基于细菌的蛋白质递送
文献发布时间：2023-06-19 19:28:50
本申请为2015年5月20日提交的、发明名称为“基于细菌的蛋白质递送”的PCT申请PCT/EP2015/061086的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2017年1月22日，申请号为201580040391.2。
技术领域
本发明涉及重组革兰氏阴性细菌菌株及其将异源蛋白递送到真核细胞中的用途。
背景技术
瞬时转染技术已经在细胞生物学研究中应用多年以解决蛋白质功能。这些方法通常导致被研究的蛋白质大量过度表达，这可能产生过简化的信号模型[1]。对于控制短寿命信号过程的蛋白质，目标蛋白质存在的时间远长于它控制的信号事件[2]。甚至，基于DNA转染的瞬时过表达导致异质和不同步的细胞群，这使功能研究和阻碍组学方法复杂化。除此之外，将这些测定扩大到更大规模是非常昂贵的。以上提到的这些点由现有技术覆盖，如显微注射或纯化蛋白的蛋白转染、诱导型转运策略快速靶向质粒出生的小GTP酶到细胞膜[2]或添加融合ω细胞可渗透细菌毒素的纯化蛋白[3]。但是这些技术都很耗时且麻烦，并且根据我们的知识，没有一个满足所有提到的标准。
细菌已经进化形成不同的机制来直接注射蛋白质到靶细胞[4]。由耶尔森氏菌属、志贺氏菌属和沙门氏菌等细菌使用的III型分泌系统(T3SS)的功能类似于将所谓的细菌效应蛋白注射到宿主细胞中的纳米注射器。通过T3SS分泌的细菌蛋白，称为效应物，含有短的N-末端分泌信号[6]。在细菌内，有些效应物被伴侣结合。伴侣可能掩盖毒性结构域[7]，它们有助于分泌信号的暴露[8，9]，并保持底物在分泌能力的构象[10]，因此促进分泌。在诱导分泌时，邻近T3SS的ATP酶去除伴侣蛋白[11]，并且效应物通过针头展开或仅部分折叠[10]，并在宿主细胞质中重折叠一次。
T3S已经被用来将杂交肽和蛋白质递送到靶细胞中。异源细菌T3SS效应器已经被传递，以防所研究的细菌难以通过遗传学获得(如沙眼衣原体[12])。通常将报告蛋白融合到可能的T3SS分泌信号以研究对T3SS依赖性蛋白递送的需求，例如百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶[13]、鼠DHFR[10]或可磷酸化标签[14]。肽递送主要以疫苗接种为目的进行。这包括病毒表位[15，16]、细菌表位(李斯特菌溶血素，[17])以及代表人类癌细胞表位的肽[18]。在少数情况下，如纳米抗体[19]、核蛋白(Cre重组酶，MyoD)[20，21]或I110和ILlra[22]所做的那样，功能性真核蛋白已被递送以调节宿主细胞。上述系统中没有一个允许单蛋白递送，因为在每种情况下一个或多个内源效应子蛋白仍然被编码。此外，使用的载体没有设计出能简单克隆编码所选蛋白质的其它DNA片段，阻碍了这种系统的广泛应用。
因此，发明一种能在生理浓度下目标蛋白质的可扩展的、快速的、同步同质和可调节的递送的廉价和简单的方法对于许多细胞生物学家是非常有益的。
发明内容
本发明一般涉及重组革兰氏阴性细菌菌株及其用于将异源蛋白质递送到真核细胞中的用途。本发明提供革兰氏阴性细菌菌株及其用途，其允许各种病毒蛋白的III型效应器，也允许IV型效应器，和最重要的功能性真核蛋白转运。本发明提供了用于荧光跟踪递送，用于重新定位至细胞核并且特别是用于在递送至宿主细胞之后去除细菌附属物的装置。这允许第一次仅使用T3SS将几乎天然蛋白质递送到真核细胞中。所呈现的基于T3SS的系统导致目标蛋白质可扩展、快速、同步同质和可调节的递送。本发明的递送系统适合于在活动物中注射真核蛋白质并且可以用于治疗目的。
在第一方面，本发明涉及选自耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属和假单胞菌属的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述革兰氏阴性细菌菌株用载体转化，所述载体在5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，可操作地连接到所述启动子上；
框内融合到所述第一DNA序列的3'末端的编码异源蛋白质的第二DNA序列，其中所述异源蛋白质选自参与凋亡或凋亡调节的蛋白质。
在另一方面，本发明涉及用载体转化的重组革兰氏阴性细菌菌株，其在5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，可操作地连接到所述启动子；
与框内融合到所述第一DNA序列的3'末端的编码异源蛋白质的第二DNA序列；和
编码蛋白酶切割位点的第三DNA序列，其中所述第三DNA序列位于所述第一DNA序列的3'端和所述第二DNA序列的5'端之间。
在另一方面，本发明涉及重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，并且其中所述耶尔森氏菌菌株是野生型或对于至少一种T3SS效应蛋白的产生是缺陷的，并用载体转化，所述载体在5'至3'方向：
启动子；
可操作地连接到所述启动子的编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，其中来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE效应蛋白的N末端138个氨基酸；以及
框内融合到所述第一DNA序列的3'末端的编码异源蛋白质的第二DNA序列。
在另一方面，本发明涉及重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，并且其中所述沙门氏菌菌株是野生型或对于至少一种T3SS效应蛋白的产生是缺陷的，并用载体转化，所述载体在5'至3'方向包含：
启动子；
可操作地连接到所述启动子的编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，其中来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含肠炎沙门氏菌SteA效应蛋白或肠炎沙门氏菌SopE效应蛋白的N-末端81或105氨基酸；以及
框内融合到所述第一DNA序列的3'末端的编码异源蛋白质的第二DNA序列。
在另一方面，本发明涉及一种载体，其在5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，可操作地连接到所述启动子；
框内融合到所述第一DNA序列的3'末端的编码异源蛋白质的第二DNA序列；
编码蛋白酶切割位点的第三DNA序列，其中所述第三DNA序列位于所述第一DNA序列的3'端和所述第二DNA序列的5'端之间。
本发明还涉及将异源蛋白质递送到真核细胞中的方法，包括以下步骤：
i)培养革兰氏阴性细菌菌株；以及
ii)将真核细胞与i)的革兰氏阴性细菌菌株接触，其中包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白质的融合蛋白由革兰氏阴性细菌菌株表达，并且被转运进入到真核细胞。
本发明还涉及将异源蛋白质递送到真核细胞中的方法，包括以下步骤：
i)培养革兰氏阴性细菌菌株；
ii)使真核细胞与i)的革兰氏阴性细菌菌株接触，其中包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白的融合蛋白由革兰氏阴性细菌菌株表达，并被转运进入真核细胞；和
iii)切割融合蛋白，使得异源蛋白与细菌T3SS效应蛋白的递送信号切割开来。
本发明还涉及纯化异源蛋白质的方法，包括培养革兰氏阴性细菌菌株，使得包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白质的融合蛋白质被表达并分泌到培养基的上清液中。
在另一方面，本发明涉及革兰氏阴性细菌菌株的文库，其中由革兰氏阴性细菌菌株的表达载体的第二DNA序列编码的异源蛋白质是人或鼠蛋白，并且其中由革兰氏阴性菌株表达的每个人或鼠的氨基酸序列不同。
附图说明
图1：T3SS蛋白递送的表征。(A)T3SS依赖性蛋白分泌到周围介质(体外分泌)(左侧)或真核细胞(右侧)。I：表示3型分泌系统。II表示分泌到周围介质中的蛋白质，III蛋白通过膜递送到真核细胞的细胞质中(VII)。VI表示T3SS被插入的两个细菌膜的拉伸和里面的细菌细胞溶质。IV是连接到YopE
图2：T3SS蛋白递送进入上皮细胞的表征。(A)对用MOI为100感染1小时的HeLa细胞用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd或II：小肠结肠炎耶尔森氏菌△HOPEMT asd+pBad_Si2的抗Myc免疫荧光染色。(B)定量来自(A)的HeLa细胞内的抗Myc免疫荧光染色强度。从n＝20个位点合并数据，指示的误差条是平均值的标准误差。I：未感染，II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd或III：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2。Y轴表示抗Myc染色强度[任意单位]，x轴表示感染时间(min)(C)细胞内抗Myc免疫荧光染色强度的定量。将HeLa细胞用在x轴上指示的MOI处的肠炎沙门氏菌ΔHOPEMTasd+pBad_Si2感染1小时。从n＝20个位点合并数据，指示的误差条是平均值的标准误差。Y轴表示抗Myc染色强度[a.u.]。
图3：基于T3SS的蛋白质递送的修饰允许YopE
图4：基于T3SS的蛋白质递送的修饰允许去除YopE
图5：将细菌效应蛋白递送到真核细胞中。(A)将HeLa细胞用携带II：pBad_Si2或III：YopE
图6：将细菌效应蛋白递送到真核细胞中。(A)对未处理的HeLa细胞或以MOI为100用携带III：pBad_Si2或IV：YopE1-138-OspF的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd感染75分钟的HeLa细胞进行Phospho-p38(“a”)、总p38(“b”)和肌动蛋白(“c”)免疫印迹分析。在所示(+表示加入TNFα，-表示未用TNFα处理)感染的最后30分钟用TNFα刺激细胞。(B)对未处理(II)的HeLa细胞或以MOI为100用携带III：pBad_Si2、IV：YopE
图7：将人tBid递送到真核细胞中诱导大量凋亡。(A)对未处理的HeLa细胞或以MOI为100用携带III：pBad_Si2、IV：YopE
图8：斑马鱼的T3SS依赖性递送BIM：诱导斑马鱼胚胎中的凋亡。(A)通过注射约400个细菌进入后脑区用表达小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si1对照菌株(1)或zBIM转位菌株(II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-zBIM)感染2个dpf斑马鱼胚胎。5.5小时后，将胚胎固定，对活化的Caspase 3(裂解的Caspase 3，p17；以“c”表示)染色并分析细菌的存在(EGFP信号，以“b”表示)。最大强度z投影以荧光图像显示。亮场z投影以“a”表示。(B)记录的(A)z-堆叠图像在最大强度z投影上的自动图像分析。简要地，通过GFP通道检测细菌，围绕细菌斑点的每个区域产生半径为10像素的圆，重叠区域在连接构件之间平均分开。在紧密围绕细菌的那些区域中，测量Caspase 3 p17染色强度并在y轴上绘图(如[a.u.])使用Mann-Whitney检验进行统计分析(***表示p<0.001)。对于小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si1对照菌株(I)，采取n＝14数据合并或对于II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE
图9：tBiD依赖性磷酸蛋白体：HeLa细胞用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-t-Bid以MOI为100感染3分钟，用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2作为对照。(A)tBID磷酸化蛋白的图示。含有以tBid依赖性方式(灰色)(q<0.01)显著调节的磷酸肽蛋白以及已知凋亡相关蛋白(深灰色)在已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用的STRING网络中列出(高可信度，得分0.7)。在STRING中至少有一个连接的蛋白质被列出。(B)用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2(I)或小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YOpE
图10：基于III型分泌物递送工具箱的描述。(A)用于产生具有YopE
图11：T3SS蛋白递送到各种细胞系中的表征。在Swiss 3T3成纤维细胞('γ)、Jurkat细胞(“b”)和未处理(II)或用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2(I)以上面图像中所示的MOI(HUVECs的MOI25、50、100和200)感染1小时的HUVEC细胞(“c”)的抗Myc免疫荧光染色。
图12：细菌效应蛋白递送到真核细胞中的T3SS依赖性。用免疫印迹抗Myc分析以MOI为100用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asdΔyobB+YopE
图13和14：T3SS依赖性分泌各种其他蛋白质到培养物上清液中。体外分泌实验1：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asdΔyobB+YopE
图15A至M：用于本研究的小肠结肠炎耶尔森氏菌和肠道沙门氏菌菌株。本研究中使用的小肠结肠炎耶尔森氏菌和肠道沙门氏菌菌株列表提供了编码在相应质粒上针对T3SS依赖性递送的背景菌株、质粒和蛋白质的信息。此外，提供了关于用于构建相应质粒、主链质粒和抗生素抗性的寡核苷酸的信息。
图16：将鼠tBid、鼠Bid BH3和鼠Bax BH3递送到B16F10细胞中诱导大量凋亡。B16F10细胞未感染(I)或用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和II：+pBadSi_2、III：+YopE
