黑沙蒿在防治农业害虫方面的应用及其微胶囊剂、制备方法与防治方法

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，涉及黑沙蒿在防治农业害虫方面的应用及其微胶囊剂、制备方法与防治方法。

背景技术

黑沙蒿(Artemisia ordosica)是菊科蒿属植物，俗称油蒿，全草均可入药，常用于消炎散肿、宽胸利气、杀虫和止血，可治疗风湿性关节炎、腮腺炎、疥疮红肿、腹胀、肠梗阻、尿闭等疾病。是沙地植被的主要种类和优势种之一。分布于内蒙古、陕西、宁夏、甘肃、新疆等省区处于典型草原和荒漠草原带，也出现于草原化荒漠带，生于流动、半流动、半固定至固定沙地。黑沙蒿为小灌木，株高50～80cm，属深根性植物，主根粗而多数，木质，根状茎粗壮，地上部分枝条密集、柔软匍匐。曾有文献报道黒沙蒿含有微量元素、挥发性成分以及非挥发性化学成分。

枸杞木虱，学名：Poratrioza sinica Yang et Li.，属半翅目，枸杞木虱科。分布在宁夏、甘肃、新疆、陕西、河北、内蒙古等。为害多种果树、枸杞、龙葵等。以成、若虫在叶背把口器插入叶片组织内，刺吸汁液，致叶黄枝瘦，树势衰弱，浆果发育受抑，品质下降，造成春季枝干枯。

西花蓟马是蓟马科Thripidae的一类动物，属缨翅目Thysanoptera。西花蓟马食性杂，已知寄主植物多达500余种。该虫原产于北美洲，1955年首先在夏威夷考艾岛发现，曾是美国加州最常见的一种蓟马。

棉蚜，学名：Aphis gossypii Glover，是蚜科蚜属的一种昆虫，俗称腻虫。棉蚜为世界性棉花害虫。中国各棉区都有发生，是棉花苗期的重要害虫之一。寄主植物有石榴、花椒、木槿、鼠李属、棉、瓜类等。

目前，防治害虫的方法主要包括物理机械防治法和化学防治法。物理机械防治，即利用害虫习性进行防治的习性防治法，是利用物理的方法杀死害虫害螨，或恶化害虫的生活环境，或采用机械方法将害虫与粮食分开，防止或减轻害虫为害的一种方法。化学防治法就是利用杀虫剂防治害虫的方法，杀虫效果迅速，彻底，杀虫谱广，但是杀虫剂对人和高等动物都有毒性，20世纪90年代，由于长期使用高毒化学农药产生负面影响，世界每年均有5万多人中毒，死亡5000～7000人，并且容易使害虫产生抗药性。

植物源农药的主要成分是天然存在的化合物，这些活性物质主要由C、H、O等元素组成，来源于自然，在长期的进化过程中已形成了其固定的能量和物质循环代谢途径，所以在施用时，不易产生残留，易于降解，在环境中积累毒性的可能性小，与环境的相容性好，能保持农产品优良品质，满足人民提高生活质量和出口创汇需要。进入WTO后，对国际上日益增长的有机食品(AA级)，无公害产品(A)，具有保证作用，避免了因施用高毒化学农药而带来的负面影响。植物源农药与化学农药相比，一般无毒无残留，对人、畜安全。植物源农药有效成分易被分解成失活物质，无法在害虫体内累积，因此不易对其它有益昆虫或者害虫天敌造成危害，对保护生态环境提供了帮助。

