一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

背景技术

抗菌肽( Antimicrobi al peptides， AMPs)是生物进化上最古老的抗微生物感染多肽，是从原核生物到人等各种生物先天性免疫调节的重要组成部分，是具有直接抗菌和菌群调节作用的固有免疫效应分子。在历史上，最先认识到抗菌肽的抗菌功能，因此最先将其命名为抗菌肽。随着对该类物质结构和功能的逐步深入认识，近年来已经发现抗菌肽在调节机体免疫应答方面有着非常重要的作用，很多抗菌肽是先天性免疫和获得性免疫的桥梁。抗菌肽通过直接杀菌/抑菌作用和提高机体免疫应答水平而发挥其抗感染作用，这是抗菌肽优于抗菌素之处。因此，目前又将抗菌肽称为免疫防御肽。

目前的研究表明，抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗原虫、调节机体免疫力等活性，并且不容易产生耐药性。抗菌肽具有多种免疫调节作用，包括调节炎症反应、趋化免疫细胞、促进细胞分化、激活先天性和获得性免疫系统等。抗菌肽的多种免疫调节特性使得其有望成为治疗感染疾病和免疫疾病的药物。

枯草三十七肽的英文名称为Subl ancin，由37个氨基酸残基组成，分子量为3879.8 D a（按2018年国际相对原子质量），结构中由五个半胱氨酸形成两个二硫键，结构稳定，对高温、酸碱、胃蛋白酶具有良好的抵抗力；实验表明，枯草三十七肽能够增强巨噬细胞R AW264.7的吞噬功能。临床试验表明， 枯草三十七肽能够增强畜禽及水产动物的免疫功能，提高疫苗的免疫效果，安全性高，无药物残留。

国内外对枯草三十七肽也有一些研究，1998年，P aik SH等对枯草芽孢杆菌168产生的枯草三十七肽的化学和生物学结构特征及转运蛋白基因的鉴定进行了研究，得出枯草三十七肽是由37个氨基酸残基组成的多肽，含有两个二硫键，其水溶液在室温条件下存放两年，没有发生降解和失活，可见其比较稳定。枯草三十七肽虽具有很好的替代传统抗生素的潜力，但枯草芽孢杆菌产生枯草三十七肽的产量很低，不能满足大规模使用的需求。所以，国内外学者一直致力于提高枯草三十七肽产量的研究，Shengyue Ji等通过引入三个特异性启动子，重组枯草芽孢杆菌的操纵子，来提高枯草三十七肽的产量，最终使重组枯草芽孢杆菌产生枯草三十七肽的产量提高到642 mg/L。姬生妖在5 L发酵罐中，采用筛选到的最优培养条件对重组菌株进行培养，枯草三十七肽的产量被进一步提高到968 mg/L。也有专利CN 112029697通过重组枯草芽孢杆菌JY011802发酵将枯草三十七肽的产量提高到3100mg/L。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中利用枯草芽孢杆菌产生枯草三十七肽的产量低，不能满足大规模使用的需求。

为解决该技术问题，本发明提供一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，所述方法包括如下步骤：将枯草三十七肽的发酵菌种枯草芽孢杆菌经复壮活化、一级种子、二级种子、30 L种子罐、3 m³种子罐、30 m³发酵罐发酵、在30 m³发酵过程中添加补料、放罐：

（1）枯草芽孢杆菌的活化：从-80 ℃取出枯草芽孢杆菌菌种，复温后，采用划线接种到营养肉汤琼脂平板上，35 ℃培养12小时；

（2）一级种子：从平板上，挑取单个菌落，接种于一级种子培养基中，装量30 mL/150 mL，于180 r/min摇床中37℃培养6～8 h，测定发酵液的OD值，达到1.6～1.8后，得到一级种子液；

