基于生物标记的用于蛋白酶体抑制剂治疗的患者选择

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年6月17日提交的美国临时专利申请第63/040,442号的权益，将其全文通过引用并入本文。

关于联邦赞助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的CA243440和GM115174号的政府资助下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

肿瘤抑制基因PTEN是人类癌症中最常见的缺失基因之一(1)。PTEN缺失通常涵盖染色体10q23上许多千碱基(kb)的邻近DNA，包括相邻基因座。与PTEN最接近的基因之一是ATAD1，其编码参与线粒体外膜(OMM)上的蛋白质质量控制的AAA+ATP酶(2-6)。ATAD1对于人和小鼠的生命是必需的，并且它在分离酵母和人的1 0亿年的进化中是保守的(6，7)。本文描述了ATAD1与PTEN的共缺失如何使细胞对泛素蛋白酶体系统(UPS)的功能障碍敏感。ATAD1直接从OMM中提取促细胞凋亡蛋白BIM，证明蛋白质质量控制如何与临床相关环境中的细胞死亡相互作用。

发明内容

本文公开了任何方法或组合物。

公开了治疗患有癌症的受试者的方法，其包含向患有癌症的受试者施用蛋白酶体抑制剂，其中患有癌症的受试者具有非功能性ATAD1基因。

公开了诊断和治疗癌症的方法，所述方法包含：诊断受试者对蛋白酶体抑制剂的治疗具有敏感性；以及向受试者施用蛋白酶体抑制剂。

所公开的方法和组合物的另外的优点将在以下描述中部分地阐述，并且将部分地从描述中理解，或者可以通过所公开的方法和组合物的实践来获知。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，前面的一般描述和以下详细描述都仅仅是示范性和解释性的，并不限制所要求保护的本发明。

附图说明

并入本说明书并构成其一部分的附图绘示了所公开的方法和组合物的一些实施例，并与说明书一起用于解释所公开的方法和组合物的原理。

图1A至1E显示了在各种癌症中ATAD1作为乘客基因经常与PTEN共缺失。(A)人Chr10q23.31上的ATAD1和PTEN基因座的示意图(B)评估PTEN-null前列腺癌患者中IHC的ATAD1丢失(C)来自两名PTEN-null肿瘤患者的代表性组织学和IHC(D)TCGA Oncoprint显示了ATAD1和PTEN的共缺失，且仅ATAD1缺乏突变(E)TCGA各种癌症中ATAD1的改变频率。

图2A至2G显示了全基因组CRISPR筛选鉴定与ATAD1的遗传相互作用(A)CRISPR筛选策略的示意图(B)Jurkat细胞的PTEN-null遗传背景中克隆ATAD1敲除的生成和RPMI1640培养基中ATAD1Δ和WT Jurkat细胞的增殖率(C)CRISPR筛选结果的火山图；CRISPR评分被定义为靶向给定基因的sgRNA的平均Log

图3A至3I显示了ATAD1通过从膜直接提取BIM来保护细胞免受BIM介导的细胞凋亡引发(A)线粒体外膜透性(MOMP)的BCL2家族对照的简化示意图；参见图S3A关于BCL2家族蛋白的结合偏好(B)使用具有EV、催化死亡的ATAD1

图4A至4K显示了ATAD1保护细胞免受蛋白酶体功能障碍诱导的细胞凋亡。(A)用EV或ATAD1-FLAG转导并用指定药物处理24小时的SW1088细胞的活力(B)SW1088细胞中响应于硼替佐米处理的活力的时间进程(C)用10nM硼替佐米处理8小时的RPMI7951全细胞裂解物的蛋白质印迹(D)C的量化(E)响应于用BTZ和泛半胱天冬酶抑制剂zVAD-FMK(20μM)或DMSO(zVAD载体)处理16小时，ATAD1-null与再表达RPMI7951细胞的活力(F)与E相同，但通过结晶紫染色测量活力并在(G)中量化。(H)描述ATAD1在蛋白酶体抑制剂毒性中的作用的示意图(I)NOD/SCID小鼠中SW1088细胞的皮下异种移植物的肿瘤大小随时间的变化(J)可触知肿瘤的发生率或无肿瘤存活率随时间的变化(K)用结晶紫染色测量的培养的SW1088细胞的增殖，n＝2个独立实验。

图5显示了ATAD1和PTEN IHC在来自1 5名患有PTEN阳性肿瘤的患者的活组织检查上进行，并且ATAD1在所有(PTEN阳性)样品中是可检测的。

图6A至6C显示了用于与ATAD1遗传相互作用的全基因组CRISPR筛选。(A)每个克隆细胞系相对于WT的差异CRISPR评分，彼此相对绘制。皮尔逊系数＝0.51，P＝2.16×10-16。(B)靶向MARCH5的每个sgRNA的差异倍数变化的sgRNA水平数据(C)与ACOT11的B相同

图7A至7E显示了(A)BH3肽和BH3模拟小分子的结合模式，其与图3B中的BH3-剖析实验相关；来源于Letai，《自然综述癌症(Ann Rev Cancer)》，2017年，和Kale等人，《细胞死亡和分化(Cell Death Diff)》，2018年(B)稳定表达Tet-ON GFP-BIMEL的BAK1Δ和BAK1ΔATAD1Δ细胞系的全细胞裂解物中BIM同种型的蛋白质印迹的量化。“GFP-BIMEL”表示异位融合蛋白，而“BIMEL”和“BIML”是内源性的。收获前用250ng/mL多西环素处理细胞24小时。n＝3个独立实验(C)可溶性His-Msp1和全长Msp1(D)从蛋白脂质体中提取BIML。(E)提取测定概括了Msp1的生理底物选择性。当在TMD的N末端插入残基的疏水片(“Fis1-片”)时，提取Fis1。Sec22和Sec61b是阳性对照，证明Msp1可识别ER-天然TA蛋白。

图8A至8I显示了在Del(10q23)细胞中恢复ATAD1表达增加了对蛋白酶体抑制剂的抗性。(A)用硼替佐米或卡非佐米处理RPMI7951细胞16小时，并通过细胞滴度Glo测量活力。(B)用硼替佐米(3.125nM)处理的RPMI7951细胞的时间进程n＝3个生物重复(C)将SW1088细胞在5nM硼替佐米中培养48小时并将RPMI7951细胞培养24小时，并通过结晶紫染色评估活力(D)将H4细胞用硼替佐米处理24小时并通过细胞滴度Glo进行评估(E)ATAD1回加拯救SW1088细胞中响应于硼替佐米的线粒体形态表型。用BTZ(10nM)处理细胞12小时，用MitoTracker Red染色，然后在宽视野荧光显微镜上成像(F)ATAD1在DepMap细胞系中的表达，突出显示PC3细胞(ATAD1半合子)和两个Del10q23细胞系(G)使用稳定表达的sgATAD1(在LCv2G中)生成ATAD1缺陷的多克隆PC3细胞，非靶向的Cas9仅作为对照(LCv2G)(H)ATAD1的缺失增加了PC3细胞对硼替佐米的敏感性。(I)ATAD1WT而非ATAD1E193Q的过表达增加了对硼替佐米的抗性。

具体实施方式

通过参考以下具体实施例和其中所包括的实例的详细描述以及附图及其先前和以下描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。

应当理解，除非另有说明，所公开的方法和组合物不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特定的试剂，并且因此可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并不旨在进行限制。

公开了可用于、可结合使用、可用于制备或为所公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。本文公开了这些和其它材料，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然不能明确公开这些化合物的每种不同的单独和集合组合和排列的具体参考，但本文具体考虑和描述了每种。因此，如果公开了一类分子化合物A、B和C以及公开了一类分子D、E和F以及组合分子A-D的实例，则即使没有单独地列举每一个，也可以单独和共同考虑每一个。因此，在该实例中，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一个都是特别考虑的，并且应该被认为是从A、B和C；D、E和F；和实例组合A-D的公开内容中公开的。同样，这些的任何子集或组合也是特别考虑和公开的。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子组是特别考虑的，并且应该被认为是从A、B和C；D、E和F；和实例组合A-D的公开内容中公开的。这一概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有多种可以执行的附加步骤，则应当理解这些附加步骤中的每一个都可以用所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行，并且每一个此类组合都是特别考虑的，并且应该被认为是公开的。

A.定义

应当理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施例，而不是为了限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求来限定。

必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a、an和the)”包括复数指代，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“受试者”包括多个此类受试者，提及“蛋白酶体抑制剂”是指一种或多种蛋白酶体抑制剂及其本领域技术人员已知的等同物，等等。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”可以互换使用，并且是指可以施用本发明组合物的任何生物体，例如用于实验、诊断和/或治疗目的。典型的受试者包括动物(例如哺乳动物如非人灵长类动物和人；禽类；家养或农场动物，如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验动物如小鼠、大鼠和豚鼠；兔子；鱼；爬行动物；动物园和野生动物)。通常，“受试者”是动物，包括哺乳动物如人和灵长类等。

“治疗”是指向受试者，如人或其它哺乳动物(例如动物模型)，施用治疗剂如蛋白酶体抑制剂，受试者对发展癌症具有增加的具有敏感性，以预防或延迟疾病或病症的作用的恶化，或部分或完全逆转疾病或病症(例如癌症)的影响。

“预防”是指使对发展癌症具有增加的具有敏感性的受试者的机会最小化。

如本文所用，术语“施用”是指向受试者提供治疗剂(如蛋白酶体抑制剂)的任何方法。此类方法是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于：口服施用、透皮施用、吸入施用、鼻内施用、局部施用、阴道内施用、眼部施用、耳内施用、脑内施用、直肠施用、舌下施用、口腔施用和肠胃外施用，包括可注射的如静脉内施用、动脉内施用、肌内施用和皮下施用。施用可以是连续的或间歇的。在各个方面，可治疗性地施用制剂；即，施用以治疗现有的疾病或病症。在进一步的各个方面，可预防性地施用制剂；即，施用用于预防疾病或病症。在一个方面，本领域技术人员可以确定有效剂量、有效时间表或有效施用途径以治疗受试者。

如本文所用，“生物样品”是指可来自或源自哺乳动物，特别是人类患者的任何样品，例如来自患者的体液(血液、唾液、尿液等)、活检、组织和/或废物。因此，组织活检、粪便、痰、唾液、血液、血浆、血清、淋巴、眼泪、汗液、尿液、阴道分泌物等可以容易地筛选SNP，基本上任何含有合适核酸的目标组织都可以。这些样品通常在知情同意后通过标准医学实验室方法从患者取得。样品可以是直接取自患者的形式，或者可以至少部分处理(纯化)以去除至少一些非核酸物质。