目前本领域尚未出现黒沙蒿可用于生物防治领域杀灭害虫的报道。

发明内容

根据本领域的上述需求和空白，本发明提供一种对人和动物安全无毒，对环境友好，且对害虫有效的防治方法及药剂。

本发明要求保护的技术方案如下：

黑沙蒿在防治农业害虫方面的应用；所述农业害虫选自西花蓟马、枸杞木虱或棉蚜。

采用黑沙蒿精油防治农业害虫；

优选地，所述黑沙蒿精油为提取自植株地上部分的精油。

所述黑沙蒿精油的活性成分包括：联苯、红没药醇、(-)-斯巴醇、α-姜黄烯、橙花叔醇、β-蒎烯、库贝醇、α-蒎烯。

一种防治农业害虫的药剂，其特征在于，其活性成分包括：黑沙蒿精油；所述农业害虫选自西花蓟马、枸杞木虱、棉蚜。

所述黑沙蒿精油为提取自植株地上部分的精油；

优选地，所述黑沙蒿精油的活性成分包括：联苯、红没药醇、(-)-斯巴醇、α-姜黄烯、橙花叔醇、β-蒎烯、库贝醇、α-蒎烯。

所述生物防治药剂的剂型选自：喷雾剂、粉剂、片剂、胶囊剂、液体制剂；

优选地，所述生物防治药剂还包括药学上可接受的辅料。

一种防治农业害虫的药剂的制备方法，其特征在于，包括：以黑沙蒿精油做为生物防治药剂的活性成分。

所述黑沙蒿精油为提取自植株地上部分的精油；

优选地，将黑沙蒿植株地上部分采用水蒸气蒸馏法提取后再萃取；

优选地，所述水蒸气蒸馏法的提取温度为70-120℃优选90℃；提取时间为4-12h优选6h；

优选地，所述萃取剂为正己烷，萃取时间为2-6h，优选3h；

优选地，萃取后的正己烷层干燥、浓缩；

优选地，所述干燥指用无水硫酸钠去除正己烷层的水分；

所述浓缩指干燥后的产物用旋蒸仪旋转蒸发去除正己烷后得到黑沙蒿精油；

优选地，水蒸气蒸馏法提取前将黑沙蒿植株的地上部分自然阴干、剪碎；

优选地，所述水蒸气蒸馏法提取指：将阴干剪碎后的黑沙蒿植株的地上部分置于圆底烧瓶中采用精油提取器进行提取；

优选地，所述一种生物防治药剂的制备方法还包括：添加药学上可接受的辅料。

所述防治农业害虫的药剂选自液体剂和微胶囊剂；优选地，所述液体剂指黑沙蒿精油溶于乙醇得到的黑沙蒿精油溶液；优选地，所述微胶囊剂采用包结络合法将含有黑沙蒿精油的芯材溶液逐滴加入壁材溶液中搅拌后静置，然后过滤，去除未反应的精油后进行烘干；