（3）二级种子：从一级种子液中，分别吸取1mL，接种于两个二级种子培养基中，装量 100 mL/500 mL，于220 r/min摇床中37℃培养5～7 h，测定发酵液的OD值，达到1.7～2.0后，得到二级种子液；

（4）30 L种子罐：把二级种子液按1 %的接种量接种到装有15 L的种子培养基的30L种子罐中，以160 r/min、罐压0.05 MP a，通风量1：1，发酵5～7 h，测定发酵液的OD值达3.2～3.6后，得到30 L种子罐液；

（5）3 m³种子罐：把30 L种子罐液按1 %的接种量接种到装有1.5 m³的种子培养基的3 m³种子罐中，以160 r/min、罐压0.05MPa,通风量1：1，发酵5～7 h，测定发酵液的OD值达3.5～4.0后，得到产枯草三十七肽的枯草芽孢杆菌种子液；

（6）在30 m³发酵过程中流加补料：在其30 m³发酵过程中根据发酵液的OD值与枯草三十七肽的含量变化流加补料；

（7）放罐：放罐时间的确定依据为，发酵32 h后，每0.5 h监测一次枯草三十七肽含量，两次枯草三十七肽含量增量小于50 mg/L时，立刻放罐，停止发酵，得到枯草三十七肽发酵液。

所述菌种活化培养基配方为牛肉膏2 g，酵母膏2 g，蛋白胨10 g，N aCl 5 g，琼脂15 g，加水定容至1000 mL调pH为7.4；一级种子培养基配方、二级种子培养基配方均为牛肉膏2 g，酵母膏2 g，蛋白胨10 g，N aCl 5 g，琼脂15 g，加水定容至1000 mL调pH为7.4；30 L种子罐、3 m³培养基配方均为酵母浸膏13 g/L，蛋白胨10 g/L，水溶性玉米淀粉4 g/L，玉米浆8 g/L，葡萄糖5 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，氯化钠2 g/L，硫酸镁 0.5 g/L，其余为饮用水。

3.如权利要求1所述的高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，其特征在于，所述 30 m³发酵培养基中酵母浸膏浓度为5～10 g/L，葡萄糖浓度为0.2～2 g/L，水溶性玉米淀粉浓度为2～10 g/L，玉米浆浓度为8～20 g/L，氯化铵浓度为1～2 g/L，氯化钠浓度为1～3 g/L，消泡剂浓度为2～5 g/L，其余为饮用水；

所述补料包含葡萄糖浓度为5～15 g/L，玉米浆浓度为4～15 g/L，其余为饮用水。

所述培养基加入发酵罐中的消杀时间为8～12 min。

所述步骤（6）的流加补料方式：在产枯草三十七肽前期根据发酵液OD值调整流加补料量，在产枯草三十七肽中期与后期根据发酵液中枯草三十七肽的含量来调整流加补料量；具体步骤如下：

a产枯草三十七肽前期：连续流加补料，具体为，发酵开始4 ～18 h，根据每2 h监测发酵液OD情况流加补料，OD值在2～20之间时，流加补料速率为7～8 mL/L·h；OD值在20～40之间时，流加补料速率为8～10 mL/L·h；OD值在40～60之间时，流加补料速率为 10～12 mL/L·h； 发酵液OD值在60～80之间时，流加补料速率13～15 mL/L·h；OD值在80～110之间时，流加补料速率18～20 mL/L·h；

b产枯草三十七肽中期：连续流加补料，具体为，发酵18～28 h之间，根据每2 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，流加补料，枯草三十七肽含量在200～2000 mg/L时，流加补料速率为20～25 mL/L·h；枯草三十七肽含量在2000～3000 mg/L时，流加补料速率为25～30 mL/L·h；枯草三十七肽含量在3000～5000 mg/L时，流加补料速率为30～40 mL/L·h；枯草三十七肽含量在5000 mg/L以上时，流加补料速率为40～50 mL/L·h；

c产枯草三十七肽末期：连续流加补料，具体为，发酵28 h至放罐，根据每1 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，流加补料，枯草三十七肽含量在6000 mg/L以下时，流加补料速率为50～55 mL/L·h；枯草三十七肽含量在6000～8000 mg/L时，流加补料速率为60～65 mL/L·h。