如本文所用，“调节”意指通过增加或减少来改变。调节可意指活性或功能或数量的变化。变化可以是活性、功能或数量的增加或减少、增强或抑制。

“任选的”或“任选地”意指后续描述的事件、情况或材料可能发生或可能不发生或存在，并且该描述包括事件、情况或材料发生或存在的情况，以及它不发生或不存在的情况。

范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。当表达此类范围时，除非上下文另外明确指出，还明确预期和考虑公开了从一个特定值和/或到另一个特定值的范围。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成了另一个具体预期的实施例，除非上下文另外明确指出，否则该实施例应被认为是公开的。进一步应当理解，范围中的每一个端点相对于另一个端点和独立于另一个端点都是重要的，除非上下文除非上下文特别指出。最后，应当理解，包含在明确公开的范围内的所有单个值和值的子范围也被具体考虑，并且应当被认为是公开的，除非上下文特别指出。不管在特定情况下是否明确公开了这些实施例中的一些或全部，上述内容都适用。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本方法和组合物的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的任何方法和材料，但是特别有用的方法、装置和材料如所述。本文引用的出版物和它们所引用的材料特此通过引用并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权借助先前发明而早于此类公开。没有承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述了其作者所声称的内容，并且申请人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应当清楚地理解，尽管本文参考了许多出版物，但是此类参考并不构成承认这些文献中的任何一个构成本领域公知常识的一部分。

在本说明书的整个说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”和该词语的变体，例如“comprising”和“comprises”，意指着“包括但不限于”，并且不旨在排除例如其它添加剂、成分、整体或步骤。特别地，在被描述为包括一个或多个步骤或操作的方法中，预期每个步骤包括所列出的内容(除非该步骤包括如“由…组成”的限制性术语)，意指每个步骤不旨在排除例如未在步骤中列出的其它添加剂、组分、整体或步骤。

B.治疗方法

公开了治疗患有癌症的受试者的方法，其包含向患有癌症的受试者施用蛋白酶体抑制剂，其中患有癌症的受试者具有非功能性ATAD1。公开了治疗患有癌症的受试者的方法，其包含向患有癌症的受试者施用调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂，其中患有癌症的受试者具有非功能性ATAD1。在一些方面，非功能性ATAD1包括非功能性ATAD1基因或非功能性ATAD1蛋白。

在一些方面，非功能性ATAD1基因可以是缺失的基因或突变的基因。在一些方面，非功能性ATAD1基因可以部分或完全缺失。在一些方面，非功能性ATAD1蛋白可以是从非功能性ATAD1基因翻译的蛋白质。在一些方面，非功能性ATAD1蛋白可以被翻译为功能性蛋白，并且然后翻译后修饰为非功能性ATAD1蛋白。

在一些方面，受试者进一步包含非功能性PTEN。在一些方面，非功能性PTEN可以是非功能性PTEN基因或非功能性PTEN蛋白质。非功能性PTEN基因可以是缺失基因或突变基因。在一些方面，非功能性PTEN基因可以部分或完全缺失。在一些方面，非功能性PTEN蛋白质可以是从非功能性PTEN基因翻译的蛋白质。在一些方面，非功能性PTEN蛋白可被翻译为功能性蛋白质，并且然后翻译后修饰为非功能性PTEN蛋白质。

在一些方面，患有癌症的受试者患有乳腺癌、肺癌、结肠癌、脑癌或前列腺癌。

在一些方面，蛋白酶体抑制剂可以是但不限于硼替佐米、伊沙佐米、卡非佐米、乳胞素、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、马里佐米(Marizomib/salinosporamideA)、奥泼佐米、地兰佐米、艾泼米辛、MG132、β-羟基β-丁酸甲酯。

在一些方面，调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂可以是但不限于IRE1调节剂、PERK调节剂、ATF6调节剂、热休克蛋白抑制剂、选择性雄激素受体降解剂或选择性雌激素受体降解剂。

C.诊断和治疗方法

公开了诊断和治疗受试者癌症的方法，该方法包含诊断受试者对蛋白酶体抑制剂的治疗具有敏感性；以及向受试者施用蛋白酶体抑制剂。

公开了诊断和治疗受试者癌症的方法，该方法包含诊断受试者对蛋白酶体抑制剂的治疗有反应；以及向受试者施用蛋白酶体抑制剂。

在一些方面，诊断受试者对蛋白酶体抑制剂的治疗具有敏感性包含鉴定受试者具有非功能性ATAD1。在一些方面，诊断受试者对蛋白酶体抑制剂的治疗有反应包含鉴定受试者具有非功能性ATAD1。

在一些方面，非功能性ATAD1可以是非功能性ATAD1基因或非功能性ATAD1蛋白质。非功能性ATAD1基因可以是缺失基因或突变基因。在一些方面，非功能性ATAD1基因可以部分或完全缺失。在一些方面，非功能性ATAD1蛋白可以是从非功能性ATAD1基因翻译的蛋白质。在一些方面，非功能性ATAD1蛋白可以被翻译为功能性蛋白，并且然后翻译后修饰为非功能性ATAD1蛋白。

在一些方面，诊断受试者对蛋白酶体抑制剂的治疗具有敏感性进一步包含鉴定受试者是否具有功能性PTEN。在一些方面，诊断受试者对蛋白酶体抑制剂的治疗有反应进一步包含鉴定受试者是否具有功能性PTEN。在一些方面，非功能性PTEN可以是非功能性PTEN基因或非功能性PTEN蛋白质。非功能性PTEN基因可以是缺失基因或突变基因。在一些方面，非功能性PTEN基因可以部分或完全缺失。在一些方面，非功能性PTEN蛋白质可以是从非功能性PTEN基因翻译的蛋白质。在一些方面，非功能性PTEN蛋白可被翻译为功能性蛋白质，并且然后翻译后修饰为非功能性PTEN蛋白质。

在一些方面，诊断受试者对蛋白酶体抑制剂治疗具有敏感性进一步包含检测BIM水平的增加。在一些方面，诊断受试者对蛋白酶体抑制剂的治疗有反应进一步包含检测BIM水平的增加。在一些方面，BIM被理解为ATAD1的底物，并且因此非功能性ATAD1导致BIM的增加。在一些方面，BIM水平的增加是与标准相比的增加。在一些方面，标准可以是已知在具有功能性ATAD1的受试者中发生的BIM的正常或已知水平。在一些方面，标准可以是被确定为具有功能性ATAD1的一组受试者的平均值的量。

在一些方面，受试者患有乳腺癌、肺癌、结肠癌、脑癌或前列腺癌。

在一些方面，蛋白酶体抑制剂可以是但不限于硼替佐米、伊沙佐米、卡非佐米、乳胞素、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、马里佐米(Marizomib/salinosporamideA)、奥泼佐米、地兰佐米、艾泼米辛、MG132、β-羟基β-丁酸甲酯。

D.增加细胞凋亡的方法

公开了增加受试者细胞凋亡的方法，其包含向受试者施用蛋白酶体抑制剂，其中该受试者包含非功能性ATAD1。在一些方面，非功能性ATAD1可以是非功能性ATAD1基因或非功能性ATAD1蛋白质。非功能性ATAD1基因可以是缺失基因或突变基因。在一些方面，非功能性ATAD1基因可以部分或完全缺失。在一些方面，非功能性ATAD1蛋白可以是从非功能性ATAD1基因翻译的蛋白质。在一些方面，非功能性ATAD1蛋白可以被翻译为功能性蛋白，并且然后翻译后修饰为非功能性ATAD1蛋白。

在一些方面，受试者进一步包含非功能性PTEN。在一些方面，非功能性PTEN可以是非功能性PTEN基因或非功能性PTEN蛋白质。非功能性PTEN基因可以是缺失基因或突变基因。在一些方面，非功能性PTEN基因可以部分或完全缺失。在一些方面，非功能性PTEN蛋白质可以是从非功能性PTEN基因翻译的蛋白质。在一些方面，非功能性PTEN蛋白可被翻译为功能性蛋白质，并且然后翻译后修饰为非功能性PTEN蛋白质。

在某些方面，受试者患有癌症。在一些方面，受试者患有乳腺癌、肺癌、结肠癌、脑癌或前列腺癌。

在一些方面，蛋白酶体抑制剂可以是但不限于硼替佐米、伊沙佐米、卡非佐米、乳胞素、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、马里佐米(Marizomib/salinosporamideA)、奥泼佐米、地兰佐米、艾泼米辛、MG132、β-羟基β-丁酸甲酯。

E.鉴定受试者的方法

公开了包含以下顺序的步骤的方法：从癌症患者获得样品；确定癌症患者在样品中是否具有非功能性ATAD1；如果癌症患者具有非功能性ATAD1，则将癌症患者鉴定为用蛋白酶体抑制剂治疗的合适候选者；以及向被鉴定为合适候选者的癌症患者施用蛋白酶体抑制剂，并且如果癌症患者不具有非功能性ATAD1，则不向癌症患者施用蛋白酶体抑制剂。

公开了包含以下顺序的步骤的方法：确定癌症患者在从癌症患者获得的样品中是否具有非功能性ATAD1；如果癌症患者具有非功能性ATAD1，则将癌症患者鉴定为用蛋白酶体抑制剂治疗的合适候选者；以及向被鉴定为合适候选者的癌症患者施用蛋白酶体抑制剂，并且如果癌症患者不具有非功能性ATAD1，则不向癌症患者施用蛋白酶体抑制剂。

公开了包含以下顺序的步骤的方法：从癌症患者获得样品；确定癌症患者在样品中是否具有非功能性ATAD1；如果癌症患者具有非功能性ATAD1，则将癌症患者鉴定为用调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂治疗的合适候选者；以及如果癌症患者不具有非功能性ATAD1，则向被鉴定为合适候选者的癌症患者施用调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂，而不向癌症患者施用调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂。

公开了包含以下顺序的步骤的方法：确定癌症患者在从癌症患者获得的样品中是否具有非功能性ATAD1；如果受试者具有非功能性ATAD1，则将癌症患者鉴定为用调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂治疗的合适候选者；以及如果癌症患者不具有非功能性ATAD1，则向被鉴定为合适候选者的癌症患者施用调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂，而不向癌症患者施用调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂。

在一些方面，非功能性ATAD1基因可以是缺失的基因或突变的基因。在一些方面，非功能性ATAD1基因可以部分或完全缺失。在一些方面，非功能性ATAD1蛋白可以是从非功能性ATAD1基因翻译的蛋白质。在一些方面，非功能性ATAD1蛋白可以被翻译为功能性蛋白，并且然后翻译后修饰为非功能性ATAD1蛋白。

