一种多肽变体、融合蛋白及其与MSCs细胞的联合应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体提供了一种多肽变体、融合蛋白及其与MSCs细胞的联合应用。

背景技术：

肝病是全世界疾病和死亡的主要原因，仅在中国，包括病毒性肝炎(主要是乙型肝炎病毒)、非酒精性脂肪肝和酒精性肝病在内的肝脏疾病影响了大约3亿人。在肝脏疾病中，肝硬化是最为常见的表现形式之一，目前我国肝硬化的发病率呈逐年上升趋势，死亡率随之也大幅度增加。肝硬化患者出现多种并发症，最常见的临床表现是腹水和胃食管静脉曲张破裂出血，晚期并发症包括黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病、急性肾损伤和肝肾综合征(HRS)，并发症在首次出现后复发且频率增加，大多数患者在大约2年的中位时间内死亡，目前最为有效的治疗手段是肝移植，但其临床应用受到供体稀缺和免疫排斥反应的限制。因此，迫切需要有效的治疗策略来逆转肝硬化。

导致肝硬化的病因很多，目前已知的包括但不限于病毒性肝炎、酒精相关性肝病、非酒精性脂肪性肝炎等等。其中病毒性肝炎以丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)最为常见，目前对于HCV的抗病毒治疗较为成功，使得其导致肝硬化的可能性降低；然而针对HBV的治疗药物或方法仍多处于研究就得，例如免疫调节剂、病毒进入抑制剂、核心蛋白调节剂、核酸聚合物、反义寡核苷酸、CRISPR-Cas9、核酸酶和干扰RNA等等。

与病毒性肝炎主要依赖于药物治疗不同，酒精相关性肝病(ALD)最有效的治疗方法是戒酒，同时心理治疗也被广泛推荐。目前临床上也存在一些与酒精相关性肝病相关的治疗药物，包括巴氯芬，在失代偿性肝硬化患者中可减少酒精伤害；纳曲酮，可改善肝脏中生物酶的含量和活性；加巴喷丁，对患有酒精戒断症状或有酒精戒断症状风险的患者较为有效。

非酒精性脂肪性肝炎的情形较多，但主要包括肥胖和药物副作用。对于肥胖患者，通过改变饮食和生活方式来减轻体重是最为有效的途径，当然还可以辅助使用减肥药物。肝脏是人体的主要代谢器官，因而长期或大剂量服用药物会对肝脏造成损伤，如服用抗癌化疗药物使得肝硬化风险加剧。

迄今为止，有多种药物被试图用于治疗肝硬化，如细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)的选择性抑制剂、抗赖氨酰氧化酶样2(lysyl oxidase-like 2，LOXL2)的人源化单克隆抗体、半乳糖凝集素3的抑制剂、泛半胱天冬酶抑制剂等等(参见Elliot B.Tapper et al,Review article:current and emergingtherapies for the management of cirrhosis and its complications,AlimentPharmacol Ther.2022,55(9):1099-1115)。其中，间充质基质细胞(mesenchymal stromalcells，MSC)和FGF21受到广泛关注。

MSC被认为是具有自我更新能力的多能基质细胞，可以很容易地从广泛的组织(例如羊水、脐带、脂肪、骨髓和月经血)中提取并在体外扩增，MSC不表达II类亚型的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)抗原，并且含有低水平的I类亚型MHC分子；MSC还缺乏免疫检测所必需的共刺激分子，包括CD40、CD80和CD86等等，因此MSC普遍具有较低的免疫原性，可以避免受体的免疫排斥，为其同种异体应用奠定了基础。MSCs的治疗优势包括自我更新、归巢到损伤部位、免疫调节、多向分化和分泌促进受损组织修复和再生的营养因子，并且使用MSC没有任何伦理问题。自1976年首次从小鼠骨髓中分离出MSCs以来，多项基础和临床研究试验表明，MSCs可以安全有效地增强肝功能和治疗肝硬化，其作用机制大致分为三类：(1)当被引入受损肝组织时，MSCs具有分化为肝细胞或与现有肝细胞融合的潜力，使它们成为肝组织再生和修复的有用资源；(2)MSCs能够产生广泛的细胞因子和生长因子，它们还可能具有发挥旁分泌作用的能力，这有助于刺激损伤组织中内源性细胞的再增殖；(3)MSCs对许多其他类型的细胞有抑制作用，例如自然杀伤细胞(NKs)、B淋巴细胞和T淋巴细胞，这使它们能够对肝脏疾病发挥免疫调节作用(参见Lichao Yao etal,Mesenchymal stromal cells:promising treatment for liver cirrhosis,StemCell Res Ther.2022；13:308.)。截至目前，共有60项涉及MSCs治疗肝病的注册临床研究，其中45项专门针对肝硬化，包括NCT04243681、NCT01591200、NCT01875081、NCT01342250等(数据来自ClinicalTrials.gov)