所述步骤（6）的流加补料步骤具体如下：

a产枯草三十七肽前期：间断流加补料，具体为，发酵4～18 h，根据每2 h监测发酵液OD情况按次流加补料，OD值在2～20之间时，流加补料300 mL；OD值在20～40之间时，流加补料380 mL；OD值在40～60之间时，流加补料440 mL；发酵液OD值在60～80之间时，流加补料560 mL；OD值在80～110之间时，流加补料760 mL；

b产枯草三十七肽中期：间断流加补料，具体为，发酵18～28 h之间，根据每2 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，按次流加补料，枯草三十七肽含量在200～2000 mg/L时，流加补料900 mL；枯草三十七肽含量在2000～3000 mg/L时，流加补料1100 mL；枯草三十七肽含量在3000～5000 mg/L时，流加补料1400 mL；枯草三十七肽含量在5000 mg/L以上时，流加补料1800 mL；

c产枯草三十七肽末期：间断流加补料，具体为，发酵28 h至放罐，根据每1 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，按次流加补料，枯草三十七肽含量在6000 mg/L以下时，流加补料1050 mL；枯草三十七肽含量在6000～8000 mg/L时，流加补料1200 mL。

所述步骤（6）的流加补料步骤具体为：

连续流加补料，具体为，从发酵4 h后开始流加，速度为20～30 mL/L·h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种适合工业化高密度发酵枯草三十七肽的方法，将枯草三十七肽的发酵菌种枯草芽孢杆菌（B acillus subtilisCGMCC No.13941）经复壮活化、一级种子、二级种子、30 L种子罐、3 m³种子罐、30 m³发酵罐发酵、在30 m³发酵过程中流加补料、放罐，采用本发明的方法进行枯草三十七肽（Sublancin）的生产，可以提高发酵液中枯草三十七肽的含量，缩短发酵时间，提高生产效率。

附图说明

图1为枯草三十七肽高密度发酵工业化生产流程图。

图2为枯草三十七肽的一级结构示意图。

图3为枯草三十七肽的二级结构示意图。

图4为枯草三十七肽标准溶液的高效液相色谱图。

图5为发酵液中枯草三十七肽的高效液相色谱图。

图6为枯草三十七肽标准溶液的高效液相色谱图（125μg/mL）。

具体实施方式

下面将本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本说明书中没有特别说明的发酵条件及方法均为常规方法，包括培养基均为常规灭菌后的培养基。

制备例

本制备例用于说明产枯草三十七肽的枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法。

如图1~图6所示，本发明提供一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，所述方法包括如下步骤：将枯草三十七肽的发酵菌种枯草芽孢杆菌（B acillus subtilisCGMCC No.13941）经菌种复壮活化、一级种子、二级种子、30 L种子罐、3 m³种子罐、30 m³发酵罐发酵、在30 m³发酵过程中流加补料、放罐：

（1）枯草芽孢杆菌的活化：从-80 ℃取出枯草芽孢杆菌菌种，复温后，采用划线接种到营养肉汤琼脂平板上，35 ℃培养12 h；

（2）一级种子：从平板上，挑取单个菌落，接种于一级种子培养基中，装量30 mL/150 mL,于180 r/min摇床中37℃培养6～8 h，测定发酵液的OD值，达到1.6～1.8后，得到一级种子液；

（3）二级种子：从一级种子液中，分别吸取1 mL，接种于两个二级种子培养基中，装量 100 mL /500 mL，于220r/min摇床中37℃培养5～7 h，测定发酵液的OD值，达到1.7～2.0后，得到二级种子液；