在一些方面，该方法进一步包含确定癌症患者是否具有非功能性PTEN。在一些方面，非功能性PTEN可以是非功能性PTEN基因或非功能性PTEN蛋白质。非功能性PTEN基因可以是缺失基因或突变基因。在一些方面，非功能性PTEN基因可以部分或完全缺失。在一些方面，非功能性PTEN蛋白质可以是从非功能性PTEN基因翻译的蛋白质。在一些方面，非功能性PTEN蛋白可被翻译为功能性蛋白质，并且然后翻译后修饰为非功能性PTEN蛋白质。

还公开了增强蛋白酶体抑制剂在患有癌症的受试者中的功效的方法，该方法包含向患有非功能性ATAD1的受试者施用对受试者有效量的蛋白酶体抑制剂。还公开了在患有癌症的受试者中增强调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂的功效的方法，该方法包含向患有非功能性ATAD1的受试者施用对受试者有效量的调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂。在一些方面，非功能性ATAD1基因可以是缺失的基因或突变的基因。在一些方面，非功能性ATAD1基因可以部分或完全缺失。在一些方面，非功能性ATAD1蛋白可以是从非功能性ATAD1基因翻译的蛋白质。在一些方面，非功能性ATAD1蛋白可以被翻译为功能性蛋白，并且然后翻译后修饰为非功能性ATAD1蛋白。在一些方面，受试者进一步包含非功能性PTEN。在一些方面，非功能性PTEN可以是非功能性PTEN基因或非功能性PTEN蛋白质。非功能性PTEN基因可以是缺失基因或突变基因。在一些方面，非功能性PTEN基因可以部分或完全缺失。在一些方面，非功能性PTEN蛋白质可以是从非功能性PTEN基因翻译的蛋白质。在一些方面，非功能性PTEN蛋白可被翻译为功能性蛋白质，并且然后翻译后修饰为非功能性PTEN蛋白质。

在一些方面，癌症患者患有乳腺癌、肺癌、结肠癌、脑癌或前列腺癌。

本文描述了鉴定适合于临床试验的受试者的方法，其包含确定受试者中非功能性ATAD1基因的存在，其中非功能性ATAD1的存在表明受试者适合于用蛋白酶体抑制剂治疗的临床试验。“适于临床试验”是指受试者可能从临床试验的治疗中受益。例如，被鉴定为具有非功能性ATAD1的受试者可以被认为需要治疗，对蛋白酶体抑制剂的治疗有反应或具有敏感性，因此适合于蛋白酶体抑制剂的临床试验。例如，本文描述了鉴定适合用蛋白酶体抑制剂进行临床试验的受试者的方法，其包含确定受试者中非功能性ATAD1的存在，其中非功能性ATAD1的存在表明受试者适合于用蛋白酶体抑制剂进行临床试验。

本文还描述了增强临床试验的方法，包括为那些临床试验选择合适的患者群体。在一个方面，该方法可用于确保基于受试者是否可受益于用蛋白酶体抑制剂或调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂治疗的可能性来鉴定患者参与临床试验。在一些方面，该方法包含确定受试者是否具有非功能性ATAD1，从而鉴定可受益于用蛋白酶体抑制剂或调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂治疗的受试者。

本文公开了用于鉴定用于临床研究的受试者的方法，该方法包含在来自受试者的样品中检测非功能性ATAD1基因，并且其中非功能性ATAD1的存在表明受试者适合于临床试验，其中受试者的非功能性ATAD1由从受试者获得的样品确定。

在一些方面，蛋白酶体抑制剂可以是但不限于硼替佐米、伊沙佐米、卡非佐米、乳胞素、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、马里佐米(Marizomib/salinosporamideA)、奥泼佐米、地兰佐米、艾泼米辛、MG132、β-羟基β-丁酸甲酯。

在一些方面，调节蛋白质降解的蛋白质质量控制的化合物或治疗剂可以是但不限于IRE1调节剂、PERK调节剂、ATF6调节剂、热休克蛋白抑制剂、选择性雄激素受体降解剂或选择性雌激素受体降解剂。

F.组合物

本文公开了任何组合物。本文公开了任何构建体。本文公开了任何核酸序列或氨基酸序列。

G.试剂盒

上述材料以及其它材料可以以任何合适的组合包装在一起，作为用于实施或有助于实施所公开的方法的试剂盒。如果给定试剂盒中的试剂盒组分被设计并适于在所公开的方法中一起使用，则是有用的。例如，公开了用于诊断、检测或治疗癌症的试剂盒，该试剂盒包含确定功能性ATAD1基因缺失的引物、探针、抗体、蛋白质或化合物。

实例

A.实例1

肿瘤抑制基因PTEN是人类癌症中最常见的缺失基因之一(1)。PTEN缺失通常涵盖染色体10q23上许多千碱基(kb)的邻近DNA，包括相邻基因座。与PTEN最接近的基因之一是ATAD1，其编码参与线粒体外膜(OMM)上的蛋白质质量控制的AAA+ATP酶(2-6)。ATAD1对于人和小鼠的生命是必需的，并且它在分离酵母和人的1 0亿年的进化中是保守的(6，7)。本文描述了ATAD1与PTEN的共缺失如何使细胞对泛素蛋白酶体系统(UPS)的功能障碍敏感。ATAD1直接从OMM中提取促细胞凋亡蛋白BIM，证明蛋白质质量控制如何与临床相关环境中的细胞死亡相互作用。

PTEN和ATAD1基因座在人Chr10q23.31上相隔约40kb(图1A)(8)。由于这种接近，使用免疫组织化学在前列腺癌(PrAd)患者的肿瘤标本上评估ATAD1是否与PTEN共缺失，已知其具有PTEN缺失的特征(9)。使用来自37名患有PTEN-null肿瘤的患者的样品来评估ATAD1状态，并且发现ATAD1在超过一半(21/37)中是不可检测的，但在所有1 5个PTEN阳性对照标本中是保留的(图1B、C，图5)。为了证实蛋白质水平的发现，分析了癌症基因组图谱(TCGA)。在PTEN，大多数含有深度缺失的肿瘤在ATAD1中也有深度缺失(图1D)，这在多种类型的癌症中都是如此(图1E)(8)。重要的是，TCGA数据还显示了ATAD1在不存在PTEN缺失的情况下几乎从未缺失(图1D)，并且在ATAD1中基本上没有失活点突变或截断，这与在PTEN和大多数真正肿瘤抑制剂中看到的那些不同。因此，ATAD1缺失仅是PTEN缺失的致癌驱动因素的附带条件。(图1D)。ATAD1的丢失在癌症中发生的频率很高，包括高达25％以上的PrAd、11％的黑素瘤和7至8％的胶质母细胞瘤和肺鳞状细胞癌。因此，了解ATAD1的丢失如何影响这些肿瘤可能在临床上具有深远影响。

ATAD1及其同系物，包括酿酒酵母同系物Msp1，通过从OMM和过氧化物酶体中提取错误定位的或过量的跨膜蛋白来保护线粒体的完整性(10)。也显示了Msp1提取停滞在线粒体输入通道中的蛋白质，TOM复合体(11，12)。考虑到ATAD1在其它情况下在线粒体稳态中的既定作用，ATAD1作为乘客基因的缺失可赋予肿瘤独特的脆弱性。此类脆弱性可以代表精确医学的新治疗靶标，一种称为肿瘤抑制基因缺失的“旁系致死”的概念(13，14)。

为了发现此类脆弱性，进行了全基因组CRISPR筛选以鉴定在ATAD1Δ细胞中选择性必需的基因。使用Cas9的瞬时表达和靶向ATAD1的两个不同的sgRNA，在PTEN-null的Jurkat细胞中生成两个克隆ATAD1Δ系(图2A)。ATAD1缺失不影响基础增殖率(图2B)。对野生型(WT)Jurkat亲本细胞系和两个ATAD1Δ克隆细胞系中的每一种平行进行三次筛选，其比较使我们能够消除克隆细胞系固有的特异反应(图2C)。差异CRISPR评分(dCS)代表以靶向给定基因的sgRNA的平均丰度的Log2倍变化代表的WT和ATAD1Δ之间的差异，提供了在不存在ATAD1的情况下该基因的缺失对细胞适应度是更多还是更少有害的度量。如所预期的，两个克隆细胞系的dCS值显着相关(图6A)。组合p值来惩罚仅在两个ATAD1Δ克隆中的一个中被评为命中的基因(15)。两个基因作为命中出现，如由＜-2和Padj＜0.05的组合dCS值所定义：ACOT11和MARCH5(图2C，图6B、C)。ACOT11编码一种定位于线粒体和细胞质并水解长链脂肪酰基-CoA的酰基-CoA硫酯酶(16，17)。MARCH5编码一种定位于OMM的泛素E3连接酶，其靶向许多跨膜蛋白进行降解(18至20)。

最近显示了MARCH5促进BCL2家族成员的降解，其包含在OMM起调节细胞凋亡起始作用的促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白(21至24)。调节细胞凋亡的关键步骤是BAX/BAK对OMM的透化，这导致线粒体蛋白如细胞色素C扩散到细胞质中并激活半胱天冬酶级联。抗细胞凋亡蛋白，包括BCL2、BCL-XL和MCL1，在基础条件下结合并抑制BAX和BAK(23)。抗细胞凋亡蛋白的上游是促死亡BH3-only蛋白(包括BIM、BID、NOXA、BAD、PUMA等)，其通过使特异性抗细胞凋亡蛋白失活或直接激活BAX/BAK而对应激作出反应(25)。MARCH5的缺失导致MCL1、NOXA和BIM在OMM上累积，并增加对BH3模拟药物的敏感性，其结合并隔离抗细胞凋亡BCL2家族成员以触发细胞凋亡(26至29)。如其它人所指出的，MARCH5和MCL1(编码一种有效的抗细胞凋亡蛋白)是共同必需的(图2D)，这表明它们在相同的途径中起作用(29，30)。事实上，根据DepMap数据库，在整个人类基因组中与MCL1共同必需的基因是MARCH5，反之亦然(31)。

ATAD1和MARCH5在筛选中是合成致死的，表明它们可以在平行途径或功能中起作用。事实上，尽管ATAD1缺失对FIS1(一种不属于BCL2家族的OMM上的尾锚定蛋白)没有影响，但它增加了MCL1和BIM的丰度(图2E、F)，并引发了AMG176诱导的细胞凋亡(其是一种抑制MCL1的BH3模拟物)(图2G)(32)。因此，像MARCH5一样，ATAD1调节BCL2家族成员，并影响细胞凋亡引发，这是通过对BH3模拟物的敏感性来测量的。