芯材溶液与壁材溶液重量比为1∶4-1∶8；

所述芯材溶液为黑沙蒿精油溶解于乙醇溶液中，搅拌至完全溶解所得；

所述壁材溶液为β～环糊精溶解在去离子水中，搅拌至完全溶解所得；

所述溶解温度为30-60℃，优选50℃；

所述环糊精质量浓度为2.83％w/v；获得的微胶囊剂质量浓度是测出来的，没有选择条件

所述搅拌为200-1000r/min，优选500r/min；

所述搅拌时间为1-2h；

所述静置为4℃冰箱中静置24h；

所述去除未反应的精油采用乙醇进行冲洗去除未反应的精油；

所述烘干的温度为30-60℃，优选40℃；

所述烘干的时间3-6h，优选4h。

一种防治农业害虫的方法，其特征在于，采用黑沙蒿防治农业害虫；所述农业害虫选自西花蓟马、枸杞木虱、棉蚜；

优选地，采用黑沙蒿精油溶液进行杀虫；

优选地，所述杀虫方式选自：触杀或熏杀；

优选地，所述黑沙蒿精油溶液杀灭棉蚜的半致死浓度为5.87mg/mL；

优选地，所述黑沙蒿精油溶液杀灭西花蓟马的半致死浓度为1.57mg/mL；

优选地，所述黑沙蒿精油溶液杀灭枸杞木虱的半致死浓度为0.81mg/mL。

本发明首次提出并请求保护黑沙蒿在生物防治方面的新用途，该新用途主要通过黑沙蒿精油熏杀或触杀西花蓟马、枸杞木虱、棉蚜得以实现。本发明还首次提取并鉴定出黑沙蒿精油中的活性杀虫成分，它们包括：联苯、红没药醇、(-)-斯巴醇、α-姜黄烯、橙花叔醇、β-蒎烯、库贝醇、α-蒎烯等。同时，本发明通过致死试验证实了黑沙蒿精油对西花蓟马、枸杞木虱、棉蚜的高致死效率，其中，黑沙蒿精油对棉蚜的毒力低于对照药剂除虫菊提取物，对枸杞木虱的毒力高于对照药剂除虫菊提取物；对西花蓟马的毒力高于对照药剂苦楝油。利用本发明的黑沙蒿新用途或采用本发明的杀虫剂/杀虫方法可高效杀灭西花蓟马、枸杞木虱、棉蚜，且黑沙蒿分布范围广泛，简单易得，成本低廉，适于大规模推广应用。

具体实施方式

下面参考具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅作为解释和说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制。

实验材料的来源和获取途径

棉蚜(Aphis gossypii)接种在温室棉花叶片上，在植株上继代饲养并繁育3代以后备用，饲养条件为：温度(25±1)℃，湿度(40±5)％，L//D＝16h//8h。

枸杞木虱(Bactericera gobica)采自宁夏农林科学院枸杞研究所未施药枸杞园，在枸杞植株继代饲养并繁育3代以后备用，饲养条件为：温度(26±1)℃，湿度(40±5)％，L//D＝16h//8h。

西花蓟马(Frankliniella occidentalis)采自宁夏农林科学院枸杞研究所未施药枸杞园，在人工气候箱以菜豆豆荚饲养3代以上备用。饲养条件为：温度(25±1)℃，湿度(40±5)％，L//D＝16h//8h。

申请人声明自申请日起二十年内，可向公众发放用于必要的验证试验。

黑沙蒿(Artemisia ordosica)，采集时间为2021年5月28日，采集地点为宁夏回族自治区中卫市余丁乡大口子沟。

黑沙蒿精油：本发明的方法适用于只适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。本发明制备黑沙蒿精油的方法如实验例1。

供试药剂：除虫菊提取物(25％除虫菊酯Ⅰ+除虫菊酯Ⅱ，西格玛公司)；苦楝油(江西雪松天然药用油有限公司)；食品级β-环糊精(山东彤旺生物科技有限公司)；除虫菊素水乳剂(1.5％，云南南宝生物科技有限责任公司)

仪器：GC-MS(日本-岛津-QP2010 plus)；微量点滴仪(英国/Burkard，英国布尔卡德制造有限公司)；数显恒温磁力搅拌器(LC-DMS-H，上海力辰邦西仪器科技有限公司)；循环水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，天津市华鑫仪器厂)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9141，上海浦东荣丰科学仪器有限公司)；旋转蒸发仪(Hei-VAP(ML)，德国海道尔夫(Heidolph)公司)。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。

第1组实施例、黑沙蒿在防治农业害虫方面的应用

本组实施例提供黑沙蒿在防治农业害虫方面的应用，所述农业害虫选自西花蓟马、枸杞木虱或棉蚜。

在一些实施例中，所述防治指杀灭；

在另一些实施例中，所述杀灭方式为触杀或熏杀。

在进一步的实施例中，采用黑沙蒿精油杀虫。

优选地，所述黑沙蒿精油为提取自植株地上部分的精油；

优选地，所述黑沙蒿精油的活性成分包括：联苯、红没药醇、(-)-斯巴醇、α-姜黄烯、橙花叔醇、β-蒎烯、库贝醇、α-蒎烯。

第2组实施例、本发明的防治农业害虫的药剂

本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述防治农业害虫的药剂的活性成分包括：黑沙蒿精油；所述农业害虫选自西花蓟马、枸杞木虱或棉蚜。