（4）30 L种子罐：把二级种子液按1%的接种量接种到装有15 L的种子培养基的30L种子罐中，以160 r/min、罐压0.05 MP a，通风量1：1，发酵5～7 h，测定发酵液的OD值达3.2～3.6后，得到30 L种子罐液；

（5）3 m³种子罐：把30 L种子罐液按1%的接种量接种到装有1.5 m³的种子培养基的3 m³种子罐中，以160 r/min、罐压0.05 Mp a，通风量1：1，发酵5～7 h，测定发酵液的OD值达3.5～4.0后，得到产枯草三十七肽的枯草芽孢杆菌种子液；

（6）在30 m³发酵过程中流加补料：在其30 m³发酵过程中根据发酵液的OD值与枯草三十七肽的含量变化流加补料；

（7）放罐：放罐时间的确定依据为，发酵32 h后，每0.5 h监测一次枯草三十七肽含量，两次枯草三十七肽含量增量小于50 mg/L时，立刻放罐，停止发酵，得到枯草三十七肽发酵液。

菌种活化培养基配方为牛肉膏2 g，酵母膏2 g，蛋白胨10 g，N aCl 5 g，琼脂15g，加水定容至1000 mL调pH为7.4。一级种子培养基配方、二级种子培养基配方均为牛肉膏2g，酵母膏 2 g，蛋白胨10 g，N aCl 5 g，琼脂15 g，加水定容至1000 ml调pH为7.4。30 L种子罐、3 m³培养基配方均为酵母浸膏13 g/L，蛋白胨10 g/L，水溶性玉米淀粉4 g/L，玉米浆8 g/L，L，葡萄糖5 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，氯化钠2 g/L，硫酸镁 0.5 g/L，其余为饮用水。灭菌条件均为121 ℃，30 min。

所述30 m³发酵培养基中酵母浸膏浓度为5～10 g/L，葡萄糖浓度为0.2～2 g/L，水溶性玉米淀粉浓度为2～10 g/L，玉米浆浓度为8～20 g/L，氯化铵浓度为1～2 g/L，氯化钠浓度为1～3 g/L，消泡剂浓度为2～5 g/L，其余为饮用水；

所述补料包含葡萄糖浓度为5～15 g/L，玉米浆浓度为4～15 g/L，其余为饮用水。

所述培养基加入发酵罐中的消杀时间为8～12 min，如8 min，10 min，12 min。

实施例1

本实施例用于说明一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

30 m³发酵培养基配方为酵母浸膏8 g/L、葡萄糖1 g/L、水溶性玉米淀粉5 g/L、玉米浆13 g/L、氯化铵1.5 g/L、氯化钠2 g/L、消泡剂3 g/L，其余为饮用水。

补料配方为葡萄糖10 g/L、玉米浆8 g/L，其余为饮用水，pH调至7.2～7.6之间；补料灭菌温度为115 ℃，灭菌20 min。

发酵前发酵罐消杀 将20 m³发酵培养基加入到30 m³发酵罐中，pH调至7.2～7.6之间，通蒸汽115 ℃，灭菌10 min。

将制备的产枯草三十七肽的枯草芽孢杆菌种子液按1%的接种量接种，发酵条件为：温度为37 ℃，通风比为1∶0.5，转速为180 r/min，罐压0.05 MPa。

流加补料方式

所述制备例步骤（6）的流加补料步骤如下：

a产枯草三十七肽前期：连续流加补料，具体为，发酵开始4～18 h，根据每2 h监测发酵液OD情况流加补料，OD值在2～20之间时，流加补料速率为7～8 mL/L·h；OD值在 20～40之间时，流加补料速率为8～10 mL/L·h；OD值在40～60之间时，流加补料速率为10～12 mL/L·h； 发酵液OD值在60～80之间时，流加补料速率13～15 mL/L·h；OD值在80～110之间时，流加补料速率18～20 mL/L·h；