为了了解ATAD1的丢失如何影响细胞凋亡引发，进行BH3剖析(33)。在此，用衍生自不同促细胞凋亡BH3-only蛋白的BH3肽处理透化细胞，并通过检测从线粒体释放的细胞色素C直接测量线粒体外膜透性(MOMP)(图3A)。剖析了H4神经胶质瘤细胞，其具有涵盖ATAD1和PTEN两者的Chr10q23缺失，其中存在稳定地再表达的ATAD1、无催化活性的突变体ATAD1E1 93Q或空载体(EV)。在这些表达EV或ATAD1E193Q的ATAD1-null细胞中，BIM肽导致细胞色素C的大量释放，而WT ATAD1的表达显著保护细胞免受BIM介导的细胞色素C释放(图3B)。相反，PUMA和BAD诱导不依赖于ATAD1状态的中度细胞色素C释放。丙甲甘肽是一种合成的成孔肽，独立于BAX/BAK和BH3-only蛋白发挥作用，无论ATAD1状态如何，都同样诱导细胞色素C释放，这表明ATAD1不影响OMM上成孔下游的细胞色素C释放。这些数据显示了ATAD1的缺乏增加了对BIM肽敏感的细胞凋亡引发。这种引发反映了细胞如何调节内源性BIM蛋白的变化。为了确定ATAD1是否保护细胞免受除BIM肽以外的全长BIM蛋白的影响，产生了稳定表达四环素诱导的GFP-BIMEL融合蛋白的细胞系。BIM存在三种主要的同种型，BIMEL(“超长”，主要形式)，BIML(“长”)和BIMS(“短”)，它们共有包括C-末端膜锚的关键结构特征。(34-36)类似于BH3剖析实验，发现ATAD1的丢失使细胞对异位的全长GFP-BIM敏感，如细胞死亡增加和裂解PARP的生成所证明(图3C、D)。因此，生物化学和遗传数据表明ATAD1缺陷对BIM敏感，BIM是一种有效的促细胞凋亡BH3-only蛋白。

BIM可以是ATAD1的直接底物，因为BIM具有已知ATAD1/Msp1底物的一些特征：它是尾锚定的，内在无序的，在其跨膜结构域的C-末端具有碱性残基，并且被蛋白酶体降解(37-39)。ATAD1的缺失导致BIM丰度适度增加(图2E、F)，并且基于观察到的分子量的变化，BIM磷酸化状态可能发生变化(34，40)。在用异位BIM攻击的细胞中检查ATAD1如何影响BIM丰度。该实验在BAK1ΔJurkat细胞系(其基本为BAX-null)中进行，该细胞系对BIM诱导的细胞凋亡具有抗性，以防止细胞死亡使结果混淆。在这种情况下，ATAD1的丢失导致异位GFP-BIMEL、内源性BIMEL的累积，并有内源性BIML累积的趋势(图3E，图7B)。与BIM是ATAD1底物一致，GFP-BIMEL与ATAD1-FLAG免疫共沉淀(图3F)。BIM可以被蛋白酶体降解，并且因此，发现在存在和不存在ATAD1的情况下，急性蛋白酶体抑制都导致BIM水平的显著增加(图3G)。总之，ATAD1缺陷使细胞对BH3模拟物、BIM肽和全长BIM敏感；BIM在ATAD1-null细胞中超累积；并且BIM与ATAD1进行物理交互。这些数据提供了令人信服的情况，即BIM是细胞中的ATAD1底物。

为了确定BIM是否是ATAD1的直接底物，使用ATAD1和BIML进行体外提取测定。使用BIML是因为它比BIMEL更易溶，但除了N末端附近的结构域之外，它具有所有关键结构特征(34)。全长ATAD1不能被纯化。相反，N-末端TMD用His6标签交换，其将His-ATAD1锚定到掺有镍螯合首基的脂质体(“Ni脂质体”；图3H)。在该提取测定中，通过ATAD1/Msp1从脂质体提取的TA蛋白与可溶性GST标记的伴侣蛋白结合，在谷胱甘肽柱上纯化，并通过蛋白质印迹检测(39)。在该体外测定中，His-ATAD1直接有效地从脂质体中提取3xFLAG-BIML(图3I)。如所预期的，该活性是ATP依赖性的(泳道17至20)，并且当使用无催化活性的突变体ATAD1E193Q时(泳道1至4)，该活性消失。省略镍螯合脂质(“Mito脂质体”；泳道5至8)阻断了BIM的提取，表明ATAD1需要膜锚定其提取酶活性。重要的是，ATAD1没有提取另一TA蛋白Fis1(泳道9至12)。因此，ATAD1特异性提取BIM，但不是所有TA蛋白。(38)。

Ni-His锚定策略通过使用酵母同源物Msp1的全长(FL)或类似His标记的版本来验证(图7B)。FL-Msp1和His-Msp1都提取BIM(图7C、D)，符合ATAD1和Msp1的生化保守性。使用Msp1和一系列阳性和阴性对照TA蛋白验证了该测定的底物选择性(图7E)。总之，这些实验显示了ATAD1直接并特异性地从脂质膜中提取BIM。

BIM在泛素蛋白酶体系统(UPS)的功能障碍时累积，该功能障碍由应激物如MARCH5的丢失或用蛋白酶体抑制剂治疗诱导(41)。在Del(10q23)细胞中用蛋白酶体抑制剂诱导UPS功能障碍可以增加BIM并利用ATAD1的缺乏。实际上，硼替佐米和卡非佐米有效且快速地诱导Del10q23细胞(SW1088和H4神经胶质瘤和RPMI7951黑素瘤)的活力丢失，其通过ATAD1的表达而减轻(图4A、B；图8A至E)。没有可用的Del(10q23)前列腺癌细胞系，但PC3细胞是PTEN-null的和ATAD1半合子的(图8F)。在对硼替佐米敏感的PC3细胞中，ATAD1的剩余等位基因缺失，而ATAD1的过表达-而非ATAD1E193Q-增加了对硼替佐米的抗性(图8G至I)。因此，在UPS功能障碍的情况下，ATAD1对于细胞活力至关重要。

凋亡细胞死亡仅是细胞中蛋白酶体抑制剂毒性的许多机制之一(42至44)。在我们的系统中，硼替佐米在Del10q23-EV细胞中诱导强细胞凋亡，但在ATAD1再表达细胞中仅最低限度地诱导(图4C、D)。在ATAD1存在或不存在的情况下，多泛素化蛋白质累积到相同的程度，表明ATAD1影响细胞如何对蛋白毒性应激作出反应，而不是最小化蛋白毒性损伤本身。然后询问ATAD1是否通过一些细胞凋亡-非依赖性途径影响蛋白酶体抑制剂敏感性，在这种情况下，ATAD1再表达和半胱天冬酶抑制(其阻断细胞凋亡)将在减轻蛋白酶体抑制剂毒性中具有叠加效应。引人注目的是，在用硼替佐米处理的Del10q23细胞中，用半胱天冬酶抑制剂zVAD-fmk处理的ATAD1再表达基本上是表型复制的(图4E至G)。此外，在ATAD1再表达细胞中，zVAD的叠加效应极小，表明ATAD1和zVAD在蛋白酶体抑制下游的相同途径中起作用(图4H)。总之，这些结果表明ATAD1在蛋白酶体抑制过程中的保护作用可以仅通过细胞凋亡来解释。

使用皮下异种移植模型在体内评估ATAD1对肿瘤生长的作用。SW1088是一种Del10q23神经胶质瘤细胞系，其具有低克隆潜力并且在SCID小鼠中是非致瘤性的(45，46)。因此，用EV转导的SW1088细胞在注射的1 7只NOD/SCID小鼠中有17只未形成肿瘤。值得注意的是，在注射的1 8只小鼠中，有17只的ATAD1再表达细胞生长出可触知的肿瘤(图4I、J)。由于ATAD1不影响培养物中SW1088细胞的增殖速率，这种作用不能简单地通过增殖差异来解释(图4K)。因此，ATAD1在体内PTEN-null细胞中起着深刻的促存活作用，这与ATAD1提取BIM进行降解并保护免受蛋白毒性应激诱导的细胞凋亡的发现一致。

促细胞凋亡和抗细胞凋亡BCL2蛋白的微妙平衡不断威胁着细胞的存活。这些蛋白质是如何被激活的已经被深入研究过，但是关于它们是如何被降解的却知之甚少。ATAD1直接且特异性地提取OMM定位的BIM，其在UPS功能障碍期间累积。ATAD1丢失对UPS功能障碍敏感的发现可能对成千上万患有Del10q23肿瘤的癌症患者具有重要的临床意义。

尽管引发了细胞凋亡，但ATAD1丢失在癌症中如此频繁地发生似乎是违反直觉的。必须记住，任何时候缺失ATAD1，PTEN也会缺失。PTEN丢失激活AKT，AKT具有强烈的促存活作用，包括通过抑制FOXO3A降低BCL2L11(BIM)的转录，和通过直接磷酸化使BAD失活(47，48)。因此，PTEN的共缺失可以缓冲一些由ATAD1丢失诱导的细胞凋亡引发。此外，引发细胞凋亡的遗传损伤并不总是针对癌症进行选择。相反，有效的致癌基因(包括MYC旁系同源物)可以诱导细胞凋亡引发，但仍被强烈选择(49，50)。不能排除在某些情况下ATAD1丢失可能是有益的，但我们的数据压倒性地支持其作为促存活因子的作用。

此外，ATAD1对细胞凋亡的影响可能超越了UPS功能障碍，并进入了更广泛的生理环境。ATAD1(小鼠中的“Thorase”)尚未被报道与细胞凋亡相关，但最初是通过遗传筛选防止响应于氧和葡萄糖剥夺(OGD)的神经元细胞死亡的因子(其包括抗细胞细胞凋亡Bcl-xL)在哺乳动物中发现的(51)。预处理方案增加了Atad1的表达，然后保护细胞免受后续OGD。在其它情况下，响应促存活信号的ATAD1表达增加可以帮助细胞中和促细胞凋亡的BIM。进一步地，在缺血性发作的大脑中动脉闭塞小鼠模型中Atadl复现Bcl2和Bcl-xL：Atad1或Bcl2的缺失加剧，而Atad1、Bcl2或Bcl211(编码Bcl-xL)的过表达降低神经元细胞死亡(52-55)。另外，最近发现保守半胱氨酸残基的亚硝基化使ATAD1失活(56)，这可以提供一种机制，由此损伤组织中的具反应性的氮物质使ATAD1失活以触发BIM介导的细胞凋亡。因此，除了其作为AMPA受体调节剂的既定功能外，BIM的拮抗作用可有助于体内ATAD1/Thorase的神经保护功能。明确ATAD1调节和功能的机制和原则将重塑我们对细胞凋亡具有敏感性的理解，而且在PTEN/ATAD1共缺失肿瘤及其它方面具有深远临床影响的潜力。