在具体的实施例中，所述黑沙蒿精油为提取自植株地上部分的精油；

优选地，所述黑沙蒿精油的活性成分包括：联苯、红没药醇、(-)-斯巴醇、α-姜黄烯、橙花叔醇、β-蒎烯、库贝醇、α-蒎烯。

在具体的实施例中，所述防治农业害虫的药剂的剂型选自：喷雾剂、粉剂、片剂、胶囊剂、液体制剂；

优选地，所述防治农业害虫的药剂还包括药学上可接受的辅料。

在具体的实施例中，所述防治农业害虫的药剂包括但不限于：杀虫剂。

更具体地，所述防治农业害虫的药剂可制成本领域的常规剂型，包括但不限于：粉剂、可湿性粉剂、滴剂、胶悬剂、乳油、喷射剂、气雾剂、毒饵、蚊香、粘捕剂、烟剂、杀虫涂料等等。

第3组实施例、本发明的生物防治药剂的制备方法

本组实施例提供一种防治农业害虫的药剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：以黑沙蒿精油做为防治农业害虫的药剂的活性成分。

在具体的实施例中，将黑沙蒿植株地上部分采用水蒸气蒸馏法提取后再萃取；

优选地，所述水蒸气蒸馏法的提取温度为70-120℃优选90℃；提取时间为4-12h优选6h；

优选地，所述萃取剂为正己烷，萃取时间为2-6h，优选3h；

优选地，萃取后的正己烷层干燥、浓缩；优选地，所述干燥指用无水硫酸钠去除正己烷层的水分；所述浓缩指干燥后的产物用旋蒸仪旋转蒸发去除正己烷后得到黑沙蒿精油；

优选地，水蒸气蒸馏法提取前将黑沙蒿植株的地上部分自然阴干、剪碎；

优选地，所述水蒸气蒸馏法提取指：将阴干剪碎后的黑沙蒿植株的地上部分置于圆底烧瓶中采用精油提取器进行提取；

优选地，所述一种防治农业害虫的药剂的制备方法还包括：添加药学上可接受的辅料；

在进一步的实施例中，所述防治农业害虫的药剂还包括本领域常见的杀虫剂领域可接受的辅料，包括但不限于：乳化剂、有机溶剂、填料、湿润剂、稀释剂等。

在一些实施例中，所述一种防治农业害虫的药剂的制备方法还包括：制备所述药剂的液体剂或微胶囊剂；

所述液体剂的制备包括：将黑沙蒿精油溶于溶剂中；所述溶剂优选乙醇；

所述微胶囊剂的制备包括：采用包结络合法将含有黑沙蒿精油的芯材溶液逐滴加入壁材溶液中搅拌后静置，然后过滤，去除未反应的精油后进行烘干。

在具体的实施例中，芯材溶液与壁材溶液重量比为1∶4-1∶8；

优选地，所述芯材溶液为黑沙蒿精油溶解于乙醇溶液中，搅拌至完全溶解所得；

优选地，所述壁材溶液为β～环糊精溶解在去离子水中，搅拌至完全溶解所得；

优选地，所述溶解温度为30-60℃，优选50℃；

优选地，所述环糊精质量浓度为2.83％w/v；

优选地，所述搅拌为200-1000r/min，优选500r/min；

优选地，所述搅拌时间为1-2h；

优选地，所述静置为4℃冰箱中静置24h；

优选地，所述去除未反应的精油采用乙醇进行冲洗去除未反应的精油；

优选地，所述烘干的温度为30-60℃，优选40℃；

优选地，所述烘干的时间3-6h，优选4h。

第4组实施例、本发明的防治农业害虫的方法

本组实施例提供一种防治农业害虫的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种防治农业害虫的方法采用黑沙蒿防治农业害虫；所述农业害虫选自西花蓟马、枸杞木虱或棉蚜。