b产枯草三十七肽中期：连续流加补料，具体为，发酵18～28 h之间，根据每2 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，流加补料，枯草三十七肽含量在200～2000 mg/L时，流加补料速率为20～25 mL/L·h；枯草三十七肽含量在2000～3000 mg/L时，流加补料速率为25～30 mL/L·h； 枯草三十七肽含量在2000～3000 mg/L时，流加补料速率为30～40 mL/L·h；枯草三十七肽含量在5000 mg/L以上时，流加补料速率为40～50 mL/L·h；

c产枯草三十七肽末期：连续流加补料，具体为，发酵28 h至放罐，根据每1 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，流加补料，枯草三十七肽含量在6000 mg/L以下时，流加补料速率为50～55 mL/L·h；枯草三十七肽含量在6000～8000 mg/L时，流加补料速率为60～65 mL/L·h。

放罐时间的确定：发酵32 h后，每0.5 h监测一次枯草三十七肽含量，两次枯草三十七肽含量增量小于50 mg/L时，立刻放罐，停止发酵，得到枯草三十七肽发酵液。

记录18 h和放罐时发酵液的OD值与枯草三十七肽含量，并记录发酵时间，结果见表1。

实施例2

本实施例用于说明一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

30 m³发酵培养基配方为酵母浸膏10 g/L、葡萄糖0.2 g/L、水溶性玉米淀粉2 g/L、玉米浆16 g/L、氯化铵1 g/L、氯化钠1 g/L、消泡剂2 g/L，其余为饮用水；

补料配方为葡萄糖5 g/L、玉米浆15 g/L，其余为饮用水，pH调至7.2～7.6之间；补料灭菌温度为115 ℃，灭菌20 min。

发酵前发酵罐消杀 将20 m³发酵培养基加入到30 m³发酵罐中，pH调至7.2～7.6之间，通蒸汽121 ℃，灭菌30 min。

将制备的产枯草三十七肽的枯草芽孢杆菌种子液按1.0 %的接种量接种，发酵条件为：温度为37 ℃，通风比为1∶0.5，转速为180 r/min，罐压0.05 MPa。

流加补料方式

所述制备例步骤（6）的流加补料步骤如下：

a产枯草三十七肽前期：连续流加补料，具体为，发酵开始4～18 h，根据每2 h监测发酵液OD情况流加补料，OD值在2～20之间时，流加补料速率为7～8 mL/L·h；OD值在 20～40之间时，流加补料速率为8～10 mL/L·h；OD值在40～60之间时，流加补料速率为10～12 mL/L·h；发酵液OD值在60～80之间时，流加补料速率13～15 mL/L·h；OD值在80～110之间时，流加补料速率18～20 mL/L·h；

b产枯草三十七肽中期：连续流加补料，具体为，发酵18～28 h之间，根据每2 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，流加补料，枯草三十七肽含量在200～2000 mg/L时，流加补料速率为20～25 mL/L·h；枯草三十七肽含量在2000～3000 mg/L时，流加补料速率为25～30 mL/L·h； 枯草三十七肽含量在3000～5000 mg/L时，流加补料速率为30～40 mL/L·h；枯草三十七肽含量在5000 mg/L以上时，流加补料速率为40～50 mL/L·h；

c产枯草三十七肽末期：连续流加补料，具体为，发酵28 h至放罐，根据每1 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，流加补料，枯草三十七肽含量在6000 mg/L以下时，流加补料速率为50～55 mL/L·h；枯草三十七肽含量在6000～8000 mg/L时，流加补料速率为60～65 mL/L·h。

放罐时间的确定：发酵32 h后，每0.5 h监测一次枯草三十七肽含量，两次枯草三十七肽含量增量小于50 mg/L时，立刻放罐，停止发酵，得到枯草三十七肽发酵液。

记录18 h和放罐时发酵液的OD值与枯草三十七肽含量，并记录发酵时间，结果见表1。

实施例3

本实施例用于说明一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

30 m³发酵培养基配方为酵母浸膏5 g/L、葡萄糖2 g/L、水溶性玉米淀粉10 g/L、玉米浆12 g/L、氯化铵2 g/L、氯化钠3 g/L、消泡剂5 g/L，其余为饮用水。