材料和方法：

主要联系人

有关资源和试剂的更多信息和要求应直接向主要联系人Jared Rutter(rutter@biochem.utah.edu)提出，并将由其履行。

材料可得性

本研究中生成的所有独特/稳定试剂均可根据要求从主要联系人处获得，不受限制。

数据和代码可得性

本研究期间生成的CRISPR筛选数据可在补充材料中获得。

实验模型和主题细节

ATAD1敲除细胞系

Jurkat E6.1人T-ALL细胞(ATCC TIB-152)在含有10％FBS和100U/mL青霉素/链霉素(赛默飞世尔(ThermoFisher))的RPMI1640中生长。根据制造商的说明书，使用瑞士龙沙公司(Lonza)SE细胞系4D-核转染TM X试剂盒L，并使用针对Jurkat E6.1细胞优化的方案，对细胞进行电穿孔。Px458衍生的编码靶向ATAD1的sgRNA的质粒通过电穿孔在Jurkat细胞中瞬时表达。三天后，分选GFP+细胞(BD FACSAria)并作为单细胞铺在96孔板中。使克隆细胞系生长、收获，并使用敲除验证的单克隆抗体(NeuroMab)通过免疫印迹评估ATAD1缺失。

用编码LentiCRISPRv2-GFP(LCv2G)的慢病毒或带有sgATAD1(指导序列#1)的LCv2G转导PC3细胞。转导后三天，分选GFP+细胞(BD FACSAria)并作为多克隆群体维持。如上所述通过免疫印迹证实编辑。

ATAD1在Del10q23细胞系中再表达

用编码有C-末端FLAG和HA标签的ATAD1的逆转录病毒(PQCXIP转移质粒)转导H4和PC3细胞。转导后两天，用1μg/mL嘌呤霉素选择细胞4天。RPMI7951和SW1088细胞对逆转录病毒感染具有抗性，取而代之的是用编码ATAD1-FLAG的慢病毒(pLenti-Blast转移质粒)转导，并用8μg/mL杀稻瘟菌素选择6天。细胞在解冻后在含有选择性抗生素(嘌呤霉素或杀稻瘟素)的培养基中生长，但是没有使用含有选择性抗生素的培养基进行实验。

1.方法细节

i.免疫组织化学

ATAD1(使用NeuroMab#75-157小鼠单克隆抗体)

在福尔马林固定的石蜡包埋组织的4微米厚切片上进行ATAD1免疫组织化学染色。将切片风干，然后在60℃烘箱中熔融30分钟。将载玻片装载到徕卡(Leica)Bond

PTEN(使用兔抗人单克隆抗体)：克隆138G6，目录号9559L，《细胞信号(CellSignaling)》，马萨诸塞州，丹威斯(Danvers，MA))。

在福尔马林固定的石蜡包埋组织的4微米厚切片上进行PTEN免疫组织化学染色。将切片风干，然后在60℃烘箱中熔融30分钟。将载玻片装载到Ventana BenchMark

ii.细胞培养

将Jurkat细胞在含有10％FBS(西格玛(Sigma))和100U/mL青霉素/链霉素的RPMI1640中培养。有规律地计数细胞，但总是在达到3x106细胞/mL的浓度之前，通常以约1.5x106细胞/mL的浓度分裂。将贴壁细胞系维持在以下培养基中的亚汇合培养物中：RPMI1640(PC3)、DMEM(H4，SW1088)、EMEM(RPMI7951)，均含10％FBS和100μ/mL青霉素/链霉素。

iii.克隆

所有克隆都通过传统的PCR/限制酶“剪切和粘贴”方法进行，并通过Sanger测序验证。

ATAD1构建体：

编码ATAD1-FLAG/HA和ATAD1E193Q-FLAG/HA的逆转录病毒质粒先前已公开(Chen等人，2014)。使用pLenti-BLAST骨架，通过PCR扩增来自上述逆转录病毒载体的ATAD1 CDS来制备慢病毒载体，但通过用终止密码子替换HA标签来截断构建体。

GFP-BIM构建体：

pLVXTet-One载体购自宝制果(Takara)。对EGFP的编码序列进行PCR扩增，并使用AgeI/BamHI位点将其连接到MCS中。使用SOEing PCR生成EGFP-BIMEL的融合体，并使用AgeI/BamHI位点连接。还将EGFP-BIMEL连接到pEGFP-C3中用于瞬时转染。

iv.细胞滴度Glo活力测定

根据制造商的建议，通过细胞滴定度Glo(普洛麦格(Promega))测定活力，并进行一些修改。将细胞以5x 103细胞/孔的密度铺在100μL的96孔板中，该板具有白色壁和透明底部(康宁(Corning)#3610)。将细胞滴度Glo试剂重组，使用无菌PBS以1：4稀释，并在-20℃下以10mL等分试样储存。对于所示的每个实验，进行至少2个独立的实验，并且每个实验用3个生物学重复进行，除了在PC3细胞中的ATAD1过表达实验(图S4I)，其各自具有2个生物学重复。由于考虑到边缘效应，96孔板的外部孔充满培养基，而不是细胞。使用BiotekSynergy Neo2微板读取器测量发光。将每个板上的发光值相对于同一平板上未处理的细胞进行归一化，并表示为百分比。

v.结晶紫染色

用PBS洗涤12或6孔板中培养的细胞两次，然后用4％多聚甲醛(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))在室温下固定30分钟。用ddH2O洗涤孔三次，然后在室温下用20％甲醇中的0.1％(w/v)结晶紫溶液染色30分钟。再次用ddH2O洗涤孔三次，倒置干燥，使用iPhoneX对白色背景对板拍照。为了量化，向每个孔中添加冰醋酸以洗脱染料，并将板在室温下在旋转振荡器上孵育30分钟。使用Biotek Synergy Neo2微板读取器在590nm处测量吸光度，并将值归一化为来自每个板上相同基因型的未处理细胞的那些。

vi.SDS-PAGE和免疫印迹

通过将细胞直接刮到补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(西格玛奥德里奇P8340，罗氏分子(Roche Molecular)04906845001)的RIPA缓冲液中来制备全细胞裂解物，在冰上孵育30分钟，每10分钟涡旋一次，然后在4℃下以16,000g旋转10分钟以去除不溶物质。保存上清液作为裂解物。通过BCA测定(赛默飞世尔23225)将WCL、PMS和/或粗线粒体级分归一化为总蛋白质含量。通过SDS-PAGE或Tris-甘氨酸凝胶(英杰公司(Invitrogen)XP04205BOX)解析样品并转移至硝酸纤维素或PVDF(提取测定)膜。根据制造商的建议，使用在关键资源表中列出的指定的初级抗体进行免疫印迹，并通过Licor Odyssey或Azure C500(提取测定)进行分析。注意，Azure C500的检测器有几列像素似乎不起作用。这使得在一些图像中出现细的垂直白线。通过过度调整对比度，可以在原始数据文件中很容易地看到。

vii.免疫共沉淀

在20μM zVAD-fmk存在下，用pEGFP-C3(GFP)或GFP-BIMEL在pEGFP-C3(GFP-BIM)中转染H4细胞(表达EV或ATAD1-WT-FLAG/HA)，10μg质粒用于10em板。瞬时表达进行过夜(14至16小时)。用冷PBS洗涤细胞，并用补充有蛋白酶抑制剂混合物和1％CHAPS(HNC缓冲液)的HN缓冲液裂解细胞。磁性抗FLAG珠(西格玛奥德里奇公司)用HNC缓冲液平衡，然后与裂解物混合(在去除10％体积作为输入后)。将珠-裂解物混合物在旋转器上在4℃下孵育2至4小时。用HNC缓冲液洗涤珠3次，然后在30μL 1X莱姆利缓冲液(Laemmli buffer)中在65℃下加热10分钟。

viii.细胞计数

使用BioRad TC20细胞计数器对细胞进行计数。每次计数时，至少从培养物中取出两个样品，并记录平均值。

ix.CRISPR筛选

Jurkat细胞(野生型亲本、ATAD1KO#1和ATAD1KO#2)通过用基因组范围的慢病毒sgRNA文库(Addgene#1000000100；Wang等人，《科学(Science)》2015)通过旋转感染进行转导，其也编码Cas9和嘌呤霉素抗性盒。优化转导以达到约30％的转导效率，并用嘌呤霉素(0.5μg/mL)选择细胞三天，允许在没有嘌呤霉素的情况下恢复两天，然后在筛选期间维持在较低剂量的嘌呤霉素(0.2μg/mL)中。收集细胞的初始样品(8x 107)并在嘌呤霉素选择的终点(转导后六天)冷冻。然后将细胞维持在培养物中，进行14次累积群体倍增。细胞每两天传代一次，并以2x105细胞/mL的密度接种到新的烧瓶中。在14次群体倍增后，收集代表性样品(8x 107个细胞)。如别处所述(Adelmann等人，“摩尔生物学的方法(Methods in MolBiol)”，2019)，使用QIAamp DNA Blood Maxiprep处理细胞沉淀，通过PCR扩增sgRNA序列，并在怀特海研究所(Whitehead Institute)通过Illumina HiSeq NGS DNA测序核心设施对扩增子测序40个循环。