图17：将鼠tBid、鼠Bid BH3和鼠Bax BH3递送到D2A1细胞中诱导大量凋亡。D2A1细胞未感染(I)或用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和II：+pBadSi_2、III：+YopE
图18：将鼠tBid、鼠BH3和鼠Bax BH3递送到HeLa细胞中诱导大量凋亡。HeLa细胞未感染(I)或用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和II：+pBadSi_2、III：+YopE
图19：将鼠tBid、鼠Bid BH3和鼠Bax BH3递送到4T1细胞中诱导大量凋亡。4T1细胞未感染(1)或用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和II：+pBadSi_2、III：+YopE
图20：在SPI-1T3SS诱导条件下生长的肠杆菌向真核细胞递送鼠tBid诱导凋亡。对未处理(I)和或用III：携带IV：SteA
图21：在SPI-2T3SS诱导条件下生长的肠杆菌向真核细胞递送鼠tBid诱导凋亡。对未处理(I)和或用III：携带IV：SteA
图22：肠炎沙门氏菌T3SS依赖性分泌各种细胞周期蛋白到培养上清液中。肠炎沙门氏菌aroA+与如下所列的蛋白质融合的SteA
图23：各种已知细胞周期干扰肽T3SS依赖性分泌到培养上清液中。小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2的体外分泌实验。II-VII：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE
图24：T3SS递送的蛋白质与泛素的融合允许去除YOpE
具体实施方式
本发明提供了重组革兰氏阴性细菌菌株及其用于将异源蛋白质递送到真核细胞中的用途。
出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例目的，而不是限制性的。
本文所用的术语“革兰氏阴性细菌菌株”包括以下细菌：杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、厌氧粘细菌、支气管炎博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌、副百日咳杆菌、百日咳杆菌、大豆慢生根瘤菌、伯克霍尔德新洋葱伯克霍尔德杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、鼻疽杆菌、沙眼衣原体肺炎、沙眼衣原体、流产衣原体、衣原体肺炎、紫色杆菌、枸橼酸杆菌啮齿类、普通脱硫弧菌、爱德华氏菌、Endozoicomonas elysicola、梨火疫病菌、阿尔伯蒂埃希氏杆菌、大肠杆菌、细胞内劳森菌、根瘤菌、黄色粘球菌、成团泛菌、美人鱼发光杆菌、发光杆菌、Photorabdus temperate、海绵假交替单胞菌、绿脓杆菌、变形假单胞菌、丁香假单胞菌、青枯雷尔氏菌、根瘤菌、沙门氏杆菌和其他沙门菌，志贺氏菌和其他志贺氏菌、Sodalis glossinidius、溶藻弧菌、Vibrio azureus、坎氏弧菌，Vibriocaribbenthicus、哈维氏弧菌、副溶血性弧菌、Vibrio tasmaniensis、Vibrio tubiashii、地毯草黄单胞菌、野油菜黄单胞菌、白叶枯病菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、耶尔森氏菌、假结核菌。本发明优选的革兰氏阴性细菌菌是肠杆菌科和假单胞菌科包含的革兰氏阴性细菌菌株。本发明的革兰氏阴性细菌菌株通常被用于由细菌T3SS递送异源蛋白质到体外和体内的真核细胞。
本文使用的术语“重组革兰氏阴性细菌菌株”是指用载体遗传转化的革兰氏阴性细菌菌株。本发明的有用载体是例如表达载体，用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段。
术语“对产生生长必需氨基酸缺陷的革兰氏阴性细菌菌株”和“营养缺陷型突变体”在本文中可互换使用，指在不存在至少一种外源提供的必需氨基酸或其前体的情况下不能生长的革兰氏阴性细菌菌株。所述菌株缺陷产生的氨基酸是例如天冬氨酸，内消旋-2,6-二氨基庚二酸，芳香族氨基酸或亮氨酸-精氨酸[23]。这种应变可以通过例如缺失天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(Δasd)。这样的营养缺陷突变体不能在不存在外源性内消旋-2,6-二氨基庚二酸的情况下生长[24]。突变，例如缺失天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因，优选用于本发明的对产生生长必需的氨基酸缺陷的革兰氏阴性细菌菌株。
术语“对产生结合真核细胞表面或细胞外基质的粘附蛋白缺陷的革兰氏阴性细菌菌株”是指与由相应野生型表达的粘附蛋白相比不表达至少一种粘附蛋白的突变革兰氏阴性菌株型。粘附蛋白可以包括例如扩展的聚合物粘附分子如菌毛或非菌毛粘附素。菌毛粘附素包括1型菌毛(例如具有FimH粘附素的大肠杆菌菌毛)、P型菌毛(例如具有来自大肠杆菌的PapG粘附素的Pap-菌毛)、4型菌毛(例如来自铜绿假单胞菌的菌毛)或curli(Csg蛋白与来自肠炎沙门氏菌的CsgA粘附素)。非菌毛粘附包括三聚体自转运粘附素，例如来自小肠结肠炎耶尔森氏菌YadA、BpaA(假单胞菌)、Hia(流感嗜血杆菌)、BadA(B.nselae)、NadA(脑膜炎奈瑟氏球菌)或UspA1以及其它自转运粘附素如AIDA-1(大肠杆菌)以及其他粘附素/侵袭素如来自小肠结肠炎耶尔森氏菌或Intimin(大肠杆菌)的InvA或Dr-家族或Afa-家族的成员(大肠杆菌)。本文所用的术语YadA和InvA是指来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的蛋白质。自体转运蛋白YadA[25，26]结合不同的胶原蛋白以及纤连蛋白，而侵袭素InvA[27-29]结合到真核细胞膜中的β-整合素。如果革兰氏阴性细菌菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株，那么该菌株优选是InvA和/或YadA缺陷的。
如本文所用，术语“肠杆菌科家族”包括在土壤、水、植物和动物中发现的革兰氏阴性、杆状、兼性厌氧细菌家族，其经常如脊椎动物中的病原体发生。该家族的细菌共享相似的生理学并且证明在相应基因组的功能元件和基因内的保守性。除氧化酶阴性外，该家族的所有成员都是葡萄糖发酵，大多数是硝酸盐还原剂。
本发明的肠杆菌科细菌可以是来自该家族的任何细菌，具体包括但不限于以下属的细菌：埃希氏菌属、志贺氏菌属、爱德华氏菌属、沙门氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属、摩根(氏)菌属、普罗威登斯菌属或耶尔森氏鼠疫杆菌属。在更具体的实施方案中，细菌是大肠杆菌、大肠杆菌、弗氏杆菌、埃氏肠杆菌、埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、痢疾杆菌、志贺氏菌、志贺氏菌、志贺氏菌、志贺氏菌、产气肠杆菌、肠杆菌、肠杆菌镰刀菌、变形杆菌、普通变形杆菌、变形杆菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌或摩氏摩根氏菌。优选地，革兰氏阴性细菌菌株选自耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、假单胞菌属、衣原体属、欧文氏菌属、泛菌属、弧菌属、伯克霍尔德氏菌属、兰氏菌属、黄单胞菌属、色杆菌属、Sodalis、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、根瘤菌属、气单胞菌属、光杆菌属、博德特氏菌属和脱硫弧菌属、更优选来自耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属和假单胞菌属、最优选来自耶尔森氏菌属和沙门氏菌属。
本文所用的术语“耶尔森氏菌”包括耶尔森氏菌的所有物种，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌。优选的是小肠结肠炎耶尔森氏菌。
本文使用的术语“沙门氏菌”包括沙门氏菌的所有物种，包括肠道沙门氏菌和沙门氏菌。优选为肠道沙门氏菌。
本文所用的“启动子”是指调节转录单位表达的核酸序列。“启动子区”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列的转录的调节区。在启动子区域内将发现转录起始位点(通过用核酸酶S1作图方便定义)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)，例如推定的-35区域和Pribnow框。当描述两个DNA区之间的关系时，术语“可操作地连接”仅仅意味着它们彼此功能相关，并且它们位于相同的核酸片段上。如果启动子控制基因的转录并且其位于与基因相同的核酸片段上，则启动子可操作地连接到结构基因。通常启动子在所述革兰氏阴性细菌菌株中是有功能的，即启动子能够表达本发明的融合蛋白，即启动子能够表达本发明的融合蛋白，而不进一步基因工程或进一步表达蛋白质。此外，功能性启动子不能对细菌T3SS天然地反调节。
本文使用的术语“递送”是指将蛋白质从重组革兰氏阴性菌株运输到真核细胞，包括在重组革兰氏阴性菌株中表达异源蛋白质的步骤，从这种革兰氏阴性细菌菌株分泌表达的蛋白质，并通过这种革兰氏阴性细菌菌株将分泌的蛋白质转移到真核细胞的胞质溶胶中。因此，本文可互换使用的术语“递送信号”或“分泌信号”是指可以被革兰氏阴性细菌菌株分泌和转运系统识别并指导从革兰氏阴性细菌菌株递送蛋白质到的真核细胞的多肽序列。
如本文所用，蛋白质的“分泌”是指异源蛋白质跨越重组革兰氏阴性细菌菌株的细胞膜的运输。蛋白质的“转位”是指异源蛋白质从重组革兰氏阴性细菌菌株穿过真核细胞的质膜递送到这种真核细胞的胞质溶胶中。
本文所用的术语“真核细胞”包括以下真核细胞：Hi-5、HeLa、Hek、HUVEC、3T3、CHO、Jurkat、Sf-9、HepG2、Vera、MDCK、Mefs、THP-1、J774、RAW、Caco2、NCI60、DU145、Lncap、MCF-7、MDA-MB-438、PC3、T47D、A549、U87、SHSY5Y、Ea.Hy926、Saos-2、4T1、D2A1、B16F10和原代人肝细胞。本文使用的“真核细胞”也称为“靶细胞”或“靶真核细胞”。
本文所用的术语“T3SS效应蛋白”是指通过T3S系统天然注射到真核细胞的细胞溶质中的蛋白质和由T3S系统天然分泌的蛋白质，其可能例如形成孔进入真核细胞膜(包括成孔递送器(如耶尔森氏菌YopB和YopD)和尖端蛋白(如Yersinia LcrV)。优选使用通过T3S系统天然注射到真核细胞的细胞质中的蛋白质。这些剧毒因子将使真核细胞麻痹或重编程以获得病原体的益处。T3S效应物具有大量的生物化学活性和调节关键宿主调节分子的功能[5，30]，包括AvrA、AvrB、AvrBs2、AvrBS3、AvrBsT、AvrD、AvrD1、AvrPphB、AvrPphC、AvrPphEPto、AvrPpiBPto、AvrPto、AvrPtoB、AvrRpmL、AvrRpt2、AvrXv3、CigR、EspF、EspG、EspH、EspZ、ExoS、ExoT、GogB、GtgA、GtgE、GALA家族蛋白、HopAB2、HopAO1、Hopl1、HopM1、HopN1、HopPtoD2、HopPtoE、HopPtoF、IpB、IpgB、IpgB2、IpgD、LcrV、Map、OspC1、OspE2、OspF、OspG、Osp1、PipB、PipB2、PopB、PopP2、PthXol、PthXo6、PthXo7、SifA、SifB、SipA/SspA、SipB、SipC/SspC、SipD/SspD、SlrP、SopA、SopB/SigD、SopD、SopE、SopE2、SpiC/SsaB、SptP、SpvB、SpvC、SrfJ、Sse、SseB、SseC、SseD、SseF、SseG、Ssel/SrfH、SseJ、SseK1、SseK2、SseK3、SseL、SspH1、SspH2、SteA、SteB、SteC、SteD、SteE、TccP2、Tir、VirA、VirPphA、VopF、XopD、YopB、YopD、YopE、YopH、YopJ、YopM、YopO、YopP、YopT、YpkA。
耶尔森氏菌的T3SS效应基因已经从YopE、YopH、YopM、YopO、YopP/YopJ和YopT[31]。各自的效应基因可以从弗氏志贺氏菌(例如OspF、IpgD、IpgB1)、肠沙门氏菌(例如SopE、SopB、SptP)、铜绿假单胞菌(例如ExoS、ExoT、ExoU、ExoY)或大肠杆菌(Map、EspF、EspG、EspH、EspZ)克隆。这些基因的核酸序列对于本领域技术人员是可获得的，例如在Genebank数据库(来自NC 002120GL 10955536的yopH、yopO、yopE、yopP、yopM、yopT、；来自AF386526.1GI18462515的福氏志贺菌杆菌效应蛋白；来自NCO16810.1 GI378697983或FQ312003.1GI301156631的肠道沙门菌；来自AE004091.2GI：110227054或CP000438.1GI：115583796的绿脓杆菌效应子和来自NC O 11601.1GL215485161的大肠杆菌效应子蛋白)。