补料配方为葡萄糖15 g/L、玉米浆4 g/L，其余为饮用水，pH调至7.2～7.6之间，补料灭菌温度为115 ℃，灭菌20 min。

发酵前发酵罐消杀 将20 m³发酵培养基加入到30 m³发酵罐中，pH调至7.2～7.6之间，通蒸汽121 ℃，灭菌30 min。

将制备的产枯草三十七肽的枯草芽孢杆菌种子液按1.0 %的接种量接种，发酵条件为：温度为37 ℃，通风比为1∶0.5，转速为180 r/min，罐压0.05 MP a。

流加补料方式

所述制备例步骤（6）的流加补料步骤如下：

a产枯草三十七肽前期：连续流加补料，具体为，发酵开始4～18 h，根据每2 h监测发酵液OD情况流加补料，OD值在2～20之间时，流加补料速率为7～8 mL/L·h；OD值在 20～40之间时，流加补料速率为8～10 mL/L·h；OD值在40～60之间时，流加补料速率为10～12 mL/L·h； 发酵液OD值在60～80之间时，流加补料速率13～15 mL/L·h；OD值在80～110之间时，流加补料速率18～20 mL/L·h；

b产枯草三十七肽中期：连续流加补料，具体为，发酵18～28 h之间，根据每2 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，流加补料，枯草三十七肽含量在200～2000 mg/L时，流加补料速率为20～25 mL/L·h；枯草三十七肽含量在2000～3000 mg/L时，流加补料速率为25～30 mL/L·h； 枯草三十七肽含量在3000～5000 mg/L时，流加补料速率为30～40 mL/L·h；枯草三十七肽含量在5000 mg/L以上时，流加补料速率为40～50 mL/L·h；

c产枯草三十七肽末期：连续流加补料，具体为，发酵28 h至放罐，根据每1 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，流加补料，枯草三十七肽含量在6000 mg/L以下时，流加补料速率为50～55 mL/L·h；枯草三十七肽含量在6000～8000 mg/L时，流加补料速率为60～65 mL/L·h。

放罐时间的确定：发酵32 h后，每0.5 h监测一次枯草三十七肽含量，两次枯草三十七肽含量增量小于50 mg/L时，立刻放罐，停止发酵，得到枯草三十七肽发酵液。

记录18 h和放罐时发酵液的OD值与枯草三十七肽含量，并记录发酵时间，结果见表1。

实施例4

本实施例用于说明一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

按照实施例1的方法进行枯草三十七肽的高密度发酵工业化生产，不同的是所述制备例步骤（6）的流加补料步骤，是按次直接加入，具体见下：

a产枯草三十七肽前期：间断流加补料，具体为，发酵4～18 h，根据每2 h监测发酵液OD情况按次流加补料，OD值在2～20之间时，流加补料300 mL；OD值在20～40之间时，流加补料380 mL；OD值在40～60之间时，流加补料440 mL；发酵液OD值在60～80之间时，流加补料560 mL；OD值在80～110之间时，流加补料760 mL；

b产枯草三十七肽中期：间断流加补料，具体为，发酵18～28 h之间，根据每2 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，按次流加补料，枯草三十七肽含量在200～2000 mg/L时，流加补料900 mL；枯草三十七肽含量在2000～3000 mg/L时，流加补料1100 mL； 枯草三十七肽含量在3000～5000 mg/L时，流加补料1400 mL；枯草三十七肽含量在5000 mg/L以上时，流加补料1800 mL；

c产枯草三十七肽末期：间断流加补料，具体为，发酵28 h至放罐，根据每1 h监测发酵液中枯草三十七肽含量情况，按次流加补料，枯草三十七肽含量在6000 mg/L以下时，流加补料1050 mL；枯草三十七肽含量在6000～8000 mg/L时，流加补料1200 mL。