将测序读数与sgRNA文库进行比对，假定假计数为1，并如前所述计算每个sgRNA的丰度(Wang等人，《科学》，2015；Kanarek等人，《自然(Nature)》，2018)。将每个样品的计数归一化为测序深度。初始参考数据集中少于50个读数的sgRNA和少于4个sgRNA的基因从下游分析中被忽略。计算最终和初始参照群体之间每个sgRNA丰度的log2倍变化，并用于定义每个基因的CRISPR评分。CRISPR评分是靶向给定基因的所有sgRNA的丰度的平均log2倍变化。使用柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫测试针对整个sgRNA分布测试靶向给定基因的所有sgRNA的分布，并使用Benjamini-Hochberg方法调节p值。为了直接比较ATAD1Δ克隆与WT对照的基因重要性，在两组中省略了未充分表现的sgRNA(即在初始时间点＜50个读数)。该步骤使得sgRNA丰度变化的成对分析成为可能，并且避免了包括在一个遗传背景中“评分”但在另一个遗传背景中不能评估其效果的给定sgRNA。每个基因的每个ATAD1克隆的差异CRISPR评分(dCS)计算如下：CSATAD1Δ-CSATAD1-WT。将两个dCS值的平均值相加并表示为“组合的dCS”。在一个克隆中评分为“命中”而在另一个克隆中没有评分为“命中”的基因可以反映克隆人为假象或简单的实验错误-这些基因在分析中通过费希尔方法(费希尔，R.A.，1934；也称为“对数之和”或“卡方”方法)，使用R包“metap”(Dewey M，2020)进行荟萃分析。使用R版本4和RStudio版本1.1.442分析并绘制数据。

x.BH3-剖析

如前所述(Ryan和Letai，方法2013)，使用基于FACS的方法进行BH3-剖析以直接监测细胞色素C在细胞中的释放/保留。

xi.荧光显微法

SW1088细胞(表达EV或ATAD1-WT)在8室载玻片上生长，在成像前2天以5×103细胞/室接种。成像前一晚(12小时)，用10nM硼替佐米(BTZ)处理细胞或不处理细胞。第二天早上，用PBS洗涤室两次，并在37℃CO2培养箱中用MitoTracker Red CMXRos(20nM)染色20分钟。用培养基洗涤细胞两次，然后立即在配备有40×和100×物镜(油浸)的Axio ObserverZ1成像系统(卡尔蔡司(Carl Zeiss))上成像。对每种条件下至少30个细胞成像，并重复n＝2个独立实验。

xii.小鼠异种移植物

SW1088细胞(用EV或ATAD1-FLAG转导)在正常培养条件下生长，如上所述。将细胞(3x 106)与Matrigel(康宁

xiii.细菌转化

对于克隆，根据制造商提供的手册转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))并在LB琼脂板上在37℃下生长过夜。对于慢病毒和逆转录病毒载体的克隆，使用NEB稳定的感受态细胞(NEB C3040I)。

xiv.E.cloni细胞

为了克隆，根据制造商(Lucigen)提供的手册转化E cloni10G感受态细胞，并在LB琼脂板上在37℃下生长过夜。

xv.BL21-DE3 pRIL细胞

对于蛋白质表达，含有pRIL质粒和蛋白质表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃的TB培养基中生长，直到OD600为0.6至1.0。用最终浓度为1 mM的异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导培养物，并在室温下再生长3至4小时。

xvi.可溶性构建体的生产

Δ1-32Msp1和Δ1-39ATAD1：

从基因组DNAPCR扩增编码酿酒酵母Msp1(Δ1-32)可溶性区域的基因，并将其亚克隆到pET28a衍生物(Novagen)中，该衍生物编码N-末端6xHis标签，随后是TEV蛋白酶切割位点。从含有ATAD1 cDNA的质粒(通用电气医疗集团(GE Healthcare))PCR扩增褐家鼠ATAD1(Δ1-39)的可溶性区域。通过标准PCR技术进行所有插入和缺失。通过快速改变PCR进行定点突变。通过DNA测序验证所有构建体。

纯化编码可溶的Msp1、ATAD1或其突变体的质粒，如前所述(Wohlever等人，2017)。将质粒转化到含有pRIL质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中，并在37℃的TB培养基中表达，直到OD600为0.6至1.0，用1 mM IPTG诱导培养物，并在室温下再生长3至4小时。通过离心收获细胞，并重新悬浮于补充有0.05mg/mL溶菌酶(西格玛)、1 mM苯甲磺酰氟(PMSF)和500U通用核酸酶(皮尔斯公司(Pierce))的Msp1裂解缓冲液(20mM Tris pH 7.5、200mM KAc、20mM咪唑、0.01 mM EDTA、1 mM DTT)中，并通过超声裂解。通过在4℃下以1 8,500x g离心30分钟分离上清液，并在重力柱上通过Ni-NTA亲和色谱(皮尔斯公司)纯化。在用补充有250mM咪唑的裂解缓冲液洗脱之前，用10倍柱体积(CV)的Msp1裂解缓冲液洗涤Ni-NTA树脂，然后用10CV的洗涤缓冲液(含30mM咪唑的Msp1裂解缓冲液)洗涤。可溶性ATAD1的纯化还包括添加ATP以稳定蛋白质。超声处理后添加ATP至最终浓度为2mM，并从镍树脂上洗脱后再次添加。

在20mM Tris pH 7.5、200mM KAc、1 mM DTT中，通过尺寸排阻色谱法(SEC)(Superdex 200Increase 10/300GL，通用电气医疗集团)进一步纯化蛋白质。合并峰级分，在30kDa MWCO Amicon超离心过滤器(皮尔斯公司)中浓缩至5至15mg/ml，并将等分试样在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。使用计算的消光系数(Expasy)通过A280测定蛋白质浓度。

xvii.GST-SGTA和GST-钙调蛋白：

GST标签的SGTA进行表达和纯化，如前所述(Mateja等人，2015)。原始钙调蛋白质粒是海格德实验室(Hegde lab)的善意礼物(Shao和Hegde，2011)。通过标准方法将钙调蛋白克隆到pGEX6p1质粒中。GST-SGTA和GST-钙调蛋白的表达如上所述用于可溶性Msp1构建体。通过离心收获细胞，并重新悬浮于补充有0.05mg/mL溶菌酶(西格玛)、1mM PMSF和500U通用核酸酶(皮尔斯公司)的SGTA裂解缓冲液(50mM Hepes pH 7.5、150mM NaCl、0.01 mMEDTA、1 mM DTT、10％甘油)中，并通过超声裂解。通过在4℃下以1 8,500x g离心30分钟分离上清液，并通过重力柱上的谷胱甘肽亲和色谱(赛默飞世尔)纯化。用20倍柱体积(CV)的SGTA裂解缓冲液洗涤树脂，然后用补充有10mM还原型谷胱甘肽的3CV SGTA裂解缓冲液洗脱。在20mM Tris pH 7.5、100mM NaCl、0.1mM TCEP中，通过尺寸排阻色谱法(SEC)(Superdex 200Increase 10/300GL，通用电气医疗集团)进一步纯化蛋白质。合并峰级分，在30kDa MWCO旋转浓缩器(皮尔斯公司)中浓缩至10mg/ml，并将等分试样在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。使用计算的消光系数(Expasy)通过A280测定蛋白质浓度。

xviii.膜蛋白的生产

BIM和Fis1：

克隆智人BimL或酿酒酵母Fis1 TMD+/-5侧翼氨基酸(残基126-155)来代替如前所述的SumoTMD构建体中的Sec22 TMD(Wang等人，2010；Wohlever等人，2017)。这些构建体具有N-末端His6和3x Flag标签以及C-末端视蛋白糖基化位点(11个残基)。通过标准PCR方法，在His标签后立即添加3C蛋白酶位点。得到的构建体是His6-3C-3xFlag-Sumo-凝血酶-BimL-视蛋白和His6-3C-3xFlag-Sumo-凝血酶-Fis1(126-155)-视蛋白。

将SumoTMD的表达质粒转化到含有pRIL质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中，并在37℃的TB培养基中表达，直到OD600为0.6至0.8，用0.4mM IPTG诱导培养物，并在20℃下再生长3至4小时。通过离心收获细胞，并重新悬浮于补充有0.05mg/mL溶菌酶(西格玛)、1mM PMSF和500U通用核酸酶(皮尔斯公司)的SumoTMD裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.5、300mM NaCl、10mM MgCl2、10mM咪唑、10％甘油)中，并通过超声裂解。通过添加正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)至最终浓度为1％来溶解膜蛋白，并在4℃下摇动30分钟。通过在4℃下以35,000x g离心1小时来清洗溶胞产物，并通过Ni-NTA亲和色谱纯化。

用10倍柱体积(CV)的SumoTMD洗涤缓冲液1(50mM Tris pH 7.5、500mM NaCl、10mMMgCl2、10mM咪唑、5mM β-巯基乙醇(BME)、10％甘油、0.1％DDM)洗涤Ni-NTA树脂。然后用10CV的SumoTMD洗涤缓冲液2(除了具有300mM NaCl和25mM咪唑之外，与洗涤缓冲液1相同)和10CV的SumoTMD洗涤缓冲液3(与具有150mM NaCl和50mM咪唑的洗涤缓冲液1相同)洗涤树脂，然后用3CV的SumoTMD洗脱缓冲液(除了具有250mM咪唑之外，与洗涤缓冲液3相同)洗脱。

在50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、10mM MgCl2、5mM BME、10％甘油、0.1％DDM中，通过尺寸排阻色谱法(SEC)(Superdex 200Increase 10/300GL，通用电气医疗集团)进一步纯化蛋白质。收集峰级分，并在30kDa MWCO自旋浓缩器(皮尔斯公司)中浓缩。然后将样品与3C蛋白酶以1∶100的比例在4℃下孵育过夜以去除His标签。第二天，样品通过在裂解缓冲液中平衡的Ni-NTA树脂，以去除3C蛋白酶、His标签和未裂解的蛋白质。收集流通液，等分并在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。使用计算的消光系数(Expasy)通过A280测定蛋白质浓度。

Msp1：

从基因组DNA PCR扩增全长酿酒酵母Msp1，亚克隆到具有C-末端6xHis标签的pET21b衍生物中，并如上所述表达可溶性构建体。通过超声处理裂解细胞，并通过在4℃下以140,000x g离心1小时收获不溶性级分。在含有1％DDM(Bioworld)的Msp1裂解缓冲液中再溶解16小时后，通过以142,000x g离心45分钟分离去污剂可溶性上清液，并通过Ni-NTA亲和色谱和SEC纯化，如上所述用于可溶性构建体，除了所有缓冲液含有0.05％DDM。在100kDa MWCO Amicon超离心过滤器(密理博(Millipore))中浓缩峰级分。使用计算的消光系数(Expasy)通过A280测定蛋白质浓度，并将等分试样在液氮中快速冷冻。

xix.蛋白脂质体中Msp1活性的重组

脂质体制剂

如所述(Kale等人，2014)制备模拟酵母线粒体外膜的脂质组成的脂质体。简言之，通过将鸡蛋磷脂酰胆碱(Avanti 840051C)、鸡蛋磷脂酰乙醇胺(Avanti 840021C)、牛肝磷脂酰肌醇(Avanti 840042C)、合成DOPS(Avanti 840035C)和合成TOCL(Avanti 710335C)的氯仿原料以48：28：10：10：4的摩尔比与1mg DTT混合来制备25mg脂质膜。如上所述制备镍脂质体，除了1，2-二油酰基-sn-甘油-3-[N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰基]。镍盐(Avanti 790404)以2％的摩尔比使用，并且DOPS从10％降至8％。

在温和的氮气蒸汽下蒸发氯仿，然后置于真空(＜1mTorr)过夜。将脂质膜重悬于脂质体缓冲液(50mM Hepes KOH pH 7.5、15％甘油、1mM DTT)中至最终浓度为20mg/mL，然后用液氮进行五次冻融循环。脂质体在60℃下通过200nm过滤器挤出15次，分配成单次使用的等分试样，并在液氮中快速冷冻。