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)是FGF19亚家族中的一员，其在啮齿动物和灵长类动物中的临床前表征已经确定了它在恢复肥胖或代谢稳态、减轻体重、调节肝脏和循环甘油三酯、空腹血浆胰岛素和葡萄糖以及增加能量消耗方面的作用，并且最近研究表明FGF21成为治疗肝纤维的新型细胞因子之一(参见Erik JTillman,Tim Rolph，FGF21:An Emerging Therapeutic Target for Non-AlcoholicSteatohepatitis and Related Metabolic Diseases，Front Endocrinol(Lausanne).2020，14；11:601290.)。FGF21进入体循环，它能够整合肝脏、脂肪组织、骨骼肌、胰腺和其他代谢器官的代谢，通过控制塑造细胞表型和组织代谢功能的转录程序的表达，最终在啮齿动物和灵长类动物中发挥作用，包括参与激素代谢，如介导肝胰高血糖素和甲状腺激素信号传导；抑制肝脏中的热量负担，减少脂肪生成，并增加肝脏中的脂肪氧化；介导脂肪酸氧化能力的增加和防止氧化应激损伤；通过诱导NRF2核转位抑制巨噬细胞促炎细胞因子TNFα、IL-6、IL-1β和IFN-γ的表达，从而阻断NF-κB激活；促进肝细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进表观遗传重编程为更健康的代谢表型等等。

但是天然FGF21也存在一些缺点和不足，如热稳定性差，体内半衰期短等，对此研究人员也做出了一些改进，如糖基化的FGF21变体LY2405319保持内源性FGF21的分子大小，但通过在分子中设计一个额外的二硫键和少量点突变来提高其热稳定性并减少聚集(参见Kharitonenkov A et al.Rational design of afibroblast growth factor 21-basedclinical candidate,LY2405319.PLoS One，2013，8:e58575.)；PF-05231023是一种190kDa分子，由共价连接到人源化IgG1κmAb支架的每个Fab区域的人FGF21组成，导致每个支架的FGF21分子化学计量比为2:1，可提高将血脂效果(参见Huang J et al.Development of aNovel Long-Acting Antidiabetic FGF21 Mimetic by Targeted Conjugation to aScaffold Antibody.J Pharmacol Exp Ther(2013)346:270–80)；Efruxifermin是一种92kDa Fc-FGF21融合蛋白，半衰期延长至3-3.5天(Zhen EY et al.Circulating FGF21proteolytic processing mediated by fibroblast activation protein.Biochem J(2016)473:605–14)。因此，FGF21的改造和修饰成为业内的研究重点。

为了克服上述困难，本发明提供了一种FGF21变体、融合蛋白及其与MSCs细胞的联合应用，通过对FGF21蛋白结构的改变，可提高促细胞增殖能力；与Fc片段构建融合蛋白，可延长体内半衰期，提高生物利用度；FGF21变体-Fc融合蛋白，及其与脂肪MSCs联用，可改善肝硬化症状，促进肝脏组织生理功能恢复，调节免疫因子分泌，改善肝功能指标。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明中的第一个方面提供了一种FGF21变体蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-6任一项所示。

FGF21是FGF家族的一员，表现出包括多种体外和动物模型代谢反应的药理学特征。全长FGF21长209个氨基酸，在其N末端有一个典型的信号肽，成熟的优势FGF21多肽有181个氨基酸。现有技术中对于FGF21的结构活性研究较多，如CN115109137A公开了FGF21多肽与GLP-1的双融合蛋白，可治疗脂肪肝相关疾病；US20220227825A1公开了一种FGF21的多肽变体，具体为在55、147-163、184-196位进行点突变，可改善其对肥胖、超重、代谢综合征、糖尿病、高血糖、血脂异常、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或动脉粥样硬化的调节作用；Randy Hecht等在FGF21中引入了两个特定的点突变，98位突变(L98R)可在高浓度和高温下抑制FGF21聚集，171位突变(P171G)则消除了小鼠中鉴定的FGF21的位点特异性蛋白水解裂解(参见Randy Hecht et al,Rationale-Based Engineering of a Potent Long-ActingFGF21 Analog for the Treatment of Type 2Diabetes,PLoS One，2012，7(11):e49345)。本发明中在相关现有研究的基础上，先后对I31，Q46，E78，K97，Y111，L126，Y135，D155，P161，L165，P173，G179，A182，V188，P199，R203，P205等多个潜在活性位点进行研究。此外，我们尝试在N端和C端进行截短尝试，发现N端的信号肽部分可以去除，对活性影响不大，但是C端氨基酸结构却对FGF21的活性至关重要，去除后促细胞增殖能力大为降低，这与Radmila Micanovic等的研究结果一致，Radmila Micanovic等发现FGF21折叠成β-三叶形核心区域，具有无序的N和C末端，N末端去除多达17个氨基酸对与βKlotho的相互作用没有影响，但是从C末端缺失6个氨基酸则显著影响活性(参见Radmila Micanovic et al,Different roles of N-and C-termini in the functional activity of FGF21,J CellPhysiol,2009,219(2):227-34)。