放罐时间的确定：发酵32 h后，每0.5 h监测一次枯草三十七肽含量，两次枯草三十七肽含量增量小于50 mg/L时，立刻放罐，停止发酵，得到枯草三十七肽发酵液。

记录18 h和放罐时发酵液的OD值与枯草三十七肽含量，并记录发酵时间，结果见表1。

实施例5

本实施例用于说明一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

按照实施例1的方法进行枯草三十七肽的高密度发酵工业化生产，不同的是所述制备例步骤（6）的流加补料步骤为，从发酵4 h后开始流加补料，流加补料速率为20～30mL/L·h。

记录18 h和放罐时发酵液的OD值与枯草三十七肽含量，并记录发酵时间，结果见表1。

实施例6

本实施例用于说明一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

按照实施例1的方法进行枯草三十七肽的高密度发酵工业化生产，不同的是不进行流加补料。

记录18 h和放罐时发酵液的OD值与枯草三十七肽含量，并记录发酵时间，结果见表1。

实施例7

本实施例用于说明一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

按照实施例1的方法进行枯草三十七肽的高密度发酵工业化生产，不同的是30 m³发酵罐培养基和补料配方，本实施例30 m³发酵罐培养基配方为水溶性玉米淀粉30.2 g/L，蛋白胨23.6 g/L，玉米浆18.2 g/L，磷酸氢二钾5 g/L，硫酸镁10 g/L，其余为饮用水。

补料配方为葡萄糖10 g/L，酵母浸粉8 g/L，其余为饮用水。

记录18 h和放罐时发酵液的OD值与枯草三十七肽含量，并记录发酵时间，结果见表1。

实施例8

本实施例用于说明一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

按照实施例4的方法进行枯草三十七肽的高密度发酵工业化生产，不同的是30 m³发酵罐培养基和补料配方，本实施例30 m³发酵罐培养基配方为水溶性玉米淀粉30.2 g/L，蛋白胨23.6 g/L，玉米浆18.2 g/L，磷酸氢二钾5 g/L，硫酸镁10 g/L，其余为饮用水。

补料配方为葡萄糖10 g/L，酵母浸粉8 g/L，其余为饮用水。

记录18 h和放罐时发酵液的OD值与枯草三十七肽含量，并记录发酵时间，结果见表1。

通过表1的结果可以看出，在产枯草三十七肽的枯草芽孢杆菌的高密度工业化发酵工程中采用本发明优选的发酵培养基和补料培养基，以及优选的流加补料方式，可以提高发酵液中枯草三十七肽的含量，缩短发酵时间。

实施例9

本实施例用于说明发酵液的OD值的检测方法。

发酵液的OD值采用紫外分光光度计进行测定，选用波长630 nm，蒸馏水为空白对照，将新鲜取得的发酵液用蒸馏水稀释若干倍，使得稀释后的液体吸光度在0.1～1.0之间，发酵液OD值为测得的吸光度乘以相应的稀释比例。

实施例10

本实施例用于说明发酵液中枯草三十七肽含量的检测方法。

发酵液中的枯草三十七肽含量采用高效液相色谱进行测定。

A.1 原理

发酵液中的枯草三十七肽经离心后，用高效液相色谱仪反相色谱系统分离，紫外检测器或二极管阵列检测器测定，外标法定量。

A.2 试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

A.2.1 水：GB/T 6682，一级。

A.2.2 三氟乙酸：色谱纯。

A.2.3 乙腈：色谱纯。

A.2.4 流动相 A：移取1 mL三氟乙酸（ A.2.2），加入1000 mL水中，过0.22 μm水相滤膜，脱气10 min，密封备用。

A.2.5 流动相B：量取乙腈（ A.2.3）800 mL，加入200 mL水，混匀，再加入三氟乙酸（ A.2.2） 0.85 mL混匀，过0.22 μm有机相滤膜，脱气10 min，密封备用。

