具。

附图说明

图1 为重组载体对TCDD响应图；

图2 为重组载体的剂量-效应曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

以灵敏度最优的重组质粒pBIND-mAHR-2的构建为例（pBIND-mAHR-1、pBIND-mAHR-3、pBIND-mAHR-4构建的步骤相同）详细如下：

步骤一：小鼠AHR序列区段的优选及引物设计

1)根据小鼠AHR的序列信息，预测DNA结合结构域 DNA Binding Domain (DBD)，配体结合结构域 Ligand Binding Domain (LBD)位置，设计一对引物mAHR-2F，mAHR-R。

mAHR-2F:5’-CGTCGACTTGACGCGTTGATAGGGAGGTTAAAGTATCTTCATGGACAGAA-3’

mAHR-R:5’-CTGCGGCCGCTCTAGATGATTCAACTCTGCACCTTGCTTAGGAATGCC-3’

以mAHR-2F，mAHR-R为引物，小鼠AHR的pcDNA3.1(+)表达质粒菌液为模板，PCR扩增出序列，该步骤使用PrimeSTAR高保真PCR酶。

在1.5ml离心管中依次加入：ddH

PCR反应参数设置：

反应结束后，将50μl PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，在电泳图谱上出现唯一的一条符合预期大小的1700bp左右的片段，利用胶回收试剂盒回收该扩增产物，同时将质粒空载体pBIND用EcoRV进行酶切，并胶回收，然后用同源重组连接试剂盒连接酶将目的序列与载体片段在50℃下进行20min连接，转化得到pBIND-mAHR-2连接产物。

2)将50μl感受态细胞加入装有10μl连接产物的离心管中，混匀，冰浴30min。

3)42℃热激60s，然后冰浴2min，加入350μl新鲜LB培养基（不含氨苄），置37℃摇床200rpm复苏60min，离心，弃上清，加入100μl新鲜LB培养基（含氨苄）取50μl涂平板(含Amp100μg/ml)。37℃培养过夜。

挑取pBIND-mAHR-2单克隆，进行菌落PCR验证。具体为：依次加入ddH

将验证成功的pBIND-mAHR-2克隆送到生工公司以通用引物进行测序，进一步验证得到质粒序列的准确性。

其他载体pBIND-mAHR-1、pBIND-mAHR-3、pBIND-mAHR-4方法同上，所获得的四个重组载体的插入序列SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 4。

实施例2转染重组质粒

首先将改造后的重组质粒进行初步筛选实验。

1 .转染前36h，将生长状况良好（密度达70%以上）的HEK-293T细胞消化并进行细胞计数，稀释并按照40000细胞/孔接种进96孔板，使其在转染日密度为90％以上。细胞铺板在含血清，含抗生素的正常生长的完全培养基中。

2 .转染前将原细胞培养基吸弃，使用Opti-MEM稀释100ng DNA（40ng PG5luc (含有Gal4-UAS的报告载体pG5luc) + 60ng pBIND-mAHR-2）,并混合lipo8000转染试剂，制备成转染混合液，将转染混合液加入培养孔中。

在37℃，5% CO

3 .在37℃，5% CO

分析测试初步获得每种重组质粒在单一剂量1×10

实施例3

对重组载体进行一系列TCDD浓度梯度的暴露，测试重组载体性能的剂量-效应曲线。

1 .转染前36h，将生长状况良好（密度达70%以上）的HEK-293T细胞消化并进行细胞计数，稀释并按照40000细胞/孔接种进96孔板，使其在转染日密度为90％以上。细胞铺板在含血清，含抗生素的正常生长的完全培养基中。

2 .转染前将原细胞培养基吸弃，使用Opti-MEM稀释100ng DNA（40ng PG5luc (含有Gal4-UAS的报告载体pG5luc) + 60ng pBIND-mAHR-2）,并混合lipo8000转染试剂，制备成转染混合液，将转染混合液加入培养孔中。

在37℃，5% CO

3.在37℃，5% CO

分析测试每种重组载体在一系列TCDD浓度梯度的暴露下的剂量-效应曲线。得出结果如图2，改造后的pBIND-mAHR-1、pBIND-mAHR-2、pBIND-mAHR-3、pBIND-mAHR-4对于强AHR激活剂TCDD都有响应，而pBIND-mAHR-1、pBIND-mAHR-2重组质粒的响应最为明显，随着TCDD浓度的升高，含有pBIND-mAHR-1、pBIND-mAHR-2重组质粒的细胞报告基因响应值出现了明显的趋向性变化，具有正相关性。其中pBIND-mAHR-2重组质粒相比于其他重组质粒，其效应倍数最高，最高倍数（对比溶剂对照DMSO）达到30倍以上，EC50为2.355×10

综上所述，本发明按照设计截取不同区段的小鼠AHR序列并亚克隆至pBIND单杂交载体上，构建了一系列基于小鼠芳香烃受体的二噁英类物质活性测定的重组载体：pBIND-mAHR-1、pBIND-mAHR-2、pBIND-mAHR-3、pBIND-mAHR-4；通过测试并优选了其中的pBIND-mAHR-1和pBIND-mAHR-2作为高效的重组载体，其最高倍数（对比溶剂对照DMSO）分别达到20倍、30倍以上，EC50分别为4.655×10