为了本发明的目的，基因用小写字母表示，斜体表示以区别于蛋白质。在基因(由小写字母和斜体字母表示)遵循细菌物种名称(如大肠杆菌)的情况下，它们是指相应细菌物种中相应基因的突变。例如，YopE是指由yopE基因编码的效应子蛋白。小肠结肠炎耶尔森氏菌yopE代表在yopE基因中具有突变的肠道小肠结肠炎耶尔森氏菌。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”、“蛋白质”、“多肽的”和“肽的”可互换使用，表示通过α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基相邻残基的组。优选具有包含至少10个氨基酸，更优选至少20个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。根据本发明，“异源蛋白质”包括天然存在的蛋白质或其部分，并且还包括人工改造的蛋白质或其部分。如本文所用，术语“异源蛋白质”是指除了其可融合的T3SS效应蛋白或其N末端片段之外的蛋白质或其部分。特别地，本文使用的异源蛋白质是指不属于蛋白质组的蛋白质或其部分，即本发明提供和使用的特定重组革兰氏阴性细菌菌株的完整天然蛋白质互补物，例如，其不属于蛋白质组，即耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属的特定细菌菌株的完整天然蛋白质补体。通常异源蛋白质是动物来源的，包括人来源的。优选地，异源蛋白质是人蛋白质。更优选异源蛋白质选自参与凋亡或凋亡调节的蛋白质、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报告蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。特别优选异源蛋白质选自参与凋亡或凋亡调节的蛋白质、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、报告蛋白、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。甚至更特别优选的是选自参与凋亡或凋亡调节的蛋白质、细胞周期调节剂和锚蛋白重复蛋白的异源蛋白质。最优选的是参与凋亡或凋亡调节的蛋白质，如动物，优选参与凋亡或凋亡调节的人异源蛋白质。
在一些实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌菌株的载体包含相互独立地框内融合到所述第一DNA序列的3'端的编码相同或两种不同异源蛋白质的两个第二DNA序列。在一些实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌菌株的载体包含相互独立地框内融合到所述第一DNA序列的3'端的编码相同或三种不同异源蛋白质的三个第二DNA序列。
由重组革兰氏阴性细菌菌株表达的异源蛋白质通常具有1-150kD，优选1-120kD，更优选在100kDa，最优选15-100kDa之间的分子量。由重组革兰氏阴性细菌菌株表达的异源蛋白质通常具有1-150kD，优选1-120kD，更优选在100kDa，最优选15-100kDa之间的分子量。
根据本发明，“参与凋亡或凋亡调节的蛋白质”包括但不限于Bad、Bcl2、Bak、Bmt、Bax、Puma、Noxa、Bim、Bcl-xL、Apaf1、Caspase 9、Caspase 3、Caspase 6、Caspase 7、Caspase 10、DFFA、DFFB、ROCK1、APP、CAD、ICAD、CAD、EndoG、AIF、HtrA2、Smac/Diablo、Arts、ATM、ATR、Bok/Mtd、Bmf、Mcl-)、IAP家族、LC8、PP2B、14-3-3蛋白、PKA、PKC、PI3K、Erk1/2、p90RSK、TRAF2、TRADD、FADD、Daxx、Caspase8、Caspase2、RIP、RAIDD、MKK7、JNK、(p16(Ink4a)、p15(Ink4b)、p18(Ink4c)、p19(Ink4d))和Cip1/Waf1/Kipl-2-家族(p21(Cip1c))的FKHR、GSK3、CDKs和它们的抑制剂/Waf1)、p27(Kipl)、p57(Kip2)。优选Bad、Bmt、Bcl2、Bak、Bax、Puma、Noxa、Bim、Bcl-xL、Caspase9、Caspase3、Caspase6、Caspase7、Smac/Diablo、Bok/Mtd、Bmf、Mcl-TRADD、Daxx、Caspase8、Caspase2、RIP、RAIDD、FKHR、CDK及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)、p15(Ink4b)、p18(Ink4c)、p19(Ink4d))，最优选BIM、截短的Bid、FADD、胱天蛋白酶3(及其亚基)、Bax、Bad、Akt、CDK及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)、p15(Ink4b)、p18(Ink4c)、p19[32-34]。此外，参与细胞凋亡或凋亡调节的蛋白质包括DIVA、Bcl-Xs、Nbk/Bik、Hrk/Dp5、Bid和tBid、Eg1-1、Bcl-Gs、细胞色素C、Beclin、CED-13、BNIP1、BNIP3、Bcl-B、Bcl-W、Ced-9、A1、NR13、Bfl-1、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶8.参与凋亡或凋亡调节的蛋白质选自促凋亡蛋白质、抗凋亡蛋白、凋亡预防途径的抑制剂和促存活信号或途径的抑制剂。促凋亡蛋白包含选自Bax、Bak、Diva、Bcl-Xs、Nbk/Bik、Hrk/Dp5、Bmf、Noxa、Puma、Bim、Bad、Bid和tBid、Bok、Apaf1、Smac/Diablo、BNIP1、BNIP3、Bcl-Gs、Beclin1、Egl-1和CED-13、细胞色素C、FADD、Caspase家族和CDKs及其抑制剂如INK4家族(p16(Ink4a)、p15(Ink4b)、pkl、Bmf、Noxa、Puma、Bim、Bad、Bid和tBid组成的组中选择的一个或多个氨基酸序列(例如、p18(Ink4c)、p19(Ink4d)Bok、Egl-1、Apaf1、Smac/Diablo、BNIP1、BNIP3、Bcl-Gs、Beclin1、Egl-1和CED-13、细胞色素C、FADD和Caspase家族。优选的是Bax、Bak、Diva、Bcl-Xs、Nbk/Bik、Hrk/Dp5、Bmf、Noxa、Puma、Bim、Bad、Bid和tBid、Bok、Egl-1、Apaf1、BNIP1、BNIP3、Bcl-Beclin 1、Egl-1和CED-13、Smac/Diablo、FADD、Caspase家族、CDK及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)、p15(Ink4b)、p18(Ink4c)、p19(Ink4d))。同样优选的是Bax、Bak、Diva、Bcl-Xs、Nbk/Bik、Hrk/Dp5、Bmf、Noxa、Puma、Bim、Bad、Bid和tBid、Bok、Apaf1、BNIP1、BNIP3、Bcl-Gs、Beclin1、Egl-1和CED-13、Smac/Diablo、FADD、Caspase家族。
抗凋亡蛋白包含选自Bcl-2、Bcl-Xl、Bcl-B、Bcl-W、Mcl-1、Ced-9、A1、NR13、IAP家族和Bfi-1的蛋白质。优选的是Bcl-2、Bcl-XI、Bcl-B、Bcl-W、Mcl-1、Ced-9、A1、NR13和Bfl-1。
细胞凋亡预防途径的抑制剂包含选自Bad、Noxa和Cdc25A的蛋白质。优选Bad和Noxa。
促生存信号传导或通路的抑制剂包含选自PTEN、ROCK、PP2A、PHLPP、JNK，p38的蛋白质。优选PTEN、ROCK、PP2A和PHLPP。
在有些实施方案中，参与凋亡或凋亡调节的异源蛋白选自唯BH3蛋白、胱天蛋白酶和凋亡的死亡受体控制的细胞内信号传导蛋白。
唯BH3蛋白包含选自Bad、BIM、Bid和tBid、Puma、Bik/Nbk、Bod、Hrk/Dp5、BNIP1、BNIP3、Bmf、Noxa、Mcl-1、Bcl-Gs、Beclin1、Egl-1和CED-13的蛋白。优选Bad、BIM、Bid和tBid。
半胱天冬酶包含选自半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10的蛋白质。优选半胱天冬酶3、半胱天冬酶8和半胱天冬酶9的蛋白。
细胞死亡受体控制的细胞内信号蛋白包括选自FADD、TRADD、ASC、BAP31、GULP1/CED-6、CIDEA、MFG-E8、CIDEC、RIPK1/RIP1、CRADD、RIPK3/RIP3、Crk、SHB、CrkL、DAXX、14-3-3家族、FLIP、DFF40和45、PEA-15、SODD。优选的是FADD和TRADD。
在有些实施方案中，参与凋亡或凋亡调节的两种异源蛋白包含在本发明的革兰氏阴性细菌菌株的载体中，其中一种蛋白是促凋亡蛋白，而另一种蛋白是凋亡预防途径的抑制剂或其中一种蛋白是促凋亡蛋白，而另一种蛋白是促生存信号传导或通路的抑制剂。
本发明包括的促凋亡蛋白质通常具有α螺旋结构，优选由两亲性螺旋环绕的疏水螺旋，通常包含BH1、BH2、BH3或BH4结构域中的至少一个，优选包含至少一个BH3结构域。通常由本发明包括的促凋亡蛋白质不具有酶活性。
本文所用的术语“蛋白酶切割位点”是例如指蛋白质或融合蛋白氨基酸内的特定氨基酸基序。在蛋白质或融合蛋白的氨基酸序列内，其被识别氨基酸基序的特异性蛋白酶切割。综述见[35]。蛋白酶切割位点的实例是被选自肠激酶(轻链)、肠肽酶、解离蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶(HRV 3C)、TEV蛋白酶、TVMV蛋白酶、FactorXa蛋白酶和凝血酶一组的蛋白酶切割的氨基酸基序。
以下氨基酸基序被相应的蛋白酶识别：
-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys：肠激酶(轻链)/肠肽酶
-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro：PreScission蛋白酶/人鼻病毒蛋白酶(HRV3C)
-Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser和基于Glu-XX的修饰基序Tyr-X-Gln-Gly/Ser(其中X是任意氨基酸)被TEV蛋白酶(烟草蚀纹病毒)
-Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser：TVMV蛋白酶
-Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg：FactorXa蛋白酶
-Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser：凝血酶。
本文所用的蛋白酶切割位点包括泛素。因此，在一些优选的实施方案中，泛素用作蛋白酶切割位点，即第三DNA序列编码泛蛋白如蛋白酶切割位点，其可以在N-末端位点被特异性泛素加工蛋白酶切割。其可以被特异性遍在蛋白加工蛋白酶切割，所述蛋白酶在融合蛋白已被递送至的细胞中在N末端位点内源性地称为去泛素化酶。泛素在其C末端由一组内源性泛素特异性C末端蛋白酶(去泛素化酶，DUB)加工。通过DUB的遍在蛋白的切割被认为发生在泛素的非常C末端(在G76之后)。“个体”，“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类动物)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
术语“突变”在本文中用作一般术语，并且包括单个碱基对和多个碱基对的改变。这样的突变可以包括取代、移码突变、缺失、插入和截短。
本文所用的术语“标记分子或标记分子的受体位点”是指结合特定氨基酸序列的小化合物，这样导致结合的化合物产生荧光，结合的化合物优选香豆素连接酶/香豆素受体位点(及其衍生物)、试卤灵连接酶/试卤灵受体位点(及其衍生物)和四半胱氨酸基模序(如Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys及其衍生物)与FlAsH/ReAsH染料蛋白(life technologies)或如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的荧光蛋白使用。
本文所用的术语“核定位信号”是指标记导入真核细胞核中的蛋白质的氨基酸序列，并且优选包括病毒核定位信号，例如SV40大T抗原衍生的NLS(PPKK RKV)。
本文所用的术语“多克隆位点”是指含有几个限制性位点的短DNA序列，用于通过限制性内切核酸酶如Ac11、HindIII、Sspl、MLuCI、Tsp509I、Pcil、Agel、BspMI、BfuAI、SexAI、MLuI、BceAI、HpyCH4IV、HpyCH4III、Bael、BsaXI、Aflff1、SpeI、Bsr1、Bmr1、BglII、AfeI、Alul、StuI、Seal、Clal、BspDI、PI-SceI、NsiI、Asel、Swal、CspCI、MfeI、BssSI、BmgBI、PmLl、Drall1、Alel、EcoP15I、PvuII、AlwNI、BtsIMutI、TspRI、NdeI、NlallI、CviAII、Fatl、MslI、FspEI、XcmL、BstXI、PflMI、Bed、Ncol、BseYI、Faul、Smal、Xmal、TspMI、Nt.CviPII、LpnPI、Acil、SacII、BsrBI、Msp1、Hpall、ScrFI、BssKI、StyD4I、BsaJI、BslI、BtgI、Neil、AvrII、MnII、BbvCI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、SbfI、BpuI1、Bsu36I、EcoNI、HpyAV、BstNI、PspGI、Styl、Bcgl、PvuI、BstUI、EagI、RsrII、BsiEI、BsiWI、BsmBI、Hpy99I、MspAll、MspJI、SgrAI、Bfal、BspCN1、XhoI、Earl、Acul、PstI、BpmL、Ddel、Sfc1、Afl1、BpuEI、SmII、Aval、BsoBI、MboII、BbsI、XmnI、BsmL、Nb.BsmI、EcoRI、Hgal、AatII、Zral、Tth11I、PfF1、PshAI、Ahd1、Drd1、Eco53kI、Sad、BseRI、Plel、Nt BbI、BtsI、BmbI、BtsI、NbBtsI、BstAPI、SphII、SphI、NmeAIII、NaeI、NgoMIV、BglII、BglII、BglII、BglII、BglII、AsiSI、BtgZI、HinPlI、Hhal、BssHII、NotI、Fnu4H1、Cac8I、Mwol、NheI、Bmt1、SapI、BspQI、Nt.BspQI、Blp1、Tsel、ApeK1、Bsp12861、Alw1、Nt.AlwI、BamHI、FokI、BtsCI、HaelII、Phol、FseI、SfI、NarI、KasI、Sfol、PluTI、AscI、Ecil、BsmFI、ApaI、PspOMI、Sau96I、NlalV、KpnI、Acc65I、BsaI、HphI、BstEII、Avail、Ban1、BaeGI、BsaHI、、Rsal、CviQI、BstZ17I、BciVI、SalI、Nt.BsmAI、BsmAI、BcoDI、ApaLI、Bsgl、Accl、Hpyl66II、Tsp45I、Hpal、Pmel、Hindi、BsiHKAI、ApoI、Nspl、BsrFI、BstYI、Haell、CviKI-、EcoRI109I、PpuMI、I-CeuI、SnaBI、I-SceI、BspHI、BspEI、MmeI、Taqal、Nrul、Hpyl 881、Hpyl88III、XbaI、Bell、HpyCH4V、FspI、PI-PspI、MscI、BsrGI、Psil、BstBI、Dral、PspXI、BsaWI、BsaAI、Eael、优选Xhol、XbaI、HindIII、NcoI、NotI、EcoRI、EcoRV、BamHI、NheI、SacI、SalI、BstBI。本文所用的术语“多克隆位点”还指用于重组事件的短DNA序列，例如在Gateway克隆策略中或用于诸如Gibbson装配或拓扑克隆的方法。