A.2.6 枯草三十七肽对照品：含量99.30 %±0.22 %。

A.2.7 枯草三十七肽标准储备溶液：准确称取枯草三十七肽对照品（ A.2.6）350mg（精确至0.01 mg），置于10 mL离心管中，加入5 mL水，于旋涡混合器上振荡3 min～5min，完全溶解后转移至50 mL容量瓶中，用水清洗离心管3次，清洗液一并移入容量瓶中，继续超声15 min～30 min，用水定容，摇匀。该溶液枯草三十七肽浓度为7000 μg/mL。2 ℃～8℃密封保存，有效期7天。

A.2.8 枯草三十七肽标准系列溶液：准确量取枯草三十七肽标准储备溶液（A.2.7）适量，用水稀释，配制成浓度分别为50μg/mL ，300μg/mL，875 μg/mL、1750 μg/mL、3500 μg/mL、7000 μg/mL枯草三十七肽标准系列溶液，临用现配。

A.2.9 滤膜：0.22 μm，水相和有机相。

A.3 仪器设备

A.3.1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

A.3.2 超声波清洗器。

A.3.3 旋涡混合器。

A.3.4 离心机：转速不低于12 000 r/min。

A.4 试验步骤。

A.4.1 试样溶液制备

平行做两份试验；取新鲜发酵液适量于离心管中，12 000 r/min离心2 min，用注射器吸取上清液约2.5 mL，过0.22 μm滤膜，弃去前1 mL滤液，接取后续滤液于样品瓶中，供高效液相色谱测定；若发酵液中枯草三十七肽含量>1000 μg/mL ，则将离心后的上清液用水稀释10倍后，用注射器吸取上清液约2.5 mL，过0.22 μm滤膜，弃去前1 mL滤液，接取后续滤液于样品瓶中，供高效液相色谱测定。

A.4.2 测定。

A.4.2.1 高效液相色谱参考条件。

高效液相色谱参考条件如下：

a）色谱柱：C

b）流动相：流动相 A：（ A.2.4）；流动相B：（ A.2.5）.梯度洗脱，洗脱梯度见表A.1；

c）流速：1.0 mL/min；

d）柱温：22 ℃；

e）进样体积：20 μL；

f）检测波长：280 nm。

A.4.2.2 标准系列溶液和试样溶液的测定。

在仪器的最佳条件下，分别上机测定标准系列溶液和试样溶液。以枯草三十七肽色谱峰面积为横坐标，标准系列溶液的浓度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数不低于0.995。枯草三十七肽的液相色谱图见附录B。

A.5 试验数据处理。

发酵液中枯草三十七肽含量由标准曲线计算的试样溶液中枯草三十七肽的浓度×稀释倍数，单位为微克每毫升（μg/mL）即毫克每升（mg/L）。

测定结果用平行测定值的算数平均值表示。

A.6 精密度。

在重复性条件下，两次独立测定结果的绝对差值不大于该算术平均值的10.0 %。如图6所示。

本发明进行分段流加补料的技术效果在于：在产枯草三十七肽前期分段补料，可以避免枯草芽孢杆菌过度生长，减少分泌其他代谢产物；在产枯草三十七肽中期与末期分段补料可以满足枯草芽孢杆菌产枯草三十七肽的营养需要，枯草三十七肽的合成与发酵液中碳源和多种金属离子有直接关系，Mg

采用本发明的方法进行枯草三十七肽（Subl ancin）的生产，可以提高发酵液中枯草三十七肽的含量，缩短发酵时间，提高生产效率。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型。包括各个具体技术特征以任何的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。但这些简单变型和组合同样应视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。