优选地，采用黑沙蒿精油溶液防治农业害虫；所述防治农业害虫指杀虫；

在具体的实施例中，所述杀虫方式选自：触杀或熏杀；

在一些实施例中，所述黑沙蒿精油溶液杀灭棉蚜的半致死浓度为5.87mg/mL；

在一些实施例中，所述黑沙蒿精油溶液杀灭西花蓟马的半致死浓度为1.57mg/mL；

在一些实施例中，所述黑沙蒿精油溶液杀灭枸杞木虱的半致死浓度为0.81mg/mL。

实验例1、本发明黑沙蒿精油的制备及杀虫效果验证

1.1黑沙蒿精油的制备

10kg黑沙蒿植株地上部分自然阴干，通过水蒸汽蒸馏法获得精油，提取时间为6h，采用正己烷萃取，浓缩后，装入干燥玻璃瓶中，置于4℃冰箱内保存，计算得油率v/w及其密度。

1.2黑沙蒿精油GC-MS分析

GC条件：GCMS-QP2010 plus(Shimadzu)，色谱柱DB-5MS(60m×0.25um×0.32mm)(Agilent)，源温度200℃，接口温度300℃，进样口温度320℃，升温速率60℃至10℃/min，先在300℃下进行20min，后分流进样，比例为30：1，恒线速度模式30cm/s。

MS条件：载气He离子，质量扫描范围29～650m/z，进样量1μL，样品经一次性注射器含0.22μm的有机滤膜的滤头进行过滤，谱库检索Nist 2017标准谱库。

黑沙蒿经6h水蒸气蒸馏提取出黑沙蒿精油，计算得出油率为0.453％，经过重量体积比计算，油密度为0.86g/mL。通过GC-MS对黑沙蒿精油组分分析，质谱图经Nist 2017质谱数据库检索，与标准图谱核对，黑沙蒿精油中检测到28个组分(表1)，占精油总量99.35％。主要成分为联苯(15.62％)，其他主要成分有红没药醇(10.11％)、(-)-斯巴醇(7.10％)和α-姜黄烯(6.06％)。

表1.黑沙蒿精油组分

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上表1中鉴定出来的全部成分的总百分比未到100％，是因为黑沙蒿精油中仍存在未知成分，它们可能是新的化合物，无法利用现有的GC-MS检测方法鉴定出来。

1.3黑沙蒿精油对棉蚜、枸杞木虱、西花蓟马3种害虫杀虫活性测定

棉蚜触杀活性测定：采用叶碟法，以乙醇做为溶剂，将上述1.1步骤制备的黑沙蒿精油溶于溶剂，配制五个浓度(2.14、4.27、8.55、17.10、34.20mg/mL)，将棉花叶片打取直径12mm的叶碟，分别在各浓度药液中浸叶10s后，自然晾干，放入铺有琼脂层的十二孔培养板中，叶片正面与培养板底部完全贴合并与培养板周壁相接。每孔中接入10头棉蚜成虫，培养板用宣纸条封顶。含有等量无水乙醇及DMSO的水溶液作为空白对照，以除虫菊提取物为对照，每个处理设6次重复，将培养板置于培养箱中，培养箱条件：温度(26±0.5)℃，相对湿度50％，光照L：D为16：8。24h后观察并纪录试虫死亡数。用DPS软件，计算LC

枸杞木虱触杀活性测定：采用微量点滴法，配制五个浓度(0.24、0.60、1.52、3.80、9.50mg/mL)，试虫冷冻5～10min麻醉，10头枸杞木虱/管，点滴于虫体前胸背板，每头点滴2μL，设对照处理，6次重复试验，将处理后的枸杞木虱成虫放在垫枸杞鲜嫩枝芽的离心管中，用纱网封口，并设不含药剂的处理作对照。处理后将离心管放入植物培养箱中，培养箱条件和数据处理方法如上。