本发明的第二个方面，提供了一种FGF21变体-Fc融合蛋白，其特征在于，所述FGF21变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

进一步的，所述融合蛋白中包括Fc片段，所述Fc片段氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

进一步的，所述融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

FGF21蛋白分子量较小，导致成熟的FGF蛋白在体内半衰期较短，因此将其与其他生物大分子构建融合蛋白成为一种不错的选择，为此WO2021139744A1、WO2022194260A1、WO2019154189A1、CN111195234A、CN111087475A等均公开了构建FGF21融合蛋白。本发明中选用人Fc片段构建融合蛋白，不仅能够延长FGF21的体内半衰期，提高生物利用度，同时由于使用人Fc片段，还可以降低免疫排斥反应，防止毒副作用发生。

本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，包括所述的FGF21变体-Fc融合蛋白和MSCs细胞

有研究表明，MSCs细胞对于肝硬化或肝纤维化具有修复和抑制作用，但是MSCs细胞的作用机制复杂，修复作用并不稳定，难以产生持续可预期的治疗效果；并且，由于FGF21的体内半衰期短，生物代谢快，频繁多次使用易产生副作用，降低治疗效果，因此本发明创造性的提出将FGF21变体-Fc融合蛋白与MSCs组合使用，可产生协同治疗效果。

进一步的，所述MSCs细胞来源于脂肪组织、脐带、脐带血和/或牙髓组织。

进一步的，所述MSCs细胞来源于脂肪组织，其制备方法包括：将脂肪组织剪碎匀浆，经胰酶消化后，离心收集细胞；接种于含10％FBS的新鲜培养基中，37℃、5％CO

本发明的第四方面提供了一种所述FGF21变体-Fc融合蛋白或所述的药物组合物在制备治疗肝硬化药物中的应用。

进一步的，所述肝硬化为四氯化碳诱导动物肝硬化。

有益效果

本发明提供了一种FGF21变体、融合蛋白及其与MSCs细胞的联合应用，具有以下优势：

(1)提供了一种FGF21变体蛋白，可提高促细胞增殖能力；

(2)所述FGF21变体蛋白与Fc片段组成融合蛋白后，可大幅度提供体内半衰期；

(3)FGF21变体-Fc融合蛋白可显著改善CCl

(4)FGF21变体-Fc融合蛋白与MSCs细胞联用，可强化治疗效果，促进肝组织恢复。

附图说明

图1：FGF21变体设计；

图2：FGF21变体促细胞增殖能力；

图3：融合蛋白核苷酸序列结构；

图4：大鼠肝脏组织HE染色；

图5：大鼠肝脏组织IL-10表达水平；

图6：大鼠肝脏组织TGF-β表达水平。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。

以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1FGF-21突变体的设计和筛选

1.1FGF-21突变体的设计

在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上检索并获得人FGF野生型序列，GenBank号AAH18404.1，然后参考已有的对于FGF21的位点突变研究，并通过线预测工具IonCom分析其氨基酸序列，确定出I31，Q46，E78，K97，Y111，L126，Y135，D155，P161，L165，P173，G179，A182，V188，P199，R203，P205等多个潜在活性位点，然后根据各个活性位点的分布和初步实验结果，设计FGF21的突变体结构，如图1所示，其中野生型氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，突变体1B-05氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，突变体1E-01氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，突变体2A-03氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，突变体2F-07氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示，突变体3D-02氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。通过全合成方式获得所述突变体蛋白，用于后续实验。

1.2FGF-21突变体的活性检测

为验证FGF-21突变体的生物活性，本发明中选用人正常肝细胞细胞系L02作为实验对象，考察FGF-21突变体的促细胞增殖能力。

复苏L02细胞，37℃、5％CO

实施例2FGF21融合蛋白

2.1FGF21融合蛋白的设计和制备

本实施例中以2F-07突变体与人Fc片段构建融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。所述融合蛋白经过密码子优化获得其编码核苷酸序列，如图3所示。