本文所用的术语“耶尔森氏菌野生型菌株”是指天然存在的变体(如小肠结肠炎耶尔森氏菌E40)或含有允许使用载体的遗传修饰的天然存在的变体，例如限制性内切核酸酶或抗生素抗性基因中的缺失突变(如小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40、小肠结肠炎耶尔森氏菌E40的氨苄青霉素敏感型衍生物)。这些菌株含有染色体DNA以及未修饰的毒力质粒(称为pYV)。
术语“包含”通常在包括的意义上使用，也就是说允许一个或多个特征或组件的存在。
在一个实施方案中，本发明提供了重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述革兰氏阴性细菌菌株选自耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属和假单胞菌属。在一个实施方案中，本发明提供了一种重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述革兰氏阴性细菌菌株选自耶尔森氏菌属和沙门氏菌属。优选地，革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，更优选地耶氏酵母菌株。最优选的是小肠结肠炎耶尔森氏菌E40[13]或氨苄青霉素敏感性衍生物，如[36]中所述的小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40。还优选地，革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，更优选沙门氏菌肠道菌株。最优选的是如Public health England culture collection(NCTC 13347)所述的鼠伤寒沙门氏菌SL1344。
在本发明的一个实施方案中，来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含细菌T3SS效应蛋白或其N末端片段，其中T3SS效应蛋白或其N末端片段可包含伴侣结合位点。包含分子伴侣结合位点的T3SS效应子蛋白或其N末端片段在本发明中特别用作递送信号。优选的T3SS效应蛋白或其N末端片段选自SopE、SopE2、SptP、YopE、ExoS、SipA、SipB、SipD、SopA、SopB、SopD、IpgB1、IpgD、SipC、SifA、SseJ、Sse、SrfH、YopJ、AvrA、AvrBsT、YopT、YopH、YpkA、Tir、EspF、TccP2、IpgB2、OspF、Map、OspG、Ospl、IpaH、SspH1、VopF、ExoS、ExoT、HopAB2、XopD、AvrRpt2、HopAO1、HopPtoD2、HopU1、GALA蛋白家族、AvrBs2、AvrD1、AvrBS3、YopO、YopP、YopE、YopM、YopT、EspG、EspH、EspZ、IpaA、IpaB、IpaC、VirA、IcsB、OspC1、OspE2、IpaH9.8、IpaH7.8、AvrB、AvrD、AvrPphB、AvrPphC、AvrPphEPto、AvrPpiBPto、AvrPto、AvrPtoB、VirPphA、AvrRpmL、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoN、PopB、PopP2、AvrBs3、XopD和AvrXv3。更优选的T3SS效应蛋白或其N末端片段选自SopE、SptP、YopE、ExoS、SopB、IpgB1、IpgD、YopJ、YopH、EspF、OspF、ExoS、YopO、YopP、YopE、YopM、YopT、其中最优选的T3SS效应蛋白或其N末端片段选自IpgB1、SopE、SopB、SptP、OspF、IpgD、YopH、YopO、YopP、YopE、YopM、YopT、特别是YopE或其N末端片段。同样优选的T3SS效应蛋白或其N末端片段选自SopE、SopE2、SptP、SteA、SipA、SipB、SipD、SopA、SopB、SopD、IpgB1、IpgD、SipC、SifA、SifB、SseJ、Sse、SrfH、YopJ、AvrA、AvrBsT、YopH、YpkA、Tir、EspF、TccP2、IpgB2、OspF、Map、OspG、Ospl、IpaH、VopF、ExoS、ExoT、HopAB2、AvrRpt2、HopAO1、HopU1、GALA蛋白家族、AvrBs2、AvrD1、YopO、YopP、YopE、YopT、EspG、EspH、EspZ、IpaA、IpaB、IpaC、VirA、IcsB、OspC1、OspE2、IpaH9.8、IpaH7.8、AvrB、AvrD、AvrPphB、AvrPphC、AvrPphEP、AvrPpiBPto、AvrPto、AvrPtoB、VirPphA、AvrRpmL、HopPtoD2、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoN、PopB、PopP2、AvrBs3、XopD和AvrXv3。同样更优选的T3SS效应蛋白或其N末端片段选自SopE、SptP、SteA、SifB、SopB、IpgB1、IpgD、YopJ、YopH、EspF、OspF、ExoS、YopO、YopP、YopE、YopT、其中同样最优选的T3SS效应蛋白或其N末端片段选自IpgB1、SopE、SopB、SptP、SteA、SifB、OspF、IpgD、YopH、YopO、YopP、YopE和YopT、特别是SopE、SteA或YopE或其N末端片段、更特别是SteA或YopE或其N末端片段、最特别是YopE或其N末端片段。
在有些实施方案中，由第一DNA序列编码的细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含细菌T3SS效应蛋白或其N末端片段，其中其N末端片段包括至少前10个，优选至少前20个，更优选至少前100个氨基酸。
一些实施方案中，由第一DNA序列编码的细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含细菌T3SS效应蛋白或其N末端片段，其中细菌T3SS效应蛋白或其N末端片段包含伴侣结合位点。
优选的包含伴侣结合位点的T3SS效应蛋白或其N末端片段包含伴侣伴侣结合位点和T3SS效应蛋白或其N末端片段的以下组合：SycE-YopE、InvB-SopE、SicP-SptP、SycT-YopT、SycO-YopO、SycN/YscB-YopN、SycH-YopH、SpcS-ExoS、CesF-EspF、SycD-YopB、SycD-YopD。更优选的是SycE-YopE、InvB-SopE、SycT-YopT、SycO-YopO、SycN/YscB-YopN、SycH-YopH、SpcS-ExoS、CesF-EspF。最优选的是YopE或其包含SycE伴侣结合位点的N-末端片段，例如YopE效应蛋白的N-末端片段，其含有YopE效应蛋白的N-末端138个氨基酸，本文称为YopE
在本发明的一个实施方案中，重组革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，并且由第一DNA序列编码的细菌T3SS效应蛋白的递送信号，包含YopE效应子蛋白或N末端部分，优选为小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株YopE效应蛋白或其N末端部分。优选地，SycE结合位点包含在YopE效应蛋白的N末端部分内。在这方面，YopE效应子蛋白的N末端片段可以包含N末端的12、16、18、52、53、80或138个氨基酸[10，37，38]。最优选的是如在Forsberg和Wolf-Watz[39]中所描述的，在本文中称为YopE
在本发明的一个实施方案中，重组革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，并且由第一DNA序列编码的细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含SopE或SteA效应蛋白或其N末端部分，优选肠沙门氏菌SopE或SteA效应蛋白或其N末端部分。优选地，伴侣结合位点包含在SopE效应蛋白的N末端部分内。在这方面，SopE效应蛋白的N末端片段可以包含N末端81或105个氨基酸。最优选的是全长SteA和含有如SEQ ID NO.142或143所描述的效应蛋白的N-末端105个氨基酸的SopE效应蛋白的N末端片段。
本领域技术人员熟悉鉴定能够递送蛋白质的效应子蛋白的多肽序列的方法。例如，由Sory等人[13]描述的一种这样的方法。简言之，Yop蛋白的各种部分可以框内融合到报告子酶，例如百日咳博德特氏菌脂环化酶的钙调蛋白激活的腺苷酸环化酶结构域(或Cya)。Yop-Cya杂合蛋白到真核细胞的胞质溶胶中的递送通过在感染的真核细胞中出现导致cAMP积累的环化酶活性来指示。通过采用这种方法，如果需要，本领域技术人员可以确定能够递送蛋白质的最小序列需求，即最短长度的连续氨基酸序列，参见例如[13]。因此，本发明的优选递送信号至少由能够递送蛋白质的T3SS效应蛋白的最小氨基酸序列组成。在一个实施方案中，本发明提供突变体重组革兰氏阴性细菌菌株，特别是重组革兰氏阴性细菌菌株，其对于至少一种T3SS功能性效应蛋白的产生是缺陷的。
根据本发明，这种突变体革兰氏阴性细菌菌株如这样的突变型耶尔森氏菌菌株可以通过将至少一个突变引入至少一种效应物编码基因中来产生。优选地，就耶尔森氏菌菌株而言，这种效应物编码基因包括YopE、YopH、YopO/YpkA、YopM、YopP/YopJ和YopT。
优选地，就沙门氏菌菌株而言，这些效应物编码基因包括AvrA、CigR、GogB、GtgA、GtgE、PipB、SifB、SipA/SspA、SipB、SipC/SspC、SipD/SspD、SlrP、SopB/SigD、SopA、SpiC/SsaB、SseB、SseC、SseD、SseF、SseG、Ssel/SrfH、SopD、SopE、SopE2、SspH1、SspH2、PipB2、SifA、SopD2、SseJ、SseK1、SseK2、SseK3、SseL、SteC、SteA、SteB、SteD、SteE、SpvB、SpvC、SpvD、SrfJ、SptP。最优选地，所有效应物编码基因都缺失。本领域技术人员可以使用任何数量的标准技术在这些T3SS效应基因中产生突变。Sambrook等描述了这样的技术。参见Sambrook等[40]。
根据本发明，突变可以在效应物编码基因的启动子区产生，使得这种效应基因的表达被消除。
突变也可以在效应物编码基因的编码区中产生，使得编码的效应子蛋白的催化活性被消除。效应蛋白的“催化活性”通常指效应蛋白的抗靶细胞功能，即毒性。这种活性由效应子蛋白的催化结构域中的催化基序控制。用于鉴定效应蛋白的催化结构域和/或催化基序的方法是本领域技术人员公知的。例如参见[41，42]。
因此，本发明的一个优选的突变是整个催化结构域的缺失。另一个优选的突变是效应物编码基因中的移码突变，使得催化结构域不存在于由这种“移码”基因表达的蛋白质产物中。最优选的突变是具有效应子蛋白的整个编码区缺失的突变。本发明还涵盖其它突变，例如小缺失或碱基对取代，其在效应子蛋白的催化基序中产生，导致破坏给定效应子蛋白的催化活性。
在T3SS功能效应蛋白的基因中产生的突变可以通过许多方法引入特定菌株。一种这样的方法包括将突变基因克隆到“自杀”载体中，该载体能够通过等位基因交换将突变序列引入菌株。这种“自杀”载体的一个例子描述在[43]中。
以这种方式，可将多个基因中产生的突变连续地引入产生多突变体的革兰氏阴性细菌菌株中，例如六重突变重组菌株。这些突变序列的引入顺序并不重要。在有些情况下，可能需要仅突变一些但不是所有的效应基因。因此，本发明进一步考虑除六突变型耶尔森氏菌以外的多突变体耶尔森氏菌，例如双突变体、三突变体、四突变体和五重突变株。为了递送蛋白质的目的，本发明突变株的分泌和转运系统需要是完整的。
本发明优选的重组革兰氏阴性细菌菌株是六联突变型耶尔森氏菌菌株，其中所有效应物编码基因都被突变，使得所得的耶尔森氏菌不再产生任何功能效应蛋白。对于小肠结肠炎耶尔森氏菌，这种六联突变型耶尔森氏菌菌株被命名为ΔyopH、O、P、E、M、T。如实例，这样的六联突变体可以从肠道结肠炎耶尔森氏菌MRS40菌株产生，产生小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH、O、P、E、M、T，这是优选的。
本发明的另一方面涉及用于与重组革兰氏阴性细菌菌株组合用于将期望的蛋白质递送到真核细胞中的载体，其中所述载体沿5'至3'方向包含：
启动子；
编码细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，可操作地连接到所述启动子；