西花蓟马熏蒸活性测定：采用熏蒸法，将丙酮配制成5个浓度(8.90，17.80，35.60，71.20，142.40mg/mL)，分别取20mL小瓶吸入10头西花蓟马成虫，用网纱套住放入250mL广口瓶中，瓶盖内固定1cm×6cm滤纸条，将滴有20μL药液的滤纸条晾10～20s，待溶剂挥发后盖上瓶盖，使滤纸条悬于广口瓶中央，用封口膜包住广口瓶盖。设丙酮溶液为空白对照，苦楝油为对照，每个浓度设6次重复。处理后将广口瓶放入培养箱中，设温度(26±0.5)℃，相对湿度50％，光照L//D＝16h//8h的光照气候箱。24h后调查并记录各处理死亡虫数，数据处理方法如上。

室内生物活性测定表明，黑沙蒿精油对棉蚜的LC

表2.黑沙蒿精油对棉蚜、枸杞木虱和西花蓟马杀虫活性测定

1.4黑沙蒿精油微胶囊的制备

包结络合法制备：称取8gβ～环糊精在50℃(2.83％w/v)被溶解在去离子水中，500r/min搅拌至完全溶解，得到壁材溶液。称取1.0g黑沙蒿精油溶解于25％乙醇溶液中，搅拌至完全溶解，得到芯材溶液。将芯材溶液逐滴加入壁材溶液中，芯壁比为1：4-1：8，在40-60℃下持续搅拌1-2h，随后于4℃冰箱中保存。24h后过滤，并用乙醇冲洗去除未反应的精油。放到40℃烘箱中4h，得到的白色固体粉末即为黑沙蒿精油微胶囊，制备出的复合物置装有沸石的圆底烧瓶中，加适量的蒸馏水，连接精油测定器，煮沸至测定器中油量不再增加，停止加热，放置片刻。开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0线平齐，读取油量。

黑沙蒿精油通过包结络合法，芯壁比1:6、制备温度60℃、搅拌时间120min，制备成微胶囊剂，其最大包埋率为46％，装载率为7.06％。

1.5黑沙蒿精油微胶囊制剂田间防治效果评价

试验设计：

试验药剂2种，设置1种对照药剂(除虫菊素水乳剂)，试验药剂分别设置三个浓度处理(3，6，12kg·hm

调查时间、次数和方法：

施药前调查枝条上虫口基数，药后第1、3、7、14、21d调查残虫数，共调查6次。具体调查方法是：依据地方标准《DB64/T852-2013》的调查方法，在每个小区的不同方向中，各抽取5个枝条，调查并记录每枝条顶梢30cm范围内枸杞害虫的虫口数量。

并按照以下公式进行计算：

运用DPS统计软件对田间防治效果进行方差分析和显著性分析。

田间药效试验表明，施药1d、3d和7d后，黑沙蒿精油微胶囊剂对枸杞棉蚜的防治效果显著低于同剂量对照药剂除虫菊；药后14d，黑沙蒿精油微胶囊剂在同剂量下防治效果显著高于对照药剂，对照药剂除虫菊杀虫效果显著降低；药后21d，黑沙蒿精油微胶囊剂在6kg·hm

黑沙蒿精油微胶囊制剂在6kg·hm

施药1d、3d和7d后，黑沙蒿精油微胶囊剂对蓟马的防治效果显著低于同剂量对照药剂除虫菊；施药14d和21d后，黑沙蒿精油微胶囊剂在同剂量下对西花蓟马的防治效果显著高于对照药剂除虫菊，对照药剂除虫菊已无杀虫效果，随着使用剂量升高，防治效果也有所提高。

表3.黑沙蒿精油微胶囊剂对枸杞棉蚜、枸杞木虱和西花蓟马田间防治效果

注：表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同字母表示经单因素方差法检验在P＜0.05水平差异显著，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。

实验例2、本发明黑沙蒿精油对粘虫的杀灭实验

本实验例2采用叶碟法，黑沙蒿精油配制五个浓度(12.5、25、50、100、200mg/mL)，供试虫体采用粘虫成虫，其他操作均与实验例1的1.3节“棉蚜触杀活性测定”部分的内容相同。

表4.黑沙蒿精油对粘虫杀灭活性测定

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