通过PCR方式扩增所述核苷酸序列，并在其两端引入Nhe I和Sal I酶切位点，利用酶切连接反应将所述核苷酸序列导入UCOE载体中；利用Lipofectamine3000试剂盒(购自美国Invitrogen公司)将所述载体转入CHO细胞中，操作步骤按照试剂盒说明书进行；在37℃、5％CO

2.2融合蛋白延长体内半衰期

选取6-8周龄健康Balb/c小鼠，雌雄各半，正常饲喂一周适应环境。尾静脉注射天然FGF21、2F-07FGF21和2F-07FGF21-Fc融合蛋白，然后使用ELISA发检测动物血液中的目标药物浓度，绘制浓度-时间药代动力学曲线，计算药物半衰期，结果如表1所示,与Fc片段结合为融合蛋白后，可显著延长药物半衰期，提高生物利用度。

表1药代动力学测定

实施例3脂肪组织间充质干细胞制备

抽取健康志愿者脂肪组织，用冰预冷的PBS缓冲液冲洗3次，剪碎并匀浆，用0.1％的I型胶原酶消化15-25min，过300目筛网，于4℃条件下1200g离心5min，弃去上层脂肪和上清液，沉淀先用PBS洗涤3次；用含10％FBS的DMEM培养基洗涤，1500g离心收集沉淀，接种于培养瓶内，于37℃、5％CO

实施例4动物水平改善肝硬化症状

4.1动物模型制备与给药

选取清洁级雌雄各半SD大鼠，正常饲喂1周适应环境。将CCl

大鼠造模成功后，随机分为4组，每组10只，分别为：FGF21组，每2天以1.0mg/kg剂量静脉注射2F-07FGF21-Fc融合蛋白；MSCs组，每周注射1×10

4.2肝组织形态学观察

治疗4周后，脱颈处死大鼠，立即取出肝组织，肝组织经10％中性甲醛固定后，进行石蜡包埋，制成0.5μm切片，进行HE染色，使用光学显微镜进行组织病理学观察。

如图4所示，肝硬化模型对照组中可见变性坏死的肝细胞，组织中出现空泡，而再生的肝脏细胞体积变大，细胞核大且深染，肝脏组织被炎性细胞浸润以及不同程度的小胆管增生；经过治疗后，肝组织组织形态出现改善，这种趋势在联合组中更明显，肝组织中炎症减轻，肝细胞排列有序，空泡减少，胆小管增生程度减轻，肝组织生理结构逐渐恢复。

4.3肝功能检测

取大鼠外周血，3000g离心15min收集血清。使用血清肝功能试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)检测血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)和血清白蛋白(Serum Albumin，ALB)含量。

结果如表2所示，使用本发明中所述FGF21-Fc融合蛋白或MSCs细胞能够有效改善肝功能指标，但是使用FGF21-Fc融合蛋白似乎更有效，可能是本发明中所提供的FGF21-Fc融合蛋白，相比于野生型FGF21活性得到强化，且与Fc片段的组合使得其体内半衰期延长，提高了生物利用度，而单纯使用MSCs细胞则面临诸多限制，难以有效发挥作用；使用上述两种试剂的联合组，发挥了更有效的抗肿瘤功能，联合组的整体肝功能指标有大幅度改善，说明这种方式发挥了令人意想不到的协同作用。

表2血清肝功能检测

4.4肝组织细胞因子表达

处死大鼠后，取肝组织加入RIPA裂解液，4℃下研磨匀浆，3000rpm离心10min，小心吸取上清液置于一新的离心管中制备成10％的组织匀浆，放于4℃冰箱中保存。使用ELISA试剂盒(购自Invivogen公司)检测组织匀浆中IL-10和TGF-β含量，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

IL-10是一种纤维化抑制因子，可有效抑制组织器官的纤维化进程，保持其正常生理状态和生理功能，本实施例中结果如图5显示，经过治疗后，大鼠肝脏组织中的IL-10表达水平上升，从而有助于缓解肝硬化症状，其中FGF21融合蛋白和联合组的改善程度较大。

与IL-10不同的是，TGF-β被认为是一种主要的促纤维化因子，在皮肤、肾脏、肝脏和肺纤维化中均发挥了重要促进作用，因此其表达水平也常常被视为组织纤维化的生物标志物。本实施例中，如图6所示，经过治疗后大鼠肝脏组织中TGF-β表达水平有不同程度的降低，并且在联合组中得到最为显著的抑制，说明这种治疗方式能够显著抑制肝脏纤维化，防止肝硬化的发生。