框内融合到所述第一DNA序列的3'末端的编码异源蛋白质的第二DNA序列；和作为选择的
编码蛋白酶切割位点的第三DNA序列，其中所述第三DNA序列位于所述第一DNA序列的3'末端和所述第二DNA序列的5'末端之间。
如上所述的启动子，异源蛋白和蛋白酶切割位点可用于革兰氏阴性细菌菌株的载体。
根据本发明可以使用的载体取决于本领域技术人员已知的革兰氏阴性细菌菌株。根据本发明可以使用的载体包括表达载体、用于染色体或毒力质粒插入的载体和用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段。在例如耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株上有用的表达载体是pUC、pBad、pACYC、pUCP20和pET质粒。在例如耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株上有用的用于染色体或毒力质粒插入的载体是例如pKNG101。用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段是指在例如耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株如λ-红色基因工程。
用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段可以插入本发明的第一、第二和/或第三DNA序列，使得第一、第二和/或第三DNA序列可操作地连接到内源重组革兰氏阴性细菌菌株的启动子。因此，如果使用用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段，可以在内源细菌DNA(染色体或质粒DNA)上编码内源启动子，并且仅第一和第二DNA序列是由用于染色体或毒力质粒插入的工程化载体或用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段提供。因此，用于转化重组革兰氏阴性细菌菌株的载体不必包含启动子，即本发明的重组革兰氏阴性细菌菌株可以用不包含启动子的载体转化。优选地，使用表达载体。本发明的载体通常用于通过细菌T3SS将异源蛋白质在体外和体内递送到真核细胞中。
用于耶尔森氏菌的优选表达载体选自pBad_Si1和pBad_Si2。通过将含有用于YopE和SycE的内源启动子的SycE-YopE
沙门氏菌的优选表达载体选自pSi_266、pSi_267、pSi_268和pSi_269。从肠炎沙门氏菌(S.enterica)SL1344中扩增含有相应的内源性启动子和SteA
本发明的载体可包括其它序列元件，例如3'终止序列(包括终止密码子和poly A序列)或赋予药物抗性的基因，其允许选择已接受本载体的转化体。本发明的载体可以通过许多已知的方法转化到重组革兰氏阴性细菌菌株中。为了本发明的目的，用于导入载体的转化方法包括但不限于电穿孔、磷酸钙介导的转化、缀合或其组合。例如，可以通过标准电穿孔程序将载体转化入第一细菌菌株。随后，这样的载体可以通过缀合，也称为“移动”的过程从第一细菌菌株转移到期望的菌株中。可以用例如抗生素选择转化体(即：吸收载体的革兰氏阴性细菌菌株)。这些技术是本领域公知的。参见例如[13]。
根据本发明，本发明的重组革兰氏阴性细菌菌株的表达载体的启动子可以是相应菌株的T3SS效应蛋白的天然启动子或相容的细菌菌株或用于表达载体的启动子其可用于例如耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株，例如pUC和pBad。这样的启动子是T7启动子，Plac启动子或Ara-bad启动子。如果重组革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，则启动子可以来自耶尔森氏病毒virulon基因。“耶尔森氏病毒virulon基因”是指在耶尔森氏菌pYV质粒上的基因，其表达受温度和通过与靶细胞接触两者控制。这些基因包括编码分泌机制元件(Ysc基因)的基因、编码转运蛋白(YopB，YopD和LcrV)的基因、编码控制元件的基因(YopN，TyeA和LcrG)、编码T3SS效应子伴侣(SycD、SycE、SycH、SycN、SycO和SycT)以及编码效应子(YopE、YopH、YopO/YpkA、YopM、YopT和YopP/YopJ)的基因以及其他pYV编码的蛋白如VirF和YadA。在本发明的优选实施方案中，启动子是T3SS功能效应物编码基因的天然启动子。如果重组革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，则启动子选自YopE、YopH、YopO/Y pkA、YopM和YopP/YopJ中的任一个。更优选地、启动子来自YopE或SycE。
如果重组革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，则启动子可以来自Spil或Spill致病性岛或来自其他地方编码的效应蛋白。这些基因包括编码分泌机制元件的基因、编码转运蛋白的基因、编码控制元件的基因、编码T3SS效应子伴侣的基因、编码效应子的基因以及由SPI-1或SPI-2编码的其它蛋白。在本发明的一个优选实施方案中，启动子是T3SS功能效应物编码基因的天然启动子。如果重组革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，则启动子选自任何一种效应蛋白。更优选地，启动子来自SopE、InvB或SteA。
在优选的实施方案中，表达载体包含编码蛋白酶切割位点的DNA序列。功能性和通常适用的切割位点的产生允许在转运后切割递送信号。由于递送信号可干扰靶细胞内转运蛋白的正确定位和/或功能，在递送信号和目标蛋白之间引入蛋白酶切割位点提供了几乎天然蛋白首次递送到真核细胞中。优选地，蛋白酶切割位点是被选自肠激酶(轻链)、肠肽酶、解离蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶3C、TEV蛋白酶、TVMV蛋白酶、因子Xa的蛋白酶或其催化结构域切割的氨基酸基序蛋白酶和凝血酶，更优选由TEV蛋白酶切割的氨基酸基序。同样优选的蛋白酶切割位点是被选自肠激酶(轻链)、肠肽酶、解离蛋白酶、人类鼻病毒蛋白酶3C、TEV蛋白酶、TVMV蛋白酶、因子Xa蛋白酶、泛素加工蛋白酶(称为去泛素化酶)和凝血酶一组的蛋白酶或催化结构域切割的氨基酸基序。最优选的是被TEV蛋白酶或泛素加工蛋白酶切割的氨基酸基序。因此，在本发明的另一个实施方案中，异源蛋白质通过蛋白酶从细菌T3SS效应蛋白的递送信号裂解。优选的裂解方法是这样的方法，其中：
a)蛋白酶通过本文所述的重组革兰氏阴性细菌菌株转移到真核细胞中，其表达包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和作为异源蛋白的蛋白酶的融合蛋白；或
b)蛋白酶在真核细胞中为组成型或瞬时表达。
通常，用于将期望的蛋白质递送到真核细胞中的重组革兰氏阴性细菌菌株和将蛋白酶转运到真核细胞中的重组革兰氏阴性菌株是不同的。
在本发明的一个实施方案中，载体包含编码标记分子或标记分子的受体位点的另外的DNA序列。编码标记分子或标记分子的受体位点的另外的DNA序列通常与第二DNA序列的5'端或3'端融合。用于标记分子的优选的标记分子或受体位点选自增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、香豆素、香豆素连接酶受体位点、试卤灵、resurofm连接酶受体位点、与FlAsH一起使用的四半胱氨酸基序/ReAsH染料(life technologies)。最优选的是试卤灵和resurofm连接酶受体位点或EGFP。标记分子或受体位点对标记分子的使用将导致标记分子与目标异源蛋白质的连接，然后将其原样传递到真核细胞中，使得能够通过例如活细胞显微镜追踪蛋白质。在本发明的一个实施方案中，载体包含编码肽标签的另外的DNA序列。编码肽标签的另外的DNA序列通常融合到第二DNA序列的5'端或3'端。优选的肽标签选自Myc标签、His标签、Flag标签、HA标签、Strep标签或V5标签或这些组中的两个或多个标签的组合。最优选的是Myc标签、Flag标签、His标签和组合的Myc-和His-标签。使用肽标签将导致例如通过使用抗标签抗体的免疫荧光或Western印迹使得标记蛋白质具有可追踪性。此外，使用肽标签允许在分泌到培养物上清液中之后或在转移到真核细胞中之后亲和纯化期望的蛋白质，在这两种情况下，使用适合相应标签的纯化方法(例如使用的金属螯合亲和纯化与Flag标签一起使用的基于His标签或抗Flag抗体的纯化)。
在本发明的一个实施方案中，载体包含编码核定位信号(NLS)的另外的DNA序列。编码核定位信号(NLS)的另外的DNA序列通常融合到第二DNA序列的5'端或3'端，其中所述另外的DNA序列编码核定位信号(NLS)。优选的NLS选自SV40大T抗原NLS及其衍生物[44]以及其它病毒NLS。最优选的是SV40大T抗原NLS及其衍生物。
在本发明的一个实施方案中，载体包含多克隆位点。多克隆位点通常位于第一DNA序列的3'端和/或第二DNA序列的5'端或3'端。载体可包含一个或多于一个多克隆位点。优选的多克隆位点选自由XhoI、XbaI、HindIII、NcoI、NotI、EcoRI、EcoRV、BamHI、NheI、SacI、SalI、BstBI组成的限制酶组。最优选的是XbaI、XhoI、BstBI和HindIII。
从载体的融合的第一和第二和任选的第三DNA序列表达的蛋白质也称为“融合蛋白”或“杂合蛋白”，即递送信号和异源蛋白的融合蛋白或杂合物。融合蛋白也可以包括例如递送信号和两种或更多种不同的异源蛋白。
本发明涉及用于将如上所述的异源蛋白质递送到细胞培养物以及体内的真核细胞中的方法。因此,在一个实施方案中，递送异源蛋白质的方法包括
i)培养如本文所述的革兰氏阴性细菌菌株；
ii)用i)中的革兰氏阴性细菌菌株接触真核细胞，其中包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白的融合蛋白由革兰氏阴性细菌菌株表达并转移入真核细胞；和任选地
iii)切割所述融合蛋白使得异源蛋白与菌T3SS效应蛋白的递送信号切割开来。
在有些实施方案中，包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白的至少两种融合蛋白由革兰氏阴性细菌菌株表达并通过本发明的方法转移到真核细胞中。
可以根据本领域已知的方法(例如：FDA、Bacteriological Analytical Manual(BAM)、第8章：小肠结肠炎耶尔森氏菌)培养重组革兰氏阴性细菌菌株从而表达包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白的融合蛋白。优选地、重组革兰氏阴性细菌菌株可以在脑心浸液肉汤中在如在28℃时培养。为了诱导T3SS以及如YopE/SycE启动子依赖基因的表达，细菌可以在37℃生长。
在优选的实施方案中，使真核细胞与i)的两种革兰氏阴性细菌菌株接触，其中第一革兰氏阴性细菌菌株表达第一融合蛋白，其包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和第一异源蛋白，并且第二革兰氏阴性细菌菌株表达第二融合蛋白，其包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和第二异源蛋白，使得第一和第二融合蛋白转运到真核细胞中。该实施方案提供了例如真核细胞与两种细菌菌株共感染如递送例如两个不同的杂交蛋白质进入细胞以解决它们的功能性互作的有效方法。本发明涉及广范围的真核细胞，其可以被本发明的重组革兰氏阴性细菌菌株靶向。Hi-5(BTI-TN-5B1-4；life technologiesB855-02)、HeLa细胞、HeLa Ccl2(如ATCC No.CCL-2)、成纤维细胞、例如3T3成纤维细胞(ATCC号CCL-92)或Mef(ATCC号SCRC-1040)、Hek(ATCC号CRL-1573)、HUVEC(ATCC号PCS-100-013)、CHO如ATCCNo.CCL-61)、Jurkat(如ATCC No.TIB-152)、Sf-9(如ATCC No.CRL-1711)、HepG2(如ATCCNo.HB-8065)、Vera CCL-81)、MDCK(ATCC编号CCL-34)、THP-1(ATCC编号TIB-202)、J774(编号TIB-67)、RAW(编号TIB-、Caco2(如ATCC No.HTB-37)、NCI细胞系(如ATCC No.HTB-182)、DU145(如ATCC No.HTB-81)、Lncap(如ATCC No.CRL-1740)、MCF-7(ATCC No.HTB-22)、MDA-MB细胞系(如ATCC No.HTB-128)、PC3(如ATCC No.CRL-1435)、T47D(如ATCC No.CRL-2865)、A549 ATCC No.CCL-185)、U87(如ATCC No.HTB-14)、SHSY5Y(如ATCC No.CRL-2266s)、Ea.Hy926(如ATCC No.CRL-2922)、Saos-2 HTBH-85)、4T1(如ATCC No.CRL-2539)、B16F10(如ATCC No.CRL-6475)或原代人肝细胞(如life technologiesHMCPIS)、优选HeLa、Hek、HUVEC、3T3、CHO、Jurkat、Sf-9、HepG2Vera、THP-1、Caco2、Mef、A549,4T1、B16F10和原代人肝细胞，最优选HeLa、Hek、HUVEC、3T3、CHO、Jurkat、THP-1、A549和Mef。“靶”是指重组革兰氏阴性细菌菌株对真核细胞的细胞外粘附。
根据本发明，蛋白质的递送可以通过在适当的条件下使真核细胞与重组革兰氏阴性细菌菌株接触来实现。关于诱导virulon基因的表达和转运的条件，包括期望的温度、Ca
本领域技术人员还可以使用多种测定来确定融合蛋白的递送是否成功。例如：可以使用识别融合标签(如Myc标签)的抗体通过免疫荧光检测融合蛋白。测定还可以基于被递送的蛋白质的酶活性如[13]所述的测定。