蛋白脂质体制剂

对于使用全长Msp1的提取测定，通过在重组缓冲液混合1μM Msp1、1μM TA蛋白(SumoTMD)和2mg/mL线粒体脂质体(50mM Hepes KOH pH 7.5、200mM乙酸钾、7mM乙酸镁、2mMDTT、10％蔗糖、0.01％叠氮化钠和0.1％脱氧大裂)来制备蛋白脂质体(Zhang等人，2013)。对于用可溶性Msp1/ATAD1的提取测定，通过在重组缓冲液中混合1μM TA蛋白(SumoTMD)和2mg/mL镍脂质体来制备蛋白脂质体。通过添加25mg生物珠并在4℃下旋转样品16小时来去除污剂。在去除生物珠后，通过将重组材料与过量(5μM)GST-SGTA和GST-钙调蛋白一起孵育并通过谷胱甘肽旋转柱(皮尔斯公司#16103)来预清洗未掺入的TA蛋白；收集流通液并立即用于位错测定。

xx.提取测定

提取测定含有60μL预清洗的蛋白脂质体、5μM GST-SGTA、5μM钙调蛋白和2mM ATP，并用提取缓冲液(50mM Hepes KOH pH 7.5、200mM乙酸钾、7mM乙酸镁、2mM DTT、0.1μM氯化钙)将最终体积调节至200μL。将样品在30℃下孵育35分钟，然后装载到谷胱甘肽自旋柱上。用提取缓冲液洗涤柱4次，并用补充有20mM谷胱甘肽pH 8.5的相同缓冲液洗脱。将样品装载到无染色剂凝胶上，成像，然后转移到PVDF膜上并按照关键资源表中的指示进行印迹。为了说明重组效率和蛋白质印迹的可变性，用野生型Msp1与每个突变体Msp1平行进行新的重组和错位测定。数字代表N>3个单独重组。注意“输入”泳道相对于“洗脱”泳道稀释了5倍。

xxi.量化和统计分析

使用ImageJ估计蛋白质印迹带强度(Schneider等人，2012)。为了说明重组效率和蛋白质印迹的可变性，用野生型Msp1与每个Msp1突变体平行进行新的重组和错位测定。数字代表N>3个单独重组。通过比较“洗脱”泳道中TA蛋白的量与“输入”泳道中底物的量来量化位错效率。

本领域技术人员将认识到，或者能够仅使用常规实验来确定，本文所述方法和组合物的具体实施例的许多等同物。此类等同物旨在被以下权利要求所涵盖。

参考文献

1.Worby CA、Dixon JE.Pten.《生物化学年度评论(Annu Rev Biochem)》2014；83(1)：641-69。

2.Chen Y-C、Umanah GKE、Dephoure N、Andrabi SA、Gygi SP、Dawson TM等人，“Msp1/ATAD1通过促进错误定位的尾锚定蛋白的降解来维持线粒体功能(Msp1/ATAD1maintains mitochondrial function by facilitating the degradation ofmislocalized tail-anchored proteins)”《EMBO杂志(EMBO J)》2014年7月17日；33(14)：1548-64。

3.Okreglak V、Walter P.“保守的AAA-ATP酶Msp1赋予尾锚定蛋白细胞器特异性(The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchoredproteins)”《美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci)》2014年6月3日；111(22)：8019-24。

4.Nakai M、Endo T、Hase T、Matsubara H“线粒体内蛋白质分类(Intramitochondrial protein sorting)”酵母MSP1基因的分离和表征，该基因属于推定ATP酶的新家族。《生物化学杂志(J Biol Chem)》1993年11月15日；268(32)：24262-9。

5.Wang L、Walter P.“Msp1/ATAD1在蛋白质质量控制和突触活动调节中的作用(Msp 1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of SynapticActivities)”《细胞与发育生物学年度评论(Annu Rev Cell Dev Biol)》2020；36(1)：141-64。

6.Zhang J、Wang Y、Chi Z、Keuss MJ、Pai Y-ME、Kang HC等人“AAA+ATP酶Thorase调节AMPA受体依赖性突触可塑性和行为(The AAA+ATPase Thorase Regulates AMPAReceptor-Dependent Synaptic Plasticity and Behavior)”《细胞(Cell)》2011年4月15日；145(2)：284-99。

7.Ahrens-Nicklas RC、Umanah GKE、S ondheimer N、Deardorff MA、Wilkens AB、Conlin LK等人，“ATAD1突变导致的AMPA受体再循环新病症的精确治疗(Precisiontherapy for a new disorder of AMPA receptor recycling due to mutations inATAD 1)”《神经遗传学(Neurol Genet)》2017年2月1日l；3(1)：e130。

8.Poluri RTK、Audet-Walsh

9.Chung JH、Dewal N、Sokol E、Mathew P、Whitehead R、Millis SZ等人，“原发性和转移性前列腺肿瘤的前瞻性综合基因组剖析(Prospective Comprehensive GenomicProfiling of Primary and Metastatic Prostate Tumors)”《临床肿瘤学杂志：精准肿瘤学(JCO Precis Oncol)》[互联网]2019年5月10日[引用于2020年5月1日]；可从以下网址获得：https：//ascopubs.org/doi/pdf/10.1200/PO.18.00283

10.Weir NR、Kamber RA、Martenson JS、Denic V.“AAA蛋白Msp1介导过量尾锚定蛋白从过氧化物酶体膜的清除(The AAA protein Msp1 mediates clearance of excesstail-anchored proteins from the peroxisomal membrane)”，《eLife》201 7年9月14日；6：e28507。

11.Weidberg H、Amon A，“MitoCPR-一种保护线粒体响应蛋白质输入应激的监测途径(MitoCPR-A surveillance pathway that protects mitochondria in response toprotein import stress)”，《科学》[互联网]2018年4月13日[引用于2020年4月24日]；360(6385)。可从以下网址获得：https：//science.sciencemag.org/content/360/6385/eaan4146

12.Basch M、Wagner M、Rolland S、Carbonell A、Zeng R、Khosravi S等人，“Mspl与蛋白酶体协同作用以提取停滞的线粒体输入中间体(Msp1 cooperates with theproteasome for extraction of arrested mitochondrial import intermediates)”《细胞分子生物学(Mol Biol Cell.)》2020年2月12日；31(8)：753-67。

13.Muller FL、Aquilanti EA、DePinho RA“旁系致死：肿瘤学的新治疗策略(Collateral Lethality：A New Therapeutic Strategy in Oncology)”《癌症趋势(Trends Cancer)》2015年11月1日；1(3)：161-73。

14.Muller FL、Colla S、Aquilanti E、Manzo V、Genovese G、Lee J等人，“乘客缺失导致癌症治疗的脆弱性(Passenger Deletions Generate TherapeuticVulnerabilities in Cancer)”《自然》2012年8月16日；488(7411)：337-42。

15.Dewey、Michael，“metap：显著性值的荟萃分析(metap：meta-analysis ofsignificance values)”R包版本14，2020年。

16.Chen D、Latham J、Zhao H、Bisoffi M、Farelli J、Dunaway-Mariano D，“人褐色脂肪诱导硫酯酶变体2的细胞定位和催化功能(Human Brown Fat InducibleThioesterase Variant 2Cellular Localization and Catalytic Function)”《生物化学(Biochemistry)》2012年9月4日；51(35)：6990-9。

17.Bekeova C、Anderson-Pullinger L、Boye K、Boos F、Sharpadskaya Y，Herrmann JM等人，“多种线粒体硫酯酶具有不同的组织和底物特异性以及CoA调节，表明独特的功能作用(Multiple mitochondrial thioesterases have distinct tissue andsubstrate specificity and CoA regulation，suggesting unique functional roles)”《生物化学杂志》2019月12月13日；294(50)：19034-47。

18.Nakamura N、Kimura Y、Tokuda M、Honda S、Hirose S，“MARCH-V是一种新的能够改变线粒体形态的线粒体融合蛋白2-和Drp1-结合蛋白(MARCH-V is a novelmitofusin 2-and Drp1-binding protein able to change mitochondrialmorphology)”《EMBO报告(EMBO Rep)》2006年8月1日；7(10)：1019-22。

19.Cherok E、Xu S、Li S、Das S、Meltzer WA、Zalzman M等人“Mff和Drp1在E3泛素连接酶MARCH5依赖的MiD49和Mcl1降解和线粒体动力学控制中的新调节作用(Novelregulatory roles of Mff and Drp1 in E3 ubiquitin ligase MARCH5-dependentdegradation of MiD49 and Mcl1 and control of mitochondrial dynamics.)”《细胞分子生物学》2016月12月8日；28(3)：396-410。

20.Yonashiro R、Ishido S、Kyo S、Fukuda T、Goto E、Matsuki Y等人，“新的线粒体泛素连接酶在线粒体动力学中起关键作用(Anovel mitochondrial ubiquitin ligaseplays a critical role in mitochondrial dynamics.)”《EMBO杂志》2006年8月9日；25(15)：3618-26。

21.Kale J、Osterlund EJ、Andrews DW，“BCL-2家族蛋白：在走向死亡的舞蹈中交换舞伴(BCL-2family proteins：changing partners in the dance towards death)”。《细胞死亡和分化》2018年1月；25(1)：65-80。

22.LetaiA，“细胞凋亡和癌症(Apoptosis and Cancer)”《癌症生物学年度综述(Annu Rev Cancer Biol.)》2017；1(1)：275-94。

23.Czabotar PE、Lessene G、Strasser A、Adams JM，“BCL-2蛋白家族对细胞凋亡的控制：生理学和治疗的意义(Control of apoptosis by the BCL-2protein family：implications for physiology and therapy)”《自然综述-分子细胞生物学(Nat Rev MolCell Biol)》2014年1月；15(1)：49-63。

24.Llambi F、Moldoveanu T、Tait SWG、Bouchier-Hayes L、Temirov J、McCormick LL等人，“哺乳动物BCL-2蛋白家族在线粒体处相互作用的统一模型(AUnifiedModel of Mammalian BCL-2Protein Family Interactions at the Mitochondria)”《分子细胞(Mol Cell)》2011年11月18日；44(4)：517-31。

25.Greaves G、Milani M、Butterworth M、Carter RJ、Byrne DP、Eyers PA等人，“BH3-only蛋白对于MCL-1和BCL-X L的药物抑制诱导的细胞凋亡是不可缺少的(BH3-onlyproteins are dispensable for apoptosis induced by pharmacological inhibitionof both MCL-1 and BCL-X L)”《细胞死亡和分化》2018年9月5日；1。