在一个实施方案中，本发明提供了纯化异源蛋白的方法，包括培养如本文所述的革兰氏阴性细菌菌株，使得包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白的融合蛋白被表达和分泌培养物的上清液。所表达的融合蛋白还可以在来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白之间包含蛋白酶切割位点和/或可以进一步包含肽标签。
因此，在一个具体实施方案中，纯化异源蛋白质的方法包括：
i)培养本文所述的革兰氏阴性细菌菌株，使得包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号、异源蛋白和在细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白之间蛋白酶裂解位点的融合蛋白表达并分泌到培养物的上清液中；
ii)向培养物的上清液中加入蛋白酶，其中所述蛋白酶切割融合蛋白，使得异源蛋白质与来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号分割；
iii)任选地从培养物的上清液中分离异源蛋白质。
因此，在另一个具体实施方案中，纯化异源蛋白质的方法包括：
i)如本文所述培养革兰氏阴性细菌菌株，使得包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号、异源蛋白和肽标签的融合蛋白被表达并分泌到培养物的上清液中；
ii)靶向肽标签，例如通过上清液的亲和柱纯化。
因此，在另一个具体实施方案中，纯化异源蛋白质的方法包括：
i)培养如本文所述的革兰氏阴性细菌菌株，使得包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号、异源蛋白质和在细菌T3SS效应蛋白的递送信号与异源蛋白质之间的肽标签的融合蛋白表达并分泌到培养物的上清液中；
ii)向培养物的上清液中加入蛋白酶，其中所述蛋白酶切割融合蛋白，使得异源蛋白质与来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号切割；
iii)靶向肽标签，例如通过上清液的亲和柱纯化。
在上述特定实施方案中，蛋白酶可以以例如纯化的蛋白酶蛋白的形式加入到培养物的上清液中，或通过向培养物的上清液中加入表达和分泌蛋白酶的细菌菌株。其它步骤可包括除去蛋白酶如通过亲和柱纯化。
在一个实施方案中，本发明提供本文所述的重组革兰氏阴性细菌菌株用于药物。
在一个实施方案中，本发明提供了本文所述的重组革兰氏阴性细菌菌株，其用于将异源蛋白质如药物或如疫苗递送至受试者。异源蛋白质可以通过使革兰氏阴性细菌菌株与真核细胞例如真菌细胞接触而如疫苗递送给受试者，例如与活的动物在体内这样异源蛋白质转移到活动物中，然后产生针对异源蛋白质的抗体。产生的抗体可以直接使用或分离和纯化并用于诊断、研究以及治疗用途。包含抗体或其中含有的DNA序列的B细胞可以用于进一步产生特异性抗体用于诊断、研究以及治疗用途。
在一个实施方案中，本发明提供了递送异源蛋白质的方法，其中异源蛋白质在体外递送到真核细胞中。在另一个实施方案中，本发明提供了递送异源蛋白质的方法，其中真核细胞是活的动物，其中活体动物与革兰氏阴性细菌菌株在体内接触使得融合蛋白转运到活的动物中。优选的动物是哺乳动物，更优选人。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的重组革兰氏阴性细菌菌株用于由递送的异源蛋白质引发的细胞途径或事件的抑制剂的高通量筛选的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供革兰氏阴性细菌菌株的文库，其中由革兰氏阴性细菌菌株的表达载体的第二DNA序列编码的异源蛋白质是人或鼠蛋白质、优选人蛋白质。其中由革兰氏阴性细菌菌株表达的每种人或胞壁质蛋白在氨基酸序列上不同。可能的库可以包含Addgene人激酶Orf收集物的560蛋白(Addgene No.1000000014)。如用于表达的克隆载体可以使用上述表达载体。在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含本文所述的载体及表达和分泌能够切割载体包含的蛋白酶裂解位点的蛋白酶的细菌菌株。特别有用的载体是与细菌菌株组合用于将所需蛋白质递送到如上所述的真核细胞中的载体，其中所述载体沿5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，可操作地连接到所述启动子；
框内融合到所述第一DNA序列的3'末端的编码异源蛋白质的第二DNA序列；
编码蛋白酶切割位点的第三DNA序列，其中所述第三DNA序列位于所述第一DNA序列的3'末端和所述第二DNA序列的5'末端之间。
实施例
实施例1：
A)材料和方法
细菌菌株及其生长条件。本研究中使用的菌株列于图15A至M。用于质粒纯化和克隆的大肠杆菌Top 10以及用于接合的大肠杆菌Sm10λ以及用于繁殖pKG101的大肠杆菌BW19610[46]，常规地在37℃下在LB琼脂平板上和在LB肉汤中生长。安非他酮以200μg/mL(Yersinia)或100μg/mL(大肠杆菌)的浓度使用以选择表达载体。链霉素以100μg/mL的浓度使用以选择自杀载体。肠炎克雷伯菌MRS40[36]非安非他明抗性E40衍生物[13]及其衍生菌株在脑心浸液(BHI；Difco)中常规生长。向所有小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株中加入萘啶酸(35μg/mL)，并且所有的肠炎杆菌菌株另外补充100μg/mL内消旋-2,6-二氨基庚二酸(mDAP，Sigma Aldrich)。肠杆菌SL1344在37℃下常规地在LB琼脂平板上和在LB肉汤中生长。使用浓度为100μg/mL的安非他酮以选择肠炎沙门氏菌中的表达载体。
小肠结肠炎耶尔森氏菌的遗传调控。小肠结肠炎耶尔森氏菌的遗传调控已经被描述[47，48]。简言之，通过2-片段重叠PCR使用纯化的pYV40质粒或基因组DNA作为模板构建用于修饰或缺失pYV质粒或染色体上的基因修饰或缺失的突变体，生成相应基因缺失或修饰部分两侧200-250bp的侧翼。将所得片段克隆在大肠杆菌BW19610[46]中的pKNG101[43]中。将序列验证的质粒转化到大肠杆菌Sm10λpir中，从中将质粒转移到相应的小肠结肠炎耶尔森氏菌株中。携带整合载体的突变体在无选择压力的情况下繁殖一代。然后使用蔗糖选择失去载体的克隆。最后通过菌落PCR鉴定突变体。
质粒的构建。质粒pBad_Si2或pBad Sil(图10)用于克隆具有YopE(SEQ ID No.2)的N末端138个氨基酸的融合蛋白。通过将包含用于YopE和SycE的内源启动子的SycE-YopE
全长基因或其片段用下表I中列出的特异性引物扩增，并作为与YopE
表I(引物Nr.Si_：序列)
285:CATACCATGGGAGTGAGCAAGGGCGAG
286:GGAAGATCTttACTTGTACAGCTCGTCCAT
287:CGGGGTACCTCAACTAAATGACCGTGGTG
288:GTTAAAGCTTttcgaatctagactcgagCGTGGCGAACTGGTC
292:C AGTctcgagC AAATTCTAAAC AAAATACTTCC AC
293:cagtTTCGAATTAATTTGTATTGCTTTGACGG
296:C AGTctcgagACTAAC AT AAC ACTATCC ACCC AG
297:GTTAAAGCTTTCAGGAGGCATTCTGAAG
299:CAGTctcgagCAGGCCATCAAGTGTGTG
300:cagtTTCGAATCATTTTCTCTTCCTCTTCTTCA
301:CAGTctcgagGCTGCCATCCGGAA
302:cagtTTCGAATCACAAGACAAGGCACCC
306:GTTAAAGCTTGGAGGCATTCTGAAGatacttatt
307:CAGTctcgagCAAATACAGAGCTTCTATCACTCAG
308:GTTAAAGCTTTCAAGATGTGATTAATGAAGAAATG
317:cagtTTCGAACCCATAAAAAAGCCCTGTC
318:GTTAAAGCTTCTACTCTATCATCAAACGATAAAATGg
324:CAGTctcgagTTCACTCAAGAAACGCAAA
339:cagtTTCGAATTTTCTCTTCCTCTTCTTCAcg
341:cgtaTCTAGAAAAATGATGAAAATGGAGACTG
342:GTT AAAGCTTttaGCTGG AG AC GGTG AC
346:CAGTctcgagTTCCAGATCCCAGAGTTTG
347:GTTAAAGCTTTCACTGGGAGGGGG
351:CAGTctcgagctcgagTTATCTACTCATAGAAACTACTTTTGCAG
352:cgcGGATCCtcagtgtctctgcggcatta
353:CATTTATTCCTCCTAGTTAGTCAcagcaactgctgctcctttc
354:gaaaggagcagcagttgctgTGACTAACTAGGAGGAATAAATG
355:cgattcacggattgctttctCATTATTCCCTCCAGGTACTA
356:TAGTACCTGGAGGGAATAATGagaaagcaatccgtgaatcg
357:cgtaTCTAGAcggctttaagtgcgacattc
364:cgtaTCTAGACTAAAGTATGAGGAGAGAAAATTGAA
365:GTTAAAGCTTTCAGCTTGCCGTCGT
367:CGTAtctagaGACCCGTTCCTGGTGC
369:cgtaTCTAGAccccccaagaagaagc
373:GTTAAAGCTTGCTGGAGACGGTGACC
386:CGTAtctagaTCAGGACGCTTCGGAGGTAG
387:CGTAtctagaATGGACTGTGAGGTCAACAA
389:CGTAtctagaGGCAACCGCAGCA
391:GTTAAAGCTTTCAGTCCATCCCATTTCTg
403:CGTAtctagatctggaatatccctggaca
406:GTT AAAGCTTgtctgtctcaatgccacagt
410:CAGTctcgagATGTCCGGGGTGGTg
413:cagtTTCGAATCACTGCAGCATGATGTC
417:CAGTctcgagAGTGGTGTTGATGATGACATG
420:cagtTTCGAATTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTTTGTGAG
423:C AGTctcgagATGCAC ATAACTAATTTGGGATT
424:cagtTTCGAATTATACAAATGACGAATACCCTTT
425:GTTAAAGCTTttacaccttgcgcttcttcttgggcggGCTGGAGACGGTGAC
428:CGTAtctagaATGGACTTCAACAGGAACTTT
429:CGTAtctagaGGACATAGTCCACCAGCG
430:GTTAAAGCTTTCAGTTGGATCCGAAAAAC
433:CGTAtctagaGAATTAAAAAAAACACTCATCCCA
434:CGTAtctagaCCAAAGGCAAAAGCAAAAA
435:GTTAAAGCTTTTAGCTAGCCATGGCAAGC
436:CGTAtctagaATGCCCCGCCCC
437:GTTAAAGCTTCTACCCACCGTACTCGTCAAT
438:CGTAtctagaATGTCTGAC ACGTCC AGAGAG
439:GTTAAAGCTTTCATCTTCTTCGCAGGAAAAAG
445:cgcGGATCCttatgggttctcacagcaaaa
446:C ATTT ATTCCTCCT AGTTAGTC Aaggcaacagccaatcaagag
447:ctcttgattggctgttgcctTGACT AACT AGGAGG AATAAATG
448:ttgattgcagtgacatggtgCATTATTCCCTCC AGGTACTA
449:TAGT ACCTGGAGGGAATAATGcaccatgtcactgcaatcaa
450:cgtaTCTAGAtagccgcagatgttggtatg
451:CGTAtctagaGATCAAGTCCAACTGGTGG
463:C AGTctcgaggaaagcttgtttaaggggc
464:cagtTTCGAAttagcgacggcgacg
476:GTT AAAGCTTttACTTGTAC AGCTCGTCC AT
477:CGTAtctagaGTGAGCAAGGGCGAG
478:CAGTctcgagATGGAAGATTATACCAAAATAGAGAAA
479:GTTAAAGCTTCTACATCTTCTTAATCTGATTGTCCa
482:CGTAtctagaATGGCGCTGCAGCt
483:GTTAAAGCTTTCAGTCATTGACAGGAATTTTg
486:CGTAtctagaATGGAGCCGGCGGCG
487:GTTAAAGCTTTCAATCGGGGATGTCTg
492:CGTAtctagaATGCGCGAGGAGAACAAGGG
493:GTTAAAGCTTTCAGTCCCCTGTGGCTGTGc
494:CGTAtctagaATGGCCGAGCCTTG
495:GTTAAAGCTTttaTTGAAGATTTGTGGCTCC
504:CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTC AAAGTGAAAATCTGT ATTTTC AAAGTATGCCCCGCCCC
505:GTTAAAGCTTCCCACCGTACTCGTCAATtc
508:CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAG TATGGCCGAGCCTTG
509:GTTAAAGCTTTTGAAGATTTGTGGCTCCc
511:CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTC AAAGTGAAAATCTGT ATTTTC AAAGTGTGAGCAAGGGCGAG
512:CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTC AAAGTGAAAATCTGT ATTTTC AAAGTCCGC CGAAAAAAAAACGTAAAGTTGTGAGCAAGGGCGAG
513:GTTAAAGCTTttAAACTTTACGTTTTTTTTTCGGCGGCTTGTACAGCTCGTCCAT
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表II：克隆的融合蛋白
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Yop分泌。通过在BHI-Ox(允许分泌条件)中将培养物转移至37℃进行顶部调节子的诱导[49]。添加葡萄糖作为碳源(4mg/mL)。
通过在4℃下以20800g离心10min来分离总细胞和上清液部分。将细胞沉淀作为总细胞级分。上清液中的蛋白质用10％(w/v)三氯乙酸在4℃沉淀1小时。在离心(20800g，15min)并除去上清液后，将所得沉淀在冰冷的丙酮中洗涤过夜。再次离心样品，弃去上清液，将沉淀物空气干燥并重悬于1x SDS装载染料中。
通过SDS-PAGE分析分泌的蛋白。在每种情况下，每个泳道加载由3×10
使用针对YopE的大鼠单克隆抗体(MIPA193-13A9；1:1000，[50])进行免疫印迹。将针对小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔΗΟΡΕΜΤasd的抗血清过夜预先吸附两次以减少背景染色。在用ECL化学发光底物(LumiGlo，KPM)显色之前，用针对大鼠抗体并与辣根过氧化物酶缀合的二抗(1：5000；Southern biotech)进行检测。
细胞培养和感染。HeLa Ccl2、瑞士3T3成纤维细胞、4T1、B16F10和D2A1在补充有10％FCS和2mM L-谷氨酰胺(cDMEM)的Dulbecco’s改进的Eagle培养基(DMEM)中培养。分离HUVEC并如所述[51]进行培养。Jurkat和4T1细胞在补充有10％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640中培养。使小肠结肠炎耶尔森氏菌在含有添加剂的BHI中在室温下生长过夜，在新鲜BHI中稀释至OD600为0.2，并在室温下生长2小时，然后温度调至37℃下再水浴振荡30min或在EGFP递送的情况下振荡1小时。最后，通过离心(6000rcf，30秒)收集细菌，并用补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺的DMEM洗涤一次。肠杆菌在含有添加剂的LB中在37℃下生长过夜，并且在新鲜LB中1:40稀释并在37℃生长2.5小时(Spil T3SS诱导条件)，或者将过夜培养物在37℃下进一步温育(溢出T3SS诱导条件)。最后，通过离心(6000rcf，30秒)收集细菌，并用补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺的DMEM洗涤一次。将接种在96孔(用于免疫荧光)或6孔(用于免疫印迹)板中的细胞以指定的MOI在补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中感染。在添加细菌后，将板以1750rpm离心1min，并在37℃放置指定的时间段。如果需要，细胞外细菌用庆大霉素(100mg/mL)杀死。在免疫荧光分析的情况下，通过4％PFA固定来终止感染测定。对于免疫印迹分析，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，加入磷酸安全裂解缓冲液(Novagen)以裂解细胞。在冰上温育后，将细胞离心(16000rcf，25min，4℃)。收集上清液并通过Bradford BCA测定法(Pierce)在SDS PAGE和免疫印迹之前使用anti-phospho-Akt(Ser473和T308，均为Cell Signaling)、抗肌动蛋白(Millipore)、anti-Bid(CellSignaling)、anti-Myc(Santa Cruz)、anti-p38(Cell Signaling)、anti-phospho-p38(Thr80/Tyr182；Cell Signaling)、anti-Caspase-3pl7(Cell Signaling)和anti-Ink4C(Cell Signaling)抗体。
肠炎沙门氏菌的分泌分析。为了诱导肠炎沙门氏菌的蛋白质分泌，将肠杆菌在定轨振荡器(设定为150rpm)上在含有0.3M NaCl的LB中培养过夜。然后将肠杆菌在含有0.3MNaCl的新鲜LB中以1:50稀释，并在37℃下振荡生长4小时。
通过在4℃下以80000g离心20min来分离总细胞和上清液部分。将细胞沉淀作为总细胞级分。上清液中的蛋白质用三氯乙酸10％(w/v)最终在4℃沉淀1小时。在离心(20800g，15min)并除去上清液后，将所得沉淀在冰冷的丙酮中洗涤过夜。将样品再次离心，弃去上清液，将沉淀物空气干燥并重悬于1x SDS装载染料中。
通过SDS-PAGE分析分泌的蛋白。在每种情况下，每个泳道加载由3×10
来自感染细胞的T3SS转运蛋白的免疫印迹。如上所述，以100的MOI感染6孔板中的HeLa细胞。在用TEV蛋白酶转位的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株共感染的情况下，设定菌株的OD
免疫荧光。如上所述感染接种在96孔板(Corning)中的细胞，并在用4％PFA固定后，用PBS洗涤细胞三次。然后使用5％山羊血清在PBS 0.3％Triton X-100中在室温下封闭孔1小时。将一级抗体(anti-Myc，Santa Cruz，1:100)在含有1％BSA和0.3％Triton X-100的PBS中稀释，并将细胞在4℃孵育过夜。在用含有1％BSA和0.3％Triton X-100的PBS稀释二抗(AF 488抗小鼠，寿命技术，1:250)之前，用PBS洗涤细胞4次。如果需要，进行HoechstDNA染色(寿命技术，1:2500)和/或肌动蛋白染色(Dy647-Phalloidin，DyeOmics)。在有些情况下，在洗涤PFA之后仅直接施用DNA和/或肌动蛋白染色。将细胞在室温下孵育1小时，用PBS洗涤3次，并通过如下所述的自动图像分析进行分析。
自动显微镜和图像分析。使用ImageXpress Micro(Molecular devices，Sunnyvale，USA)自动获得图像。使用MetaXpress(Molecular devices，Sunnyvale，USA)进行抗-Myc染色强度的定量。手动选择除了核区域的细胞内的区域和含有细菌的区域(具有40个像素的面积的圆圈)并记录平均强度。
TNFa刺激和磷酸-p38的免疫印迹。如上所述，以100的MOI感染接种在6孔板中的HeLa细胞。30min后加入庆大霉素以及45分钟后加入TNFα(10ng/mL)。1小时15分钟后将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并加入磷酸安全裂解缓冲液(Novagen)以裂解细胞。在冰上温育后，将细胞离心(16000rcf，25min，4℃)。收集上清液并通过Bradford BCA测定法(Pierce)在SDS PAGE和免疫印迹之前使用anti-Phospho-p38、总p38抗体(Cell Signaling)和抗肌动蛋白抗体(Millipore)。
感染的HeLa细胞的cAMP水平测定。如上所述感染接种在96孔板中的HeLa细胞。在感染前30分钟，将cDMEM改变为补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺和100μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Sigma Aldrich)的DMEM。60min后，加入庆大霉素并将细胞在37℃下再温育90分钟。根据制造商的说明书(Amersham，cAMP Biotrak，RPN225)，使用竞争性ELISA进行cAMP的测定。作为阳性对照，向补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺和100μM IBMX的DMEM中向细胞中加入指定剂量的霍乱毒素(C8052，Sigma Aldrich)1小时。
斑马鱼胚胎感染、成像和自动图像定量。所有动物实验根据批准的指南进行。斑马鱼保持在标准条件下[52]。胚胎在28.5℃下按小时受精后(hpf)分期[53]。在本研究中使用以下斑马鱼系：野生型鱼(AB/EK和EK/TL)。感染方案遵循[54]中给出的指南。将12hpf胚胎保持在含有0.2mM N-苯基硫脲(PTU)的E3培养基中以防止色素形成。受精2天(dpi)的胚胎用0.2mg/mL三卡因麻醉并使用发环工具在E3中的1％琼脂板上对齐[54]。使小肠结肠炎耶尔森氏菌在补充有0.4％阿拉伯糖和抗生素的BHI和mDap中生长，并在室温下过夜，用含有0.5％阿拉伯糖和其他添加剂的新鲜BHI稀释至OD 600为0.2，在室温下生长2小时，然后温度转变为37℃水浴振荡45分钟。最后，通过离心(6000rcf，30秒)收集细菌，并用PBS洗涤一次。在含有mDAP的PBS中OD 600设定为2。使用Femtojet Microinjector(Eppendorf)使用Femtotips II(Eppendorf)将1-2nL的该悬浮液注射到对齐的斑马鱼胚胎的后脑中，其中针尖用细镊子折断。注射时间设置为0.2s，补偿压力为15hPa(Eppendorf，Femtojet)，注射压力调节在600和800hPa之间。通过显微镜检查和通过对照板检查液滴大小以及相应的接种物。显微注射后，将鱼收集在含有Tricaine和PTU的E3中，并在37℃孵育30分钟，并在28℃下孵育另外5小时。荧光双目(Leica)用于在斑马鱼后脑中感染后1小时观察细菌EGFP荧光，并且丢弃未正确注射的胚胎。在感染结束时，将鱼用2％冰冷的PFA在冰上固定1小时，然后在4℃下用新鲜冰冷的PFA固定过夜。如前所述进行抗体染色[55,56]。毫无疑问，胚胎用0.1％吐温PBS洗涤4次，每次洗涤5分钟，并在室温下用PBS-T+0.5％Triton X-100透化30分钟。将胚在封闭溶液(PBS 0.1％Tween 0.1％TritonX-100 5％山羊血清和1％BSA)中在4℃封闭过夜。将抗体(裂解的胱天蛋白酶-3(Asp 175)，Cell Signaling)在封闭溶液中以1:100稀释，并在4℃下在黑暗中振荡孵育。将鱼用0.1％吐温PBS洗涤7次，持续30分钟，然后加入在封闭溶液中稀释的二抗(山羊抗兔AF647，Invitrogen，1：500)，并在4℃温育过夜。将幼虫用0.1％Tween的PBS在4℃下洗涤4次，每次30分钟，并洗涤过夜，并进一步洗涤3-4次。使用40
通过CellProfiler[57]对记录的z-堆叠图像的最大强度z投影执行图像分析(对于pBad_Si2 n＝14或对于z-BIM n＝19)。简而言之，通过GFP通道检测细菌。围绕细菌斑点的每个区域创建具有10个像素的半径的圆。重叠区域在连接构件之间相等地分开。在紧密围绕细菌的那些区域中，测量Caspase 3 p17染色强度。
磷酸化蛋白的样品制备。对于每种条件，将HeLa CCL-2细胞的两个6孔板生长至汇合。如上所述感染细胞30分钟。在指定的时间点，将板置于冰上，用冰冷的PBS洗涤两次。然后将样品收集在脲溶液[8M尿素(AppliChem)、0.1M碳酸氢铵(Sigma)、0.1％RapiGest(Waters)、1xPhosSTOP(Roche)中。将样品短暂涡旋，在4℃(Hielscher)超声处理，在热混合器(Eppendorf)上振荡5分钟，并在4℃和16000g下离心20分钟。收集上清液并储存在-80℃用于进一步处理。使用BCA蛋白测定(Pierce)测量蛋白浓度。
磷酸肽富集。用终浓度为10mM的三(2-羧乙基)膦在37℃下将二硫键还原1小时。游离巯基用20mM碘乙酰胺(Sigma)在室温下在黑暗中烷基化30分钟。在室温下用N-乙酰半胱氨酸以终浓度25mM淬灭过量的碘乙酰胺10分钟。加入Lys-C内肽酶(Wako)至最终酶/蛋白质比例为1:200(w/w)，并在37℃温育4小时。随后将溶液用0.1M碳酸氢铵(Sigma)稀释至终浓度低于2M脲，并在37℃下用测序级修饰的胰蛋白酶(Promega)以50:1的蛋白质-酶比消化过夜。在C18 Sep-Pak柱(Waters)上脱盐并在真空下干燥。如前所述，从2mg总肽质量中用TiO2分离磷酸肽[58]。简言之，将干燥的肽溶解在用邻苯二甲酸饱和的80％乙腈(ACN)-2.5％三氟乙酸(TFA)溶液中。将肽加入到在封端的Mobicol离心柱(MoBiTec)中的相同量的平衡的TiO