26.Djajawi TM、Liu L、Gong J、Huang AS、Luo M、Xu Z等人，“MARCH5要求MTCH2协调MCL1：NOXA复合体的蛋白酶体转换(MARCH5 requires MTCH2 to coordinateproteasomal turnover of the MCL 1：NOXA complex)”《细胞死亡和分化》2020年2月24日；1-16。

27.Haschka MD、Karbon G、Soratroi C、O′Neill KL、Luo X、Villunger A，“MCL1/NOXA复合物的MARCH5依赖性降解决定了对抗有丝分裂药物治疗的敏感性(MARCH5-dependent degradation of MCL1/NOXA complexes defines susceptibility toantimitotic drug treatment)”《细胞死亡和分化》[互联网]。2020月2月3日[引用于2020年4月19日]；可从以下网址获得：http：//www.nature.eom/articles/s41418-020-0503-6

28.Subramanian A、Andronache A、Li Y-C、Wade M，“MARCH5泛素连接酶的抑制通过NOXA消除对BH3模拟物的MCL1依赖性抗性(Inhibition ofMARCH5 ubiquitin ligaseabrogates MCL 1-dependent resistance to BH3 mimetics via NOXA)”《肿瘤靶标(Oncotarget)》2016年2月21日；7(13)：15986-6002。

29.Arai S、Varkaris A、Nouri M、Chen S、Xie L、Balk SP，“MARCH5介导由激酶抑制剂和整合应激反应激活驱动的NOXA依赖性MCL1降解(MARCH5 mediates NOXA-dependentMCL1 degradation driven by kinase inhibitors and integrated stress responseactivation)”Macleod KF、Murphy ME编辑，《eLife》2020年6月2日；9：e54954。

30.DeWeirdt PC、Sangree AK、Hanna RE、Sanson KR、Hegde M、Strand C等人，“无单细胞克隆的等基因哺乳动物细胞系的遗传筛选(Genetic screens in isogenicmammalian cell lines without single cell cloning)”《自然通讯(Nat Commun)》2020年2月6日；11(1)：1-15。

31.Wang T、Yu H、Hughes NW、Liu B、Kendirli A、Klein K等人，“本质剖析揭示了基因网络和与致癌Ras的合成致死相互作用(Essentiality Profiling Reveals GeneNetworks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras)”《细胞》2017年2月23日；168(5)：890-903.e15。

32.Caenepeel S、Brown SP、Belmontes B、Moody G、Keegan KS、Chui D等人，“AMG176是一种选择性MCL1抑制剂，在血液肿瘤模型中单独使用或与现有疗法组合使用均有效(AMG 176，a Selective MCL l Inhibitor，is Effective in Hematological CancerModels Alone and in Combination with Established Therapies)”《癌症发现(CancerDiscov)》2018年9月25日；CD-18-0387。

33.Letai A、Bassik MC、Walensky LD、Sorcinelli MD、Weiler S、Korsmeyer SJ，“独特的BH3结构域敏化或激活线粒体细胞凋亡，用作原型癌症治疗剂(Distinct BH3domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis，serving asprototype cancer therapeutics)”《癌细胞(Cancer Cell)》2002Sep；2(3)：183-92。

34.Ley R、Ewings KE、Hadfield K、Cook SJ，“Bim的调节性磷酸化：将ERK与JNK区分(Regulatory phosphorylation of Bim：sorting out the ERK from the JNK)”《细胞死亡和分化》2005年8月；12(8)：1008-14。

35.Liu Q、Osterlund EJ、Chi X、Pogmore J、Leber B、Andrews D W，Bim通过双螺栓锁定Bcl-XL和Bcl-2而逃脱BH3-模拟抗癌药物的置换(Bim escapes displacement byBH3-mimetic anti-cancer drugs by double-bolt locking both Bcl-XL and Bcl-2.)

36.Chi X、Nguyen D、Pemberton JM、Osterlund EJ、Liu Q、Brahmbhatt H等人，“bim的羧基末端序列能够激活bax并杀死未致敏细胞(The carboxyl-terminal sequenceof bim enables bax activation and killing of unprimed cells)”

37.Castanzo DT、LaFrance B、Martin A，“AAA+ATP酶Msp1是一种具有强大解折叠酶活性的进行性蛋白质移位酶(The AAA+ATPase Msp1 is a processive proteintranslocase with robust unfoldase activity)”《美国国家科学院学报》2020年1月30日；117(26)：14970-7。

38.Li L、Zheng J、Wu X、Jiang H，“线粒体AAA-ATP酶Msp1通过双重识别机制检测错误定位的尾锚蛋白(Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism)”《EMBO报告》2019年4月1日；20(4)：e46989。

39.Wohlever ML、Mateja A、McGilvray PT、Day KJ、Keenan RJ，“Msp1是尾锚定蛋白的膜蛋白脱臼酶(Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-AnchoredProteins)”《分子细胞》2017年7月20日；67(2)：194-202.e6。

40.Hübner A、Barrett T、Flavell RA、Davis RJ，“多位点磷酸化调节Bim稳定性和细胞凋亡活性(Multisite Phosphorylation Regulates Bim Stability andApoptotic Activity)”《分子细胞》2008年5月23日；30(4)：415-25。

41.Puthalakath H、O′Reilly LA、Gunn P、Lee L、Kelly PN、Huntington ND等人，“ER应激通过激活BH3-Only蛋白Bim触发细胞凋亡(ER Stress Triggers Apoptosis byActivating BH3-Only Protein Bim)”《细胞》2007年6月29日；129(7)：1337-49。

42.Tsvetkov P、Detappe A、Cai K、Keys HR、Brune Z、Ying W等人，“线粒体代谢促进对蛋白毒性应激的适应(Mitochondrial metabolism promotes adaptation toproteotoxic stress)”《自然-化学生物学(Nat Chem Biol)》2019年7月；15(7)：681-9。

43.Schneider K、Bertolotti A，“在蛋白质质量控制的灾难中生存-从细胞到生物体(Surviving protein quality control catastrophes-from cells to organisms)”《细胞科学杂志(J Cell Sci)》2015年11月1日；128(21)：3861-9。

44.Huang HH、Ferguson ID、Thornton AM、Bastola P、Lam C、Lin Y-HT等，“蛋白酶体抑制剂诱导的调节揭示了剪接体作为多发性骨髓瘤中的特异性治疗脆弱性(Proteasome inhibitor-induced modulation reveals the spliceosome as aspecific therapeutic vulnerability in multiple myeloma)”《自然通讯》[因特网]2020年12月[引用于2020年4月24日]；11(1)。可从以下网址获得：http：//www.nature.com/articles/s41467-020-15521-4

45.Jiang L、Zhou J、Zhong D、Zhou Y、Zhang W、Wu W等人，“SMC4过表达激活TGFβ/Smad信号传导并促进胶质瘤细胞的侵袭性表型(Overexpression of SMC4 activatesTGFβ/Smad signaling and promotes aggressive phenotype in glioma cells)”《瘤形成(Oncogenesis)》2017年3月；6(3)：e301-e301。

46.Mercapide J、Cicco RLD、Castresana JS、Klein-Szanto AJP，“基质分解素-1/基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的表达解释了人星形细胞瘤细胞系的侵袭性(Stromelysin-1/matrix metalloproteinase-3(MMP-3)expression accounts for invasiveproperties of human astrocytoma cell lines)”《国际癌症杂志(Int J Cancer)》2003；106(5)：676-82。

47.Gilley J、Coffer PJ、Ham J，“FOXO转录因子直接激活bim基因表达，促进交感神经元细胞凋亡(FOXO transcription factors directly activate bim geneexpression and promote apoptosis in sympathetic neurons)”《细胞生物学杂志(JCell Biol)》2003年8月18日；162(4)：613-22。

48.Datta SR、Dudek H、Tao X、Masters S、Fu H、Gotoh Y等人，“BAD的Akt磷酸化将生存信号与细胞内在的死亡机制偶联(Phosphorylation of BAD Couples SurvivalSignals to the Cell-Intrinsic Death Machinery)”《细胞》1997月10月17日；91(2)：231-41。

49.Mason KD、Vandenberg CJ、Scott CL、Wei AH、Cory S、Huang DCS等人，“Bcl-2拮抗剂ABT-737对侵袭性Myc驱动的淋巴瘤的体内疗效(In vivo efficacy of the Bcl-2antagonist ABT-737against aggressive Myc-driven lymphomas)”《美国国家科学院学报》2008年11月18日；105(46)：17961-6。

50.Dammert MA、

51.Dai C、Liang D、Li H、Sasaki M、Dawson TM、Dawson VL，“神经保护分子的功能鉴定(Functional Identification of Neuroprotective Molecules)”Deli MA编辑，《公共科学图书馆：综合(PLoS ONE)》2010年11月24日；5(11)：e15008。

52.Zhang J、Yang J、Wang H、Sherbini O、Keuss MJ、Umanah GK等人，“AAA+ATP酶Thorase对缺血性损伤具有神经保护作用(The AAA+ATPase Thorase is neuroprotectiveagainst ischemic injury)”《脑血流与代谢杂志(J Cereb Blood Flow Metab)》2019年9月1日；39(9)：1836-48。

53.Martinou J-C、Dubois-Dauphin M、Staple JK、Rodriguez I、Frankowski H、Missotten M等人，“转基因小鼠中BCL-2的过表达保护神经元免于自然发生的细胞死亡和实验性缺血(Overexpression of BCL-2in transgenic mice protects neurons fromnaturally occurring cell death and experimental ischemia)”《神经元(Neuron)》1994月10月1日；13(4)：1017-30。

54.Parsadanian AS、Cheng Y、Keller-Peck CR、Holtzman DM、Snider WD，“Bcl-xL是出生后中枢神经系统神经元的抗细胞凋亡调节剂(Bcl-xL is anAntiapoptoticRegulator for Postnatal CNS Neurons)”《神经科学杂志(J Neurosci)》1998年2月1日；18(3)：1009-19。

55.Broughton Brad R.S.、Reutens David C.、Sobey Christopher G.，“脑缺血后的细胞凋亡机制(Apoptotic Mechanisms After Cerebral Ischemia)”《中风(Stroke)》2009年5月1日；40(5)：e33 1-9。

56.Umanah GKE、Ghasemi M、Yin X、Chang M、Kim JW、Zhang J等人，“AMPA受体表面表达受Thorase的S-亚硝基化和NSF的转亚硝基化调节(AMPA Receptor SurfaceExpression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylationof NSF.)”《细胞报告(Cell Rep)》[互联网]2020年11月3日[引用于2020年12月l 3日]；33(5)。可从以下网址获得：

https：//www.cell.com/cell-reports/abstract/S2211-1247(20)31318-8