LC-MS/MS分析。使用配备有内部填充了1.9μmC18树脂(Reprosil-AQ Pur，Dr.Maisch)的加热的RP-HPLC柱(75μm×45cm)的EASY nano-LC系统(Thermo FisherScientific)进行肽的色谱分离。使用从98％溶剂A(0.15％甲酸)和2％溶剂B(98％乙腈，2％水，0.15％甲酸)的线性梯度，每个LC-MS/MS运行分析1μg总磷酸肽样品的等分试样至30％溶剂B，历时120分钟，流速为200nl/min。在装备有纳米电喷雾离子源(均为ThermoFisher Scientific)的双压力LTQ-Orbitrap质谱仪上进行质谱分析。每个MSI扫描(在Orbitrap中获得)之后是20个最丰富的前体离子的碰撞诱导解离(CID，在LTQ中获得)，动态排除30秒。对于磷酸肽分析，10种最丰富的前体离子经受能够进行多级激活的CID。总循环时间约为2秒。对于MSI，在最大300ms的时间内在轨道阱电池中累积10 6个离子，并在60,000FWHM(400m/z)的分辨率下扫描。使用正常扫描模式，10 4离子的目标设置和25ms的累积时间获取MS2扫描。带有未分配电荷状态的单电荷离子和离子被排除触发MS2事件。归一化的碰撞能量设定为32％，并且对于每个光谱获得一个微量。无标记定量和数据库搜索。将获得的原始文件导入到Progenesis软件工具(Nonlinear Dynamics，版本4.0)中，以使用默认参数进行无标记定量。MS2光谱直接从Progenesis以mgf格式导出，并使用MASCOT算法(Matrix Science，Version 2.4)针对包含智人的预测SwissProt条目的正向和反向序列的诱骗数据库[59]进行搜索(www.ebi.ac。uk，发布日期16/05/2012)和使用来自MaxQuant软件(版本1.0.13.13)的SequenceReverser工具产生的常见的污染物(总共41,250个序列)。为了鉴定源自小肠结肠炎耶尔森氏菌的蛋白质，针对上述相同数据库搜索非磷酸肽富集的样品，包括预期的肠道沙门氏菌的SwissProt条目(www.ebi.ac.uk，发布日期15/08/2013)前体离子耐受性设定为10ppm，并且将碎片离子耐受性设定为0.6Da。搜索标准设置如下：需要完全胰蛋白酶特异性(在赖氨酸或精氨酸残基之后切割，除非随后是脯氨酸)，允许2次错过切割，将脲基甲基化(C)设定为固定修饰，并将磷酸化(S，T，Y)或氧化(M)分别作为富集TiO 2或未富集样品的可变修饰。最后，数据库搜索结果导出为xmL文件，并导入回到Progenesis软件以进行MSI功能分配。对于磷酸肽定量，输出包含所有检测到的特征的MSI峰丰度的csv文件，并且对于未富集的样品，创建包含基于每种蛋白质的所有鉴定的肽的总和特征强度的所有蛋白质测量的csv文件。重要的是，Progenesis软件设定由相似组的肽识别的蛋白质被分组在一起，并且仅数据库中具有用于单个蛋白质的特定序列的非冲突肽被用于蛋白质定量。使用内部开发的SafeQuant v1.O R脚本(未发布的数据，可从https://github.com/eahrne/SafeQuant/获得)进一步处理这两个文件。简而言之，软件将识别水平假发现率设置为1％(基于诱饵蛋白序列数据库命中的数量)，并且归一化所有样品中鉴定的MS 1峰丰度(提取的离子色谱图，XIC)，即总和XIC的所有确信识别的肽特征被缩放为对于所有LC-MS运行相等。接下来，基于每个时间点的中值XIC，为每个时间点分配所有定量的磷酸肽/蛋白质的丰度比。每个比率的统计显着性由其q值(假发现率调整的p值)给出，通过计算修正的t统计p值[60]和调整多重测试[61]获得。MASCOT自动分配磷酸化残基的位置(得分>10)。所有注释的光谱以及所用的MS原始文件和搜索参数将通过PRIDE合作伙伴库[62]保存到ProteomeXchange Consortium(http：//proteomecentral.proteomexchange。org)。
序列比对使用基于EMBL-EBI web的ClustalW2多序列比对工具在http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/进行。
B)结果
基于YopE融合蛋白的3型分泌的蛋白质递送系统
虽然肠道粘杆菌T3SS效应子YopE(SEQ ID No.1)的N-末端含有足以使异源蛋白质转运的分泌信号[10]，但其伴侣蛋白(SycE)的伴侣结合位点(CBS)不包括在内[63]。我们选择YopE(SEQ ID No.2)的N-末端138个氨基酸与待递送的蛋白质融合，因为已经显示其对于其他异源T3S底物的递送提供最佳结果[38]。由于YopE的这些N-末端138个氨基酸含有CBS，我们进一步决定共表达SycE。从纯化的小肠结肠炎耶尔森氏菌pYV40毒力质粒克隆的SycE-YopE
仔细选择背景应变。首先，为了限制内源效应子的转运，我们使用了对所有已知效应物Yop H，O，P，E，M和T(命名为ΔΗΟΡΕΜΤ)删除的肠道沙门氏菌菌株。此外，我们使用的营养缺陷突变体不能在外源性内消旋-2,6-二氨基庚二酸不存在下生长[65]。该菌株缺失天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(Aasd)，并由瑞士安全机构归类为生物安全水平1(对AO10088/2的修改)。此外，我们删除粘附蛋白YadA和/或InvA，以提供更大的背景菌株的选择。虽然使用yadA或yadA /invA菌株减少背景信号诱导[66]，所传递的蛋白质量也受到影响[67]。
YopE融合蛋白递送到真核细胞中的表征
在体外分泌测定(参见图1A)中，人工诱导蛋白分泌到周围液体中。在基于TCA的蛋白质沉淀后，使用抗YopE抗体的免疫印迹分析来确定分泌的蛋白质量(图1B)。虽然wt菌株分泌全长YopE，但AHOPEMT asd菌株没有。在存在YopE
T3SS递送蛋白质到细胞核的重定向由于YopE本身定位于细胞质(图2A)，测试YopE
去除融合蛋白转运到真核细胞后的YopE
而对于细菌递送，YopE
对YopE片段的TEV蛋白酶依赖性切割的替代方法包括将泛素掺入感兴趣的融合蛋白中。实际上，泛素在其C-末端由一组内源性泛素特异性C末端蛋白酶(去泛素化酶，DUB)加工。由于切割假定发生在泛素的C-末端(在G76之后)，目标蛋白应该不含额外的氨基酸序列。该方法在YopE1-138-泛素-Flag-INK4C-MycHis融合蛋白上测试。在受表达YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis的细菌感染的对照细胞中，发现对应于YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis的条带，指示融合蛋白的有效转运(图24)。当细胞用YopE1-138-泛素-Flag-INK4C-MycHis-表达细菌感染1小时时，可以看到对应于Flag-INK4C-MycHis大小的另外的条带，表明融合蛋白的一部分被切割。该结果显示，将泛素导入融合蛋白使得能够切割YopE1-138片段而不需要外源蛋白酶。
III型和IV型细菌效应子的转运
来自沙门氏菌的SopE是一种良好表征的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)，它与Cdc42相互作用，促进肌动蛋白细胞骨架重塑[79]。鉴于YopE
在沙门氏菌感染期间，SopE转运之后是SptP的转运，其作为Cdc42的GTP酶活化蛋白(GAP)[81]。尽管单独的YopE
S.flexneri III型效应物OspF作为磷酸苏氨酸裂解酶，使MAP激酶p38和ER去磷酸化[82]。为了测试转运的YopE
在沙门氏菌感染期间，III型效应物SopB通过Akt的持续活化来保护上皮细胞免于凋亡[83]。尽管YopE
许多细菌，包括根癌土壤杆菌、嗜肺军团杆菌和汉赛巴尔通体，使用IV型分泌以将效应物注入细胞中。我们测试了使用我们的工具是否可以将来自henselae的IV型效应物BepA转运到HeLa细胞中。克隆含有C-末端Bid结构域的全长BepA(SEQ ID No.10)和BepAE305-end(SEQ ID No.11)，并用相应的菌株感染细胞。由于BepA显示诱导环AMP(cAMP)的产生[84]，在感染后测量HeLa细胞中cAMP的水平。尽管汉密氏酵母效应物BepG(SEQ IDNo.136)的Bid结构域的转运不能诱导cAMP、全长BepA和BepAE305末端触发的预期量的cAMP产生[84](图6C)。该结果表明，IV型效应物也可以通过基于YopE1-138的递送系统有效地递送到宿主细胞靶中，并且它们是功能性的。
真核蛋白转移到上皮细胞中
为了表明人蛋白质可以通过III型分泌递送，我们融合人细胞凋亡诱导剂用于由肠道沙门氏菌递送至YopE
我们进一步将鼠tBID(针对小肠结肠炎耶尔森氏菌的密码子优化；SEQ IDNo.194)或小鼠tBID或小鼠BAX的BH3结构域(在这两种情况下针对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行密码子优化；SEQ ID No.138和139)融合至YopE
然而用肠炎沙门氏菌(S.enterica)aroA细菌感染4小时不能诱导细胞凋亡，小鼠tBID的递送引发细胞凋亡，因为小鼠tBID的递送导致CASP3p17亚基产生(图20和21)。当使用Spil T3SS诱导条件(图20)时，SopE融合蛋白的细胞凋亡诱导程度更大，这反映了SopE排他地由Spil T3SS递送。SteA 1-20融合的鼠tBID不能诱导凋亡，非常可能是因为SteA的20个N-末端氨基酸内的分泌信号不足以允许递送融合蛋白(图20和21)。与全长SteA融合的小鼠tBID在Spil和Spill T3SS诱导条件下导致HeLa细胞中凋亡诱导(图20和21)，反映了SteA由T3SS两者递送的能力。必须注意的是，即使在溢出T3SS诱导条件下，Spil T3SS的部分活性也被期望，如在Spill T3SS诱导条件下SopE融合蛋白的活性所见(图21)。
除了这里功能上详细阐述的转运真核蛋白，使用这里描述的工具分泌了几种其他真核蛋白。这包括用于递送小肠结肠炎耶尔森氏菌蛋白的来自细胞周期调节(Mad2(SEQ IDNo.15)、CDK1(SEQ ID No.14)、INK4A(SEQ ID No.16)、INK4B(SEQ ID No.17)和INK4C(SEQID No.18))及其部件(INK4A 84-103(SEQ ID No.158)、p107 657-662(SEQ ID No.159)、p21 141 -160(SEQ ID No.160)、p21145-160(SEQ ID No.161)、p2117-33(SEQ ID No.162)和细胞周期蛋白D2 139-147(SEQ ID No 163))、凋亡相关蛋白(Bad(SEQ ID No.29)、FADD(SEQ ID No.28)和Caspase 3p17(SEQ ID No.22)和p12(SEQ ID No.23)、zebrafish Bid(SEQ ID No.19)(SEQ ID No.13)、Bax BH3(SEQ ID No.139))，信号传导蛋白(鼠TRAF6(SEQID No.12))和其部件(tBid BH3、TIFA(SEQ ID No.13))、GPCR Ga亚基(GNA12，最短同种型，(SEQ ID No.30))、纳米抗体(vhhGFP4，(SEQ ID No.31))和纳米抗体融合构建体(图13和14)以及小的GTP酶(Rac1 Q61E(SEQ ID No.26和137)和RhoA Q63L(SEQ ID No.12))(SEQID No.32,33,34)[87]27)和来自人Akt的Pleckstrin同源结构域(SEQ ID No.35)。除了功能上详尽的凋亡相关蛋白(鼠tBid，SEQ ID No.144-147)之外，这还包括由肠杆菌递送(图22)来自细胞周期调节的蛋白质(Mad2(SEQ ID No.168-169)、CDK1(SEQ ID No.170-171)、INK4A(SEQ ID No.164-165)和INK4C(SEQ ID No.166-167))。虽然这些蛋白质没有被功能验证，但是T3SS依赖分泌的多种真核蛋白与可能删除YopE附录结合的可能性开放了T3SS在细胞生物学的广泛适用性的新观点。
在斑马鱼胚胎中截断的Bid的体内转运诱导凋亡
这种细菌工具的一个有趣的特点是活动物的潜在用途。斑马鱼在其胚胎状态可以保持透明允许荧光染色和显微镜[54,88,89]。已经详细描述了几种斑马鱼凋亡诱导剂，其中z-BIM是最有效的[90]。因此，我们决定将z-BIM克隆到我们的系统中。即使与人BIM弱同源，我们测定人上皮细胞中YopE
磷蛋白组学揭示转运蛋白质对蛋白质磷酸化的全局影响
磷酸化是广泛的翻译后修饰，其可以激活或灭活生物过程，因此是研究信号传导事件的合适靶标[91，92]。尽管如此，目前还没有系统级分析细胞凋亡中的磷酸化。为了分析递送到HeLa细胞中的人tBid的影响，我们通过LC-MS/MS使用无标记的磷蛋白体方法。在三个独立实验中，将细胞保留未处理，用AHOPEMT asd+YopE1-138-Myc或用AHOPEMT asd+YopE1-138-tBid感染30分钟。裂解细胞，随后进行酶消化，磷酸肽的富集和单个磷肽的定量和鉴定。我们将用ΔΗΟΡΕΜΤasd+YopE1-138-Myc感染的细胞与用ΔΗΟΡΕΜΤasd+YopE1-138-tBid感染的细胞进行比较，从而允许我们鉴定363个tBid依赖性磷酸化事件。286个磷酸肽显示磷酸化增加，而77个在tBid递送时磷酸化较少，对应于243种不同的蛋白质，我们定义为tBid磷酸化蛋白质。STRING数据库用于创建tBid磷酸化蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用网络[93](图9A)。另外，已知与线粒体凋亡相关的27种蛋白质被添加到网络，构建中心簇。有趣的是，只有来自tBid磷酸化蛋白质的少数蛋白质连接到该中心簇，表明许多蛋白质经历磷酸化的变化，其迄今未直接与凋亡蛋白相关。为了表征tBid磷酸化蛋白质所涵盖的生物功能，我们使用用于注释，可视化和综合发现的数据库的功能注释工具(DAVID，http://david.abcc.ncifcrf.gov/)进行了基因本体论分析[94，95]。鉴定的生物学功能显示不同的细胞过程受tBid影响。参与染色质重排和转录调节的许多蛋白质经历磷酸化的改变(即CBX3，CBX5，TRIM28，HDAC1)。HDAC1例如是在转录调节中起作用的组蛋白脱乙酰酶。已经显示HDAC1可以调节NF-kB的转录活性，NF-kB是也参与凋亡的蛋白质。我们另外确定了一个参与RNA加工的蛋白质簇，以前已经表明它在调节细胞凋亡中发挥重要作用[96]。FINRPK例如介导p53/TP53对DNA损伤的反应，并且是诱导凋亡所必需的[97]。此外，参与蛋白质翻译的蛋白质的磷酸化也受影响。几种真核起始因子(即EIF4E2、EIF4B、EIF3A、EIF4G2)经历磷酸化的变化，这与凋亡细胞中整体蛋白质合成减少的观察一致。有趣的是，参与细胞骨架重塑的许多蛋白质(例如PXN，MAP1B9)的磷酸化在tBid递送时被改变，这与细胞形态在tBid递送时显着改变的观察一致(图9B)。细胞收缩和损失接触反映在事实上，我们观察到粘附相关蛋白质如Z02和Paxillin的磷酸化。类似地，核的收缩伴随层状蛋白如LaminA/C和Lamin B1的磷酸化。总而言之，tBID递送诱导快速凋亡反应由线粒体完整性的破裂表示(图9B)，我们发现tBid诱导的细胞凋亡影响参与不同细胞过程的数百个磷酸化事件。虽然许多已鉴定的蛋白质与凋亡有关，但是已知仅有少数已知在凋亡时被磷酸化磷酸化蛋白质方法因此为进一步研究凋亡提供了有用的资源。
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- 基于细菌的蛋白